麻竹EST序列中GDC-P蛋白基因的预测及其翻译多肽的分析

麻竹EST序列中GDC-P蛋白基因的预测及其翻译多肽的分析
丁伟航
（生技091，林业与生物技术学院 200901180226）
摘要：甘氨酸脱羧酶复合体（GDC）是在光呼吸中起着重要作用的酶体，存在于所有光合作用植物中。

通过对麻竹的EST序列进行拼接，得到了726条contig片段，然后对这726条片段进行blast。

结果发现，其中有一条长为966bp的片段与粳稻中的甘氨酸脱羧酶P蛋白亚基的mRNA序列有93%的相似性。

其ORF的翻译产物与麦类作物的GDC-P亚基有93%的相似性。

通过对这段多肽序列进行分析发现：这段序列是P蛋白靠近3' 端的一段序列，无跨膜结构域，含有GDC-PD的结构域。

关键词：EST；GDC；麻竹
Abstract. Glycine decarboxylase complex（GDC）is one of the important enzyme during the photorespiratory cycle, which found in plants processing photosynthesis. De novo assembly of short reads (EST) of Ma bamboo shows, 726 contigs finally formed. And then run BLAST for these contigs in NCBI, the result is that the DNA sequence, which contain 966 base pairs, is similar to the gene of P protein of Glycine decarboxylase complex from Oryza sativa Indica Group (with the identity of 93 percent ). And the protein translated by its ORF is similar to GDC-P protein of x Tritordeum sp. (with the identity of 93 percent). Analyzing the putative protein by means of the method of bioinformatics, we found that protein sequence show high identity with the region of GDC-P near the C-terminal, no transmembrane domain be found, but contain the domain of GDC-P.
Key word. EST, GDC, Dendroalamus latiftorus
甘氨酸脱羧酶是复合体（GDC）存在于线粒体基质，与SHMT(丝氨酸羟甲基转移酶)通过四氢叶酸盐相联系[1]，是植物光呼吸的C2循环的重要酶体。

GDC包含P、H、T、L四个蛋白亚基，其中P蛋白脱去甘氨酸上的羧基后，将其转移给H蛋白[1]。

研究这个蛋白除了对研究植物的生长有重要意义，还对植物病害的防治也有一定意义，如燕麦的枯萎病是真菌（Cochliobolus victoriae）引起的[2]，而这种真菌所产生的毒素（victorin），正是结合在燕麦的GDC-P蛋白上，影响P蛋白的活性从而导致植株的枯萎[3]。

由于麻竹的基因组还未被测序，因此我们对现有的9574条麻竹序列进行生物信息学分析，一方面希望能注释这些序列，找到我们感兴趣的基因，为将来的研究提供思路，另一方面也希望发现能发现一些未知的基因，丰富对基因功能的研究。

1.材料与方法
1.1 contig的获得
因为EST序列存在冗余量大的缺点，所以必须先通过聚类拼接的方法来去除冗余，得到若干条conitg，这样可以减轻BLAST工作的负担。

在NCBI上以“Dendrocalamus latiflorus Munro”为关键词检索麻竹的EST序列，并打包下载。

然后用CLC软件对上传至NCBI 的全部麻竹EST序列进行拼接。

1.2 基因功能及其ORF的预测
然后对长度在500bp以上的contig序列进行在线BLAST，寻找template基因，并根据template基因的功能注释来预测该基因片段的功能，并从中找到所需的感兴趣的基因。

然后用CLC预测该contig的ORF，并按所有预测出的ORF翻译出蛋白，进行blastp，辅以blastx，以验证这些ORF的可靠性，选择其中最可靠的一条ORF。

1.3 蛋白质的一级结构分析及跨膜结构分析
以最可靠的ORF翻译出的多肽作为研究对象，利用PortParam （/tools/protparam.html）在线工具，对其氨基酸序列残基数目、组成、相对分子质量、理论等电点及稳定性等理化性质进行分析；利用PortScale （/tools/protscale.html）在线工具，对其疏水性进行分析；利用TMHMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）Server 2.0，对其进行跨膜区分析。

1.4 蛋白质的二级结构与三级结构预测
利用SSPro4.0（/sspro4.html）对其二级结构进行在线预测；利用swiss-model(/)进行同源建模，以预测其三级结构。

1.5 信号肽分析及亚细胞定位
利用SignalP 3.0 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测该多肽的信号肽。

利用TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）对其亚细胞定位进行预测。

1.6 蛋白质的结构域分析及motif搜索
利用SMART服务器（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析该多肽的结构功能域。

