小鼠脾细胞悬液制备复习过程

脾细胞分离红细胞裂解液配制

1.小鼠脾细胞的制备：
Balb/c小鼠摘眼球放血，处死，75％浸泡消毒2~3min
↓
超净台内解剖、取脾，剪碎
↓
于200目筛网中研磨过筛，小平皿收集（小皿放约5ml 20%血清的1640）
↓
移至离心管中，800rpm，离心5min，弃上清
↓
加入5ml红细胞裂解液，吹打均匀，静置3～4min
↓
1000rpm离心5min，弃上清，少量RPMI 1640洗涤2～3遍
↓
加入2ml RPMI 1640（含10％FBS），吹打均匀，计数
红细胞裂解液配方：
NH4Cl: 0.747g
Tris：0.26g
定容100ml
PH=7.4
0.22um的滤膜抽滤除菌。

注：红细胞裂解液可以从冰箱拿直接出来用，预冷的红细胞裂解液加到细胞中后可以在冰上放置1min左右，裂解更充分些。

我做实验时，一般红细胞裂解液加完离心后，只用1640洗一次，一只小鼠的脾脏细胞最后悬浮于3ml 1640中，稀释50倍计数，即：100ul台盼蓝+880ul 1640（或PBS）+20ul 细胞。

那个问题等师兄过来了帮你问一下。

小鼠脾脏中分离淋巴细胞

从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。

小鼠脾细胞培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

单抗制备步骤及注意事项

单抗制备步骤及注意事项脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。

无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。

2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。

3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。

再以同样的方法洗涤离心一次。

4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。

注意事项：•免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B 淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。

2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。

3.制备细胞悬液，计活细胞数。

4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。

注意事项：•常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。

•骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。

•骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。

小牛血清的浓度一般在10～20%。

细胞的最大密度不得超过106个/mL。

•一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞的倍增时间为16～20小时。

•一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。

•保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。

细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。

2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。

脾细胞提取实验报告

一、实验目的1. 学习掌握脾细胞提取的基本原理和方法。

2. 熟悉无菌操作流程，提高实验操作技能。

3. 了解脾细胞在免疫学研究中的应用。

二、实验原理脾脏是人体重要的免疫器官，其中含有丰富的免疫细胞，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞等。

脾细胞提取实验旨在从脾脏中获取这些免疫细胞，为后续的免疫学研究和实验提供材料。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：成年小鼠、胰蛋白酶、Hanks平衡盐溶液（HBSS）、FBS、离心管、吸管、解剖显微镜、手术刀、镊子、剪刀、无菌操作台等。

