第四章 比色分析及分光光度法
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
00 生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-比色分析技术
比色分析技术分光光度法是利用单色器（主要是棱镜）获得单色光来测定物质对光吸收能力的方法。
物质对不同波长的光波具有选择吸收的特性，分光光度法就是基于物质的这种特性而建立起来的分析方法，它是光谱分析技术中最基本和最常用的方法，因其具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。
一、比色分析的基本原理比色分析技术是利用物质对光的吸收作用来对物质进行定性或定量分析的技术。
分光光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外 - 可见光分光光度法。
（一）吸光度与透光度当一束光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I 0 ，透射光强度为I ，I 和I 0 的比值称为透光度（ transmittance ，T ），即T ＝，其数值小于 1 。
T 与 100 的乘积称为百分透光度，以 %T 表示。
透光度的负对数称为吸光度 (absorbance ， A) 。
其表达式为：A ＝－LgT ＝－Lg ＝Lg（二） Lambert-Beer 定律Lambert-Beer 定律指出当一束单色的辐射能通过介质或溶液后，有一部分被吸收，其辐射能的吸收与溶液中吸收物质的浓度和溶液厚度的乘积成正比。
Lambert-Beer 定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
Lambert-Beer 定律是描述溶液吸光度同溶液浓度和溶液液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：A ＝KLC式中，A ——吸光度；K ——吸光系数；L ——溶液厚度，称为光径；C ——溶液浓度。
根据 Lambert-Beer 定律，当液层厚度单位为 cm ，浓度单位为 mol/L 时，吸光系数K 称为摩尔吸光系数（ε）。
ε的意义是：当液层厚度为 l cm ，物质浓度为 l mol/L 时，在特定波长下的吸光度值。
ε是物质的特征性常数。
在一定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。
分光光度法与比色法
1、几个概念：分光光度法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
比色法colorimetry以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。
比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。
选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。
常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。
试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。
与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。
但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。
比色分析和紫外可见分光光度法
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
分光光度比色法的原理
分光光度比色法的原理
一、物质对光的吸收
分光光度比色法的基础是物质对光的吸收。
当光线穿过物质时，物质会吸收特定波长的光线，导致光的强度减弱。
物质对光的吸收程度与物质的浓度成正比，这是分光光度法进行定量分析的基础。
二、光的色散
光的色散是指光线通过棱镜或光栅等光学元件时，被分解成不同波长的光谱。
通过色散，我们可以将一束白光分解成不同颜色的光谱。
分光光度计利用这个原理，将物质吸收的光线分解成特定波长的光谱，从而确定物质对哪些波长的光线有吸收。
三、比色测定
比色测定是指在特定波长下测量物质对光的吸收程度。
通常，我们将待测物质与已知浓度的标准物质在相同条件下进行比色测定，然后根据标准曲线的斜率和截距计算出待测物质的浓度。
比色测定是分光光度比色法的重要步骤，通过它可以对物质进行定量分析。