利用PROSITE数据库（/prosite）检索motif。

1.7 建立进化树
用template基因所编码的蛋白的名称在NCBI上搜索该蛋白质。

在尽量大的物种范围内选取同科、同属以及其它科属的物种的相应的蛋白质序列，并将其下载到本地。

先用CLC 对其进行多序列比对，再用MEGA软件重建进化树。

2 结果与分析
2.1 麻竹contig片段及GDC-P基因序列
在NCBI上通过对麻竹EST序列的搜索，得到了9574条麻竹序列，然后全部下载到本地。

利用CLC对其进行批量聚类拼接后，得到了726条contig片段，其长度在221bp-2063bp 不等。

最高丰度的contig包含280条EST序列，最低丰度的contig只含2条EST序列。

一般丰度越高的contig多为持家基因、线粒体或叶绿体的序列，丰度越低的contig多为调控基因等一些非维持细胞生命活动所必需的基因。

然后通过对长度在400以上，且丰度较高的contig的Blast分析，找到一条contig 序列（contig 687）与其它物种已知的GDC-P基因相似度最高（详见图1）。

其与粳稻“日本晴”中的甘氨酸脱羧酶P蛋白亚基的mRNA（全长CDS）序列有93%的相似性，该基因在NCBI 上的登录号为AY346327；此外还跟燕麦的victorin结合蛋白（即一种P蛋白）mRNA（全长CDS）序列有93%的相似性。

Contig 687长度为966bp，由8条EST序列拼接而成，它们在NCBI上的登录号依次为JK008426.1、JK016935.1、JK012035.1、JK017274.1、JK014557.1、JK008289.1、JK013195.1和JK012568.1。

图1 contig 687的blast部分结果
注：用CLC软件自带的NCBI BLAST工具按nr条件进行Blast的结果（已按E值大小排序）2.2 ORF预测结果图3 ORF翻译结果
通过CLC自带的ORF预测工具的预测，
只预测到一条ORF（见图2）。

该ORF的范围
为3-965号碱基，5′至3′方向为965至3
号碱基，长度为963bp，起始碱基为CCT。

这
说明这条contig可能是完整基因中的一个
片段，并不包含其实密码子。

然后通过blastp
验证，结果发现由该ORF翻译的多肽与其它
物种已知的GDC-P蛋白有很高的相似性，且
比对结果中，相似区域都在这些蛋白质序列
的中间或靠近3′端部位。

最后再辅以
contig 687的blastX，结果也表明，按-2
阅读框翻译的蛋白能比对出结果，即与该ORF
的阅读框架一致，且与GDC-P蛋白相似性最
高。

综上分析，这条ORF可靠性较高。

其翻
译结果见图3。

2.3 一级结构分析及跨膜域预测结果
由PortParam分析结果可知，该多肽的
分子质量约为34kDa、理论等电点pI为6.20，
总共包括4766，分子式为C1521H2365N415O445S20；
在组成该多肽的20种氨基酸中，甘氨酸
（Gly）所占的比例最高，达到11.2%，而色
氨酸（Trp）所占的比例最低，为0.3%；该
多肽的不稳定指数为41.09，脂肪指数为
82.74，根据Guruprasad方法表明该多肽不
稳定。

这是由于该多肽不是完整的蛋白，只是部分蛋白序列。

TMHMM2.0预测结果显示，该多肽的1～321位碱基位于细胞膜外，即无跨膜结构域（如图4所示），这与GDC-P为非跨膜蛋白的性质相吻合。

图2 ORF预测结果
注：用CLC自带的ORF预测工具按AUG起始，可允许为完整序列的片段的条件预测
图4 使用TMHMM软件对该多肽的跨膜区分析结果
2.4 二级结构分析和三级结构预测结果
根据SSpro 4.0 预测结果可知，该多肽的二级结构组分中，α-螺旋（H）占40.5%，β-折叠（E）占15.0%，属于α/β型蛋白，其中较长的α-螺旋有5个，较长的β-折叠有7个。

用SWISS-MODEL对该多肽进行同源建模，该三维结构与PDB数据库中的1WYU蛋白（GDC-P）的结构一致，其结果如图5-1、5-2、5-3所示：
图5-1 预测多肽的三级结构图图5-2 1WYU三级结构图
红色为α-螺旋，蓝色为β-折叠，绿色为无规则卷曲
从图5-1可以看出9条β-折叠，4条较长的α-螺旋,
与预测出的二级结构中这两者的数量相符。

且该序列
与template蛋白的相似性为38.32%，建模的综合得
分为0.57，该三级结构亦较为可信。

2.5 信号肽分析和亚细胞定位预测结果
经SignalP 3.0预测结果可知，该多肽无信号肽，
这与之前预测它属于一个完整蛋白的片段相符，且该
片段至少不包含完整的5′端，因此无信号肽被发现。