2. 实验仪器：细胞培养箱、低温离心机、细胞计数仪、显微镜等。

四、实验步骤1. 小鼠麻醉与解剖- 将小鼠置于解剖显微镜下，用麻醉剂将其麻醉。

- 小心切开小鼠腹部皮肤，暴露脾脏。

- 使用手术刀将脾脏从体内取出。

2. 脾细胞制备- 将脾脏置于Hanks平衡盐溶液中，轻轻漂洗去除杂质。

- 使用剪刀将脾脏剪成小块，放入装有胰蛋白酶的离心管中。

- 将离心管置于37℃水浴中消化10-15分钟，期间轻轻摇动。

- 停止消化后，用吸管将消化后的脾细胞悬液转移至新的离心管中。

- 1000g离心5分钟，弃去上清液。

- 加入适量的FBS，重悬细胞，制成脾细胞悬液。

3. 细胞计数与纯度鉴定- 使用细胞计数仪对脾细胞悬液进行计数，计算细胞总数。

- 取少量脾细胞悬液，进行染色（如台盼蓝染色），在显微镜下观察细胞活力和纯度。

4. 细胞培养- 将脾细胞悬液接种于细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养。

- 定期观察细胞生长情况，记录细胞生长曲线。

五、实验结果1. 脾细胞悬液经离心后，上清液清亮，细胞沉底。

2. 细胞计数仪显示细胞总数为1.5×10^7个。

3. 台盼蓝染色结果显示细胞活力约为90%。

4. 细胞培养过程中，细胞生长良好，呈典型的淋巴细胞形态。

六、实验讨论1. 脾细胞提取实验过程中，无菌操作至关重要，应严格遵循无菌操作规程。

2. 胰蛋白酶消化脾细胞时，消化时间不宜过长，以免损伤细胞。

脾脏单个核细胞的制备

脾脏单个核细胞的制备: 将5 只小鼠断颈椎处死, 无菌取出脾脏, 分别剪碎, 置200 目无菌尼龙网上, 分次滴入4~ 5 ml RP MI1640 培养液, 轻轻研磨脾脏, 直到脾脏变白; 收集细胞悬液( 由于红细胞所占比例很低且对实验影响不大, 故无需作红细胞裂解处理) , 1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5 min, 弃上清; 加入2 ml pH7. 4 的PBS, 混匀后1 000 r/ min( 离心半径17. 5 cm) 离心5min, 弃上清; 加入4 ml RPMI1640 培养液, 混匀, 用RPMI1640 培养液稀释200 倍后滴加在细胞计数板上进行细胞计数, 根据计数结果用RPMI1640 将细胞悬液调成2 × 106 / 300 µl 的浓度。

《流式细胞术检测小鼠脾细胞内细胞因子刺激方案的筛选》单细胞悬液的制备：将大鼠颈椎脱位处死后, 置70%乙醇中浸泡5 m in, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 除掉结缔组织, 用生理盐水清洗3次。

加入2 mL RPM I- 1640完全培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm 1 mm 1 mm 碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 经H anks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10% 小牛血清的RPM I- 1640 培养液。

台盼蓝染色, 计数活细胞在95%以上, 调整细胞数至5×1010 cells /L。

《粗江蓠多糖对大鼠淋巴细胞周期的影响》制备脾细胞悬液脾淋巴细胞的获取:手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械,300 目尼龙网等须经消毒处理; 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用7 5 % 乙醇浸泡小鼠10-15min 。

沿腹腔中线剪开小鼠胸腔, 取出脾脏置于培养皿中, 剪去脂肪和筋膜组织, 用R PMI-1640培养液漂洗。

粗剪成小块, 用注射器芯轻轻挤压, 加人基础培养液, 混悬, 用300目尼龙网过滤到玻璃离心管中, 再加人基础培养液冲洗网上剩余组织细胞。

脾细胞的提取

脾细胞的提取
1、用颈椎脱臼法处死小鼠，75%的酒精浸泡2-3分钟。

2、将小鼠移入超净工作台内，无菌条件下，以仰卧位固定在解剖盘上。

3、用眼科镊子夹起腹股沟中线处皮肤，用眼科剪做一横切口。

用镊子捏住切口
两端的皮肤朝着小鼠的尾部和头部纵向撕开皮肤，暴露腹腔膜壁。

4、剪开腹腔壁膜，用镊子夹出脾脏，并用剪子剪去与其相连的组织，将脾脏放入无菌PBS中。

5、用注射器内芯或者研棒研磨脾脏，或用2ml注射器赶出淋巴细胞，过100目
筛网，收集分离的脾细胞悬液，1200r/min离心5min，弃上清。

6、弹散细胞团，加红细胞裂解液5mL左右，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细
胞完全破碎，加大量PBS，1200r/min离心5min，弃上清。

7、加入PBS，混匀，再过100目筛网，1200r/min离心5min。

8、倒掉上清液，加入1640培养液，用吸管吹打均匀，计数，接种。

附：红细胞裂解液（ACK）的配制（500ml）
1．NH4Cl 3.735g。

2．Tris-base 1.3g。

3．用HCl调pH值至7.2。

4．过0.22 um 滤膜。

实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测

实验三小鼠脾细胞的分离制备及其活力检测
实验二小鼠脾细胞的分离制备及其
活力检测
材料
1、器材：离心机、手术剪、镊子、平皿、10ml离心管，5ml 注射器等
2、动物：昆明小鼠（25g左右，雄性）
3、试剂：碘伏、红细胞裂解液、Hank’s 液、0.4%台盼兰染液
方法
1、取小鼠一只，置于蜡盘上，颈椎脱臼处死，用碘伏消毒小鼠腹部后，打开腹腔，取出脾，去除周围的结缔组织，放入含有5ml Hank’s的平皿中。

2、用眼科剪将脾一端剪一小口后，将含有5ml Hank’s液的注射器从脾的另一端刺入脾，缓缓注入Hank’s液，即可见脾细胞悬液流入平皿，注意在注射Hank＇s液同时不断转动针头方向，直至脾变苍白为止。

3、将平皿倾斜静置10 min后，用干净吸管吸取细胞液到10ml 离心管中，平衡后，离心（1500rpm 10min），将
离心管盖子打开，快速弃上清液，往管底的细胞中加入1ml的红细胞裂解液，充分混匀20秒，立即加入9ml的Hank’s液，混匀，离心（1500rpm 10min），弃上清，将细胞定容到1ml。

