介导的高效克隆系统的建立及载体重建ppt课件

pcDNA6-CS pcDNA6-N-Flag pcDNA6-N-HA pcDNA6-N-Myc pcDNA6-C-Flag pcDNA6-C-HA pcDNA6-C-Myc
pBOB-CS pBOB-N-Flag pBOB-N-HA pBOB-N-Myc pBOB-C-Flag pBOB-C-HA pBOB-C-Myc
2. 4℃ 下反应1h； 3. 保证目的片段和载体的浓度在25-50ng之间；
载体重建
• pBKS • pcDNA3.1 • pcDNA6 • pBOB-CMV
通用序列：（No-tag）
Kpn I Cla I EcoR I EcoR V Bgl II BamH I Hpa I GGT ACC ATC GAT GAA TTC GAT ATC AGA TCT GGA TCC GTT AAC
N-terminal
Stu I Xba I Xho I Hind III Sma I
Sal I
AGG CCT TCT AGA CTC GAG AAG CTT CCC GGG TAG GTC GAC GAG CTC
C-terminal
Sac I
经改造的载体都带上了共有的序列
我们所获得的带通用序列的载体：
仅需要用同一对引物对目的基因进行PCR即可同 时将其接进不同的载体，并带上不同的tag
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2019/5/7
可编辑
Exo III 介导的LIC高效克隆系统 的建立及载体重建
答辩人：梁耀极 导 师：韩家淮
•L I C背景 •总 结
一、L I C背景
经典连接克隆方法的极限：
1. 长片段进大载体难度大； 2. 酶切位点有限，受酶切位点限制大。
L I C
Ligation Independent Cloning
条件优化一
Amount of clo百度文库es(cfu)
Time cause for the Exo III(20units) in 4℃:
800
700
60, 675
600
500
400
300
200
100
0
0
100
200
300
400
500
600
Exo III processing time(min)
4℃,60 minutes
pBKS-CS pBKS-N- Flag pBKS-N-HA pBKS-N-Myc pBKS-C-Flag pBKS-C-HA pBKS-C-Myc
pcDNA3.1-CS pcDNA3.1-N-Fla pcDNA3.1-N-HA pcDNA3.1-N-Myc pcDNA3.1-C-Flag pcDNA3.1-C-HA pcDNA3.1-C-Myc
L I C 原理
带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能被 有效地修复
载体和目的片段间，只要带有足够长的同源
粘性末端（>8bp），经退火，转化E.coil.
即可获得完整的质粒DNA
如何获得粘性末端 如何获得同源序列
获得粘性末端
ExoIII 全名 Exonuclease III(核酸外切 酶III) ，其具有3’=>5’的外切酶活性
2019/5/7
可编辑
用ExoIII进行处理，能够达到高效克隆的目的
PET 28a 100ng 4ul Gene-A3 100ng 1ul 10ⅹExo Ⅲbuffer 1ul Ddw
+Exo III 20units 室温 5min
转化、涂板 15h
5 个克隆
4ul
寻求适合的条件来延长ExoIII处理的时间
条件优化二
Amount of clones(cfu)
DNA concentration ladder:
700
600
25, 629
500
400
300
200
100
0
0
20
40
60
80
100
120
DNA concentration(ng)
25-50ng 载体和片段
最高效的克隆条件
1. 用ExoIII（20units）处理含目的片段和载体 的反应体系；
获得5'粘性末端
获得同源序列
用带同源序列的引物对目的基因进行扩增， 即可 获得带同源序列的目的片段和载体。
Vector
Gene
引物
Gene
我们最关注的问题是： 采用ExoIII是否能进行高效的克隆？
二、实验过程
ExoIII的验证 条件的优化和系 统的建立 载体重建
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