由于未包含信号肽序列，故不能直接对其进行亚细胞
定位。

为了预测其可能的位置，遂对与其同源性最高
的近源物种的同种蛋白进行亚细胞定位，来大致推测
该蛋白在细胞中的位置。

为此，根据先前Blastp的
结果，选取水稻、燕麦和麦类作物的GDC-P mRNA全
长CDS，分别对它们进行亚细胞定位，结果发现，这些蛋白都定位在线粒体。

所以可以推测，该多肽的完整蛋白是定位在线粒体中的，不过仍需进一步的实验验证。

（详见图6）
图5-3 预测多肽的三级结构
图6 TargetP 预测结果
注：从上至下依次为阿拉伯芥、麦类作物、水稻和燕麦的GDC-P亚细胞定位结果（cTP、mTP 和SP分别代表叶绿体导肽、线粒体导肽和信号肽；C、M和S则分别代表叶绿体、线粒体和
分泌通路）
2.6 结构域和motif分析结果
SMART分析结果显示，该段多肽的第14～195位序列与Beta_elim_lyase结构功能域相似，第21～217位序列与GDC-P结构域相似，第51～222位序列与Aminotran_5结构域相似。

Beta_elim_lyase多见于TNase、TPL等一些氨基酸降解酶当中，包括GDC-P；Aminotran _5则是PLP（磷酸吡哆醛依赖的）酶共有的结构域，包括氨基酸转移酶家族，包含氨基酸结合位点，且已有体外实验的研究表明，GDC-P上就包含PLP辅因子，用于结合Gly，并使其释放CO2[4]。

而GDC-P结构域则是GDC-P家族成员所共有的结构域。

并且该多肽上与这三个结构域相似的范围几乎重合，因此可以认为，这条多肽包含了，至少是部分包含了P蛋白的甘氨酸结合位点。

用InterProScan检索，也得到了类似结果，如图7所示。

不过未搜索到典型的motif。

图7 InterProScan检索结果
2.7多序列比对结果及系统发育树
选取阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa Indica Group）、麦类作物（x Tritordeum sp.）、燕麦（Avena sativa）、截形苜蓿（Medicago truncatula）、美洲山杨木（Populus tremuloides）、黄顶菊（Flaveria pringlei）、Collimonas fungivorans、Pseudogulbenkiania、Candidatus Nitrospira defluvii、Vibrio vulnificus、Salmonella enterica、Leptospira biflexa、Crocosphaera watsonii、人（Homo sapiens）、Flavobacteriaceae和Taylorella equigenitalis用于和预测多肽进行多序列比对。

其比对结果如图8所示：
图8 CLC的多序列比对结果
注：本图只给出含麻竹预测多肽序列区段的比对结果
从上图可以看出：水稻、燕麦、阿拉伯芥和麦类作物的相似性较高，因此亲缘关系较近，与细菌和人的相似性较低，因此亲缘关系较低。

需要说明的是，除植物外，其它物种选取的都是甘氨酸降解蛋白家族成员的蛋白质序列。

然后经过MEGA5.0重建进化树，得到的结果如图9所示。

从中可以看出，在GDC-P蛋白家族中，水稻与麻竹的亲缘关系最近，其次与燕麦等麦类作物的亲缘关系相近。

图9 使用MEGA 5.0建的进化树
注：用除权配对法重建的进化树
3.结论
GDC-P基因在禾本科中的物种间十分保守，且该contig仅为靠近C端部分序列。

所以要通过RACE技术获得完整的cDNA序列，才能对其进行进一步的研究和分析。

通过仅有序列的分析，可以知道该多肽是GDC-P蛋白的一部分，且包含了部分的P蛋白功能位点。

不过其正确性仍需通过进一步的实验验证。

参考文献
1. Douce R, Bourguignon J, Neuburger M, Rébeillé F (2001) The glycine decarboxylase system: a
fascinating complex. Trends in Plant Science 6: 167-176.
2. Akimitsu K, Hart LP, Walton JD (1993) Density Gradient Study of Victorin-Binding Proteins in Oat
(Avena sativa) Cells. Plant Physiol 103: 67-72.
3. Navarre DA, Wolpert TJ (1995) Inhibition of the glycine decarboxylase multienzyme complex by the
host-selective toxin victorin. Plant Cell 7: 463-471.
4. Tcherkez G (2006) Viewpoint: How large is the carbon isotope fractionation of the photorespiratory
enzyme glycine decarboxylase? Functional Plant Biology 33: 911.。