4、吸取0.1ml的细胞悬液到干净的试管中，加入等量的0.4%台盼兰染液，混匀，吸取1滴的细胞液到玻片上，加上盖片，显微镜观察：死亡细胞染成蓝色，活细胞不染色。

正常情况下，活细胞数应达到95%以上。

动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞

姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。

细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。

培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。

细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。

2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。

原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。

小鼠脾细胞悬液制备

小鼠脾细胞悬液制备
一、小鼠眼球取血（眼静脉取血）
二、小鼠脾细胞悬液的制备:
1．小鼠颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上；
2．在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；
3．在脾脏下侧提起腹膜,剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；
4．A：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；
B：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（100或200目)上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液；
C：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎,加入400 u/ml 胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

5、脾脏研磨：轻轻研压（顺同一方向），用吸管吸取脾细胞悬液，放入试管中。

6、镜下细胞计数：40倍镜头，观察脾细胞。

7、试取胸腺
注：一般6—8周龄小鼠，根据品系不同，可得5-20×107细胞/只。

2．手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械,在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌,此法较为简便。

小鼠心肝脾肺肾单细胞悬液制备

小鼠心肝脾肺肾单细胞悬液制备
小鼠心肝脾肺肾单细胞悬液的制备步骤如下：
1. 将新鲜分离的小鼠心肝脾肺肾组织放入盛有适量（例如3ml）RPMT-5或DMEM-5完全培养基的60mmX15mm培养皿中，每个器官使用一个培养皿。

用剪刀将器官剪碎。

2. 用6ml注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压，直到仅剩纤维组织。

3. 用装有19G针头的6ml注射器将组织悬液反复抽吸数次，以进一步粉碎组织团块。

4. 将细胞悬液通过200μm尼龙滤网滤入离心管中。

用约4ml完全培养基洗一次培养皿，如需要则重复一次，之后将洗液通过滤网加入离心管中。

5. 在离心机中以1000r/min (200g) 离心10min后弃上清。

用20ml 完全培养基将沉淀重悬后离心，再以适量培养基重悬以便计数。

6. 如果细胞不能立即处理，可以将细胞悬液置于冰块中，以保持细胞活力。

请注意，上述步骤是一个基本的单细胞悬液制备流程，具体的实验条件和操作步骤可能会因实验目的、组织类型和实验条件的不同而有所变化。

因此，在实际操作中，请根据具体情况进行必要的调整和优化。

同时，确保在进行任何实验之前，都充分理解实验步骤和潜在风险，并采取适当的安全措施。

体外抗体形成细胞检查法(溶血空斑实验 PFC)(Plaque forming ce

体外抗体形成细胞检查法（溶血空斑实验 PFC）(Plaque forming cePFC测定技术又称溶血空斑试验。

是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。

自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展。

特别是间接溶血空斑测定法的建立，更扩大了本实验的应用范围。

它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的抗体形成细胞。

它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标。

溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。

前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞。

因为活化补体的能力强，可以不必另加抗Ig 试剂（显斑剂），也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定。

至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯度的抗血清（系指用高浓度的抗原制备的抗血清）再加补体才能出现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。

小鼠脾PFC测定方法，经多次改进使本法的敏感度不断提高。

目前所用的方法分为：琼脂固相法和小室液相法。

其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下，使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。

一琼脂固相法[实验材料]（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）（2）1毫升注射器和青霉素小瓶（3）水浴(47-49℃ )（4）Hanks'液（5）胎牛血清(56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收)（6）琼脂或琼脂糖(表层基0.7%;底层基1.4%;用Hanks'液配制 ) （7）右旋糖酐(DEAE-dxtran分子量50万,用蒸馏水配置10毫克/毫升). （8）抗-Ig血清(测定间接空斑用)（9）20%绵羊红细胞悬液(Hanks'液配制)（10）补体:新鲜豚鼠血清(用前经绵羊红细胞吸收)[试验方法]（1）将溶化的底层琼脂倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,备用。

小鼠脾脏细胞悬液制备流程

小鼠脾脏细胞悬液制备流程
1. 脱颈处死小鼠，腹部朝上正体位暴露小鼠右侧腹部。

2. 75％乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。

3. 将脾脏放入预先放置好cell strainer（FALCON，352350）并已加入5ml 无菌PBS的六孔板或培养皿中。

4. 用无菌注射器柄充分研磨脾脏。

5. 弃掉cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌15 ml离心管中，于4℃ 400g，离心5 min。