四、定量分析
通过比色测定得到的数据，我们可以计算出待测物质的浓度。
在分光光度比色法中，我们通常使用标准曲线法或标准加入法来进行定量分析。
标准曲线法是通过绘制标准物质浓度与吸光度的关系曲线，然后根据待测物质的吸光度在曲线上找到对应的浓度。
标准加入法则是将已知浓度的标准物质加入待测样品中，然后根据吸光度的变化计算待测物质的浓度。
总之，分光光度比色法的原理主要包括物质对光的吸收、光的色散、比色测定和定量分析等方面。
通过这些原理的应用，我们可以快速、准确地测定物质的浓度，广泛应用于化学、生物学、医学等领域。
比色分析法和分光光法的实验操作法
所以As与Au之比值也等于两浓度之比值 即 Au Cu
As Cs Cu Au Cs
As
比色分析法和分光光法的实验操作法
利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光 度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各管的浓度（C）为横坐标， 在方格坐标纸上作图。
L 液层厚度
lg Io k c I
比色分析法和分光光法的实验操作法
分光光度法的原理
• Lambert-Beer定律
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io kcl
I
I
I
公式的意义：
当I I0时，lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸光收线；
当I＜I0时，lg
I0 I
值大，表示溶液吸收线光较多；
Akcl
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线乎几被溶液完全吸收，溶即液不透光。 I
由此可见，lg I0 表示溶液对光吸收的度程，称作吸光度a（bsorbanc）e ， I
用A表示，即A lg I0 I
比色分析法和分光光法的实验操作法
It／I0 ＝ T
T （ transmittance ）称为透光度 ，表示透过光的强度是 入射光强度的百分比。
入射光
I0
反射光
吸收光
Ir Ia 比色分析法和分光光法的实验操作法
I 出射光
t
分光光度法的原理
• Lambert定律
入射光强度 I0
透光率T I I0
lg Io k l I
比色分析法和分光光法的实验操作法
《分光光度分析》第四章 分光光度法的灵敏度和选择性
当 使 用 的 滤 光 片 波 带 窄 ( 即 单 色 光 纯 度 高 ) 如 2~’2 进行测定，则物质的吸光度在A2~A之间波动， 在2~小范围较 A达最高，达最大。
高处波动，灵敏度增大(即 平均水平增高)，当在 max 处测定时， 因此选用波带宽度愈窄的单色器，灵敏度愈高
分析方法的灵敏度(包括光度反应灵敏度条件外，还取
决于样品的制备条件，干扰的影响等)。
其中最常用的是摩尔吸光系数，此方法是衡量灵
敏度的重要指标。
二. 提高分光光度法灵敏度的途径
1. 寻求高灵敏度试剂
目前大多数光度法分析法灵敏度在104数量级，因
此，还有大量的工作需要我们取寻求高灵敏度的试剂，
以提高光度分析法的灵敏度，以其达到较高的灵敏度。
b). 取代基影响有机试剂的酸性 如：C2H5OH是中性，
OH
是弱酸。
试剂的酸碱性会影响其与金属离子的反应性能。 c). 取代基可影响有机化合物的颜色 d). 取代基的空间位阻效应可提高反应的选择性 由于取代基的存在，有时会强烈干扰其他原子间的结合， 使得试剂的选择性提高了，这就是空间位阻影响。
2. 利用多元配合物选择性反应
值在(2～6)×104属于中等灵敏的分光光度法， 值在(6～10)×104属于高灵敏的分光光度法， 值大于105属于超高灵敏的分光光度法，
现在已有少数达到约106。
(2) 吸光系数 a
物理意义：相当于浓度为1g/L的待测物质溶液，在
1cm的吸收池中测得的吸光度。
A＝abc
A a bc '
5.1×104， 其中，Ag phen BPR＝2 4 1。
(2) 加入表面活性剂 在金属离子与显色剂的二元体系中加入一种表面 活性剂以形成三元络合物(三组分)提高光度分析法的 灵敏度，此法目前研究报道较多。
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
比色分析与分光光度分析
▪ 将待测组分转化为有色化合物的反应叫显色反应。
▪显色反应有配位反应和氧化还原反应 。
▪ 1.灵敏度高 因为光度法一般用于测定微量组分含量， 故通常选择灵敏度高的显色反应。生成的有色化合物摩
尔吸光系数大，灵敏度高，通常 k 值达104~105，认为 灵敏度较高。