注：一旦取出脾脏，请置于冰上操作。

6. 将第5步离心后弃上清的脾脏细胞用5 ml无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解
5 min。

注：ACK裂解液配方如下表，配好之后用0.22 μm的滤膜过滤，4℃保存不超过1月
配制 500 ml 1´ACK buffer
NH₄Cl 4.1 g
KHCO30.5 g
0.5 M EDTA-2Na100 ml
7. 裂解结束后加入10 ml无菌PBS终止裂解反应，于4℃ 400g离心5 min。

8. 弃上清，用10 ml无菌PBS洗一次，弃上清后直接加入培养基重悬计数，一只脾脏可得3-10
´107个细胞。

注：如果要进行下一步的分离CD4+T细胞操作，请直接按照说明书将细胞重悬在合适体积的PBS中。

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】A. 细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。

动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。

从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。

当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2 或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。

传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。

高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。

但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。

被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。

因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。

细胞培养的意义: 具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。

细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。

脾细胞的获取

脾细胞的获取最后一次免疫后10天，处死小鼠1）小鼠脱颈臼处死，在75%酒精中浸泡1~2分钟2）剪开左侧腹胸交接部皮肤和肌肉，暴露脾脏，用小镊子将脾镊起，剪下，除去非脾组织，在无血清培养基中洗一下。

置于200目筛网上，筛网置于盛在12ml无血清RPMI-1640的6ml平皿上。

3）用注射器研磨脾脏，使细胞通过筛网，落于平皿中的培养基中。

4）将细胞悬液转入无菌离心管中，1000-2000rpm，3’，室温。

5）弃上清，打散细胞后加入5ml 红细胞裂解液, 室温放置6’6）加5ml PBS,离心，弃上清，打散细胞。

7）用7 ml无血清培养基洗一次，再用7 ml有血清培养基洗一次8）将细胞体积调至5ml , 稀释100倍计数，调成2*106/ml，接种于24孔板。

每种细胞分别接终于3个孔中，第一个孔1ml，用于细胞计数，第二个孔1ml,用于第二天加多肽，第三个孔0.5ml，用于第二天加入ELISPOT中。

9）剩余的细胞，每种分成两管冻存。

细胞的冻存：介于DMSO对细胞有刺激和伤害作用，故为提高冻存细胞的存活率，在细胞冻存过程中应注意两个原则：1。

添加DMSO时应有少到多，由慢到快，使细胞周围的DMSO缓慢增加，2。

冻存液以及冻存管应冰水预冷。

自配的细胞冻存液：溶液Ⅰ：10mlDMSO40ml含10%FCS 的RPMI-1640培养基溶液Ⅱ：26ml FCS24ml RPMI-1640培养基用法：1. 离心细胞，弃上清。