▪ 2.选择性好 即显色剂只与一种或少数几种物质反应 而显色。
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▪ 例：已知含Fe2+浓度为1.0mg·L-1的溶液，用邻二氮菲 光度法测定铁(Fe2+与邻二氮菲反应，生成橙红色配合 物)。使用厚度为2 cm的吸收池，在波长510nm处测得 吸光度A= 0.390。计算该配合物的 摩尔吸光系数。。
▪ 解：已知铁的相对原子质量为 55.85。
由棱镜和光栅等色散元件及狭缝和透镜组成。 ▪ ①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ▪ ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ▪ ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ▪ ④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色
光聚焦至出射狭缝； ▪ ⑤出射狭缝。
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▪ c. 吸收池 ▪ 作用：用于盛放试样溶液。也叫比色皿。
▪ A = A1+A2+…+A3
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（3） 对朗伯-比尔定律的偏离
▪ 比尔定律的局限性 ▪ 非单色入射光引起的偏离 ▪ 由于溶液本身发生化学变化的原因引起的偏离
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比尔定律的局限性
▪ 通常在用分光光度法进行分析时，多采用标准工作
曲线法。即固定液层厚度、入射光的波长，测定一系 列不同浓度标准溶液的吸光度，此时A与c应成直线关 系。
比色法及分光光度法
比色法及分光光度法第一节一、填空题。
1.比色法及分光光度法同化学分析法比较具有___________、_____________、_____________、_______________等四个特点。
2.光的波长范围在___________称为可见光，波长小于__________称为紫外光，波长大于___________称为红外光。
3.____________通过三棱镜就可分解为____________________，这种现象称为光的色散。
4.光吸收程度最大外的波长叫做_____________，用_________表示。
5.同物质不同浓度的溶液λmax不变，具有____________的吸收曲线，不同物质具有__________的吸收曲线，可以此进行物质的___________。
6.物质呈现一定的颜色是由于___________。
7.同一物质不同浓度在一定波长处吸光度随浓度增加而________,这个特性可作为_________的依据。
二、选择题。
1.已知光的波长λ=800nm，则它应属于（）A、红光B、紫光C、红外光D、紫外光2.Fe（SCN）3溶液（红色）的吸收光颜色为（）A、红色B、黄色C、蓝色D、蓝绿色3.绿光的互补色为（）A、紫红色B、橙色C、绿蓝D、蓝绿色4.二苯硫腙的CCl4溶液吸收580~600nm范围的光，它显（）色。
A、绿色B、蓝色C、紫色D、黄色三、判断题。
1.白光是一种可见光。
（）2.同一物质不同浓度的有色溶液λmax不变。
（）3.在λmax处测定吸光度则灵敏度最高。
（）4.比色法及分光光度法同化学分析比较，准确度高，灵敏度低。
（）5.硫酸铜溶液因吸收了白光中的红色而呈现蓝色。
（）第二节光吸收定律一、填空题。
1.光吸收定律又称_______，它表明当_______________垂直通过______________，溶液的吸光度A与______________及____________成______。
分析比较目视比色法和分光光度法
分析比较目视比色法和分光光度法目视比色法和分光光度法都是常见的实验室酸碱测定方法之一，它们具有易操作、灵敏度高、设备简单等特点，因此普遍应用于药物和食品分析领域。
两种方法各有特点及使用区别，本文将分析比较这两种方法的不同点，为两种方法的运用提供参考。
首先，来自于二者的原理：目视比色法基于酸碱指示剂的色谱变化来合成检测酸碱度。
大多数指示剂在某一范围酸碱度值内变化色谱来表示酸碱度，由此可更直观地检测溶液的酸碱程度。
而分光光度法是认为根据不同浓度环境下有机物的光谱吸收特性，针对影响酸碱度溶液的组分，把其选定最佳紫外光谱吸收波数，结合特定的酸碱指示剂检测溶液的PH 值。
因此可以认为，目视比色法的原理是根据酸碱指出剂色谱的变化，而分光光度法是借助特定指示剂测量溶液的吸光度以及紫外吸收特性。