2．取1ml溶液Ⅰ，重悬细胞。

3．取1ml溶液Ⅱ，缓慢滴入滴入前一步的溶液Ⅰ中，边滴边混匀。

4．分装入两个冻存管中，现在-80℃放置过夜，再转入液氮保存。

小鼠肠单细胞悬液的制备方法

小鼠肠单细胞悬液的制备方法小鼠肠道，哇，听上去就像是个神秘的宝藏，藏着无数的细胞、微生物和营养成分。

这些小小的细胞啊，简直像是一个个小精灵，各自忙着自己的工作。

有些在消化，有些在吸收，还有一些在保护肠道的健康。

嘿，今天就跟大家聊聊，怎么把这些小精灵从小鼠的肠道里捞出来，变成一碗香喷喷的单细胞悬液。

别担心，听起来复杂，其实简单得很，咱们一步一步来。

准备工作要做好，没错，咱们得先找到一只健康的小鼠。

记住，不要随便抓一只，得确保它是健康的，否则可就不划算了。

选好小鼠后，咱们得给它做个小手术，嘿，别紧张，只是个轻微的麻醉，让小鼠保持安静，咱们好进行下一步。

这个过程要细心，像对待宝贝一样，绝不能马虎，给小鼠打麻醉的时候，手要稳，眼要亮。

麻醉后，小鼠就像是睡着了一样，接下来就是要把它的肠道取出来了。

这可得小心翼翼，手法要柔和，像是抱着一只 fragile 的蛋。

取出肠道后，赶紧用生理盐水冲洗，确保肠道里面的杂质都给洗干净了，不然咱们的实验可就泡汤了。

冲洗的过程就像是在给小鼠洗澡，细心呵护，绝不能草率。

把肠道剪成小段，别太大，太大了处理起来可麻烦。

切得差不多后，把它们放进一个细胞悬液中，咱们要把这些小段和酶溶液混合，这样能帮助咱们把细胞给分离开来。

等个五六十分钟，让细胞们慢慢松弛，咱们就能开始摇一摇了，轻轻晃动，让细胞在溶液中跳舞，真是别有一番风味。

时间到了，咱们就得用过滤网把细胞和未消化的肠道碎片分开。

这个过程就像筛米，慢慢过滤，确保只有单细胞留在液体中。

过滤完后，得把这些细胞洗一洗，洗掉残留的酶，嘿，别让它们觉得被孤立。

洗的时候用生理盐水，越干净越好，细胞们才能健康快乐。

洗净后，得把细胞再重悬一下，让它们在新环境里安定下来。

这时候，可以用显微镜来看看，细胞们是不是活蹦乱跳的，像是一群小朋友在操场上玩耍。

看着它们生机勃勃，心里别提多高兴了。

记得这时要轻轻地搅拌，别让细胞受伤。

把这些细胞用合适的培养基保存起来，像是把小宝贝放进温暖的摇篮。

实验二__小鼠脾细胞提取及计数

实验二小鼠脾细胞提取及计数一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。

其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。

二、包被和封闭ELISA板：备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。

包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。

在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。

（1）包被ELISA板：1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老师已经配好）c.聚乙烯塑料板，微量加样器2) 操作方法a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。

（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。

老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。

2)转动旋钮，调整量取体积。

顺时针旋转增加体积，逆时针减少体积。

脾脏单细胞悬液制备

脾脏单细胞悬液制备
脾脏单细胞悬液制备是一种常用的实验方法，用于分离和检测脾脏中的单个细胞。

操作步骤如下：
1.准备器材：取一只小鼠脾脏，注射器、离心管、冷暗培养皿、离心机、搅拌器等。

2.将小鼠脾脏取出，放入冷PBS缓冲液中，将其清洗干净。

3.将脾脏组织放在冷暗培养皿中，用注射器注入10毫升消化液，搅拌10分钟。

4.将消化液滤过40μm滤网，离心10分钟。

5.去除上清液，用10毫升PBS缓冲液重悬细胞，计数并存放于离心管中。

6.将细胞进行下一步实验操作。

注意事项：为避免对细胞质量的影响，操作过程中保持所有物品的清洁度和冷却度，并严格控制操作时间。

Mouse 脾淋巴细胞IL-4的刺激

天津三箭生物技术有限公司Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.版本号01-20111230Mouse 脾淋巴细胞IL-4的刺激（1）小鼠脾淋巴细胞的制备1）无菌取Balb/c小鼠脾脏，在60mm培养皿中放入5ml PBS,用镊子把铜网固定在皿上，用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使分散的单细胞透过铜网悬于无菌PBS 中。

2）将脾细胞悬液转移到15ml离心管中，加满PBS,800rpm 离心5min。

3）弃上清，加入一定量的红细胞裂解液，室温裂解5min，加1/10 体积的胎牛血清终止裂解4）800rpm 离心5min，去上清。

5）用含有相应量10%胎牛血清和1%双抗的1640培养基重悬细胞。

并细胞计数，调整细胞浓度为2.5x106ml的悬液。

（2）IL-4细胞因子的刺激1）用50ul的anti-mouse CD3(10μg/ml) 包被96孔板，37度2小时，4度过夜2）吸取包被液，加200ul/含有刺激物的细胞悬液，培养基中37℃，5% CO2饱和95%湿度条件下培养48h。

刺激物为：anti-mouse CD28 1μg/mlanti-mouseIFNγ10μg/ml重组小鼠的IL-2 10ng/ml重组小鼠的IL-4 40ng/ml3）更换培养基，在加入重组小鼠的IL-2 (终浓度10ng/ml)和重组小鼠的IL-4(终浓度40ng/ml）的培养基中37℃，5% CO2饱和95%湿度条件下继续培养三天。

4）收集细胞，加入PMA（终浓度50ng/ml），Ionomycin（终浓度500ng/ml）与Golgi-stop（终浓度2ng/ml）的培养液中37℃，5% CO2饱和95%湿度条件下继续刺激培养4-6h。

（3）细胞的收集培养结束后，离心吸去上清液，用冷PBS洗涤一次（1400r/min离心7min）。

用冷PBS 悬浮细胞，进行细胞表面和胞内染色。

（4）如细胞过夜后实验，可先用2%的多聚甲醛固定后，用冷PBS洗涤一次（1400r/min 离心7min）后4度保存。