其次，从实际操作上来看，有些明显的区别。
使用目视比色法时，首先需要准备一些酸碱指示剂悬浮液，然后在标准玻璃比色杯内量取被检测溶液，并加入适量的指示剂，当被检测溶液与指示剂混合时，即可出现典型的比色条带，通过比较比色条带的色彩深浅，即可间接的推测出溶液的酸碱度范围。
而使用分光光度法时，首先需将酸碱指示剂浓度稳定后，再添加相应溶液，通过溶液中有机物紫外吸收比对着色体紫外吸收光谱特征，然后通过取舍紫外吸收光谱仪湿润以及滨值，来计算溶液的酸碱度。
最后，在结果稳定性方面，基于以上介绍可得知，目视比色法更加依赖于操作者的经验以及眼力，若不加以严格控制，操作者看到的酸碱度或会有较大的偏差，因此对结果的稳定性比较差。
而分光光度法更加严谨，结果准确稳定，而且分析速度很快，更适用于批量测定。
综上所述，目视比色法和分光光度法的原理基础不同，在操作上也有较大的差异，两者属于不同的测定技术，各有优势，在不同的场合会选择不同的分析方法使用，根据检测条件确定对应的检测方法，确保最终结果的精准可靠性。
第四章紫外-可见分光光度法
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
第四章 药物的含量测定方法与验证
第四章药物的含量测定方法与验证1、药物的含量：指药物中所含主成分的量，是评价药物质量的重要标准。
2、可供药物含量测定的分析方法：（1）容量分析法①优点：操作简便，结果准确，方法耐用性高。
②缺点：方法缺乏专属性。
③适用：适用于对结果准确度与精密度要求较高的样品的测定。
（2）光谱分析法①优点：简便，快速，灵敏度高，并具有一定的准确度。
②缺点：方法专属性稍差。
③适用：适用于对灵敏度要求较高、样本量较大的分析项目。
（3）色谱分析法①优点：高灵敏度与高专属性，并具有一定的准确度。
②缺点：结果计算需要对照品。
③适用：适用于对方法的专属性与灵敏度要求较高的复杂样品的含量测定。
3、为确保分析结果的可靠性，要求分析方法应准确、稳定、耐用。
4、验证内容包括：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
§4-1 定量分析方法的分类与特点一、容量分析法容量分析法：也称滴定法。
是将已知浓度的滴定液（标准物质溶液）由滴定管滴加到被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（通过适当方法指示），然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测药物的含量。
当滴定液与被测药物完全作用时，反应达到化学计量点。
在进行容量分析时，当反应达到化学计量点时应停止滴定，并准确获取滴定液被消耗的体积。
但在滴定过程中反应体系常常无外观现象的变化，必须借助适当的方法指示化学计量点的到达。
其中，最常用的方法是借助指示剂的颜色或电子设备的电流或电压变化来判断化学计量点。
指示剂的颜色或检测设备的电信号的突变点通常被称为滴定终点。
但滴定终点与滴定反应的化学计量点不一定恰好符合，二者之差被称为滴定误差。
滴定误差是容量分析法中系统误差的重要来源之一，为了减少滴定误差，要选用合适的指示剂或指示方法（如在非水溶液中常见用电位滴定法），使滴定终点尽可能的接近滴定反应的化学计量点。
（一）容量分析法的特点与适用范围1、容量分析法的特点（1）方法简便易行：本法所用仪器廉价易得，操作简便、快速。
分光光度法测定化学反应的平衡常数
分光光度法测定化学反应的平衡常
数（P71-73）
1、比色分析: 有色物质溶液颜色的深浅与浓度有关, 溶液
越浓, 颜色越深, 所以可以用比较颜色的深浅测定溶液中该有色物质的浓度, 这种测定方法叫做比色分析。
2、分光光度法: 用分光光度计进行比色分析的方法叫做
分光光度法。
吸光度: 有色溶液对光的吸收程度。
朗伯-比耳定律: 有色溶液的吸光度A与溶液中有色物质的浓度c和液层厚度b的乘积成正比——A=εbc。
PS：①当c的单位为mol/L,液层厚度单位为cm时, ε叫做摩尔吸光系数。
②若已知标准溶液中有色物质的浓度, 并测出其吸光度和未知溶液的吸光度, 就可以计算出未知溶液有色物质的浓度。
5.722型分光光度计的使用方法:
(1) 打开电源, 预热20分钟。
(2) 设定波长, 调节波长选择旋钮至447nm。
(3) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿, 并放入比色皿槽中。
(4) 按<模式>键至透射比, 将黑体（或打开样品室盖)置入光
路中, 按“0%”键, 此时显示器显示“000.0”。
(5)将参比溶液推入光路中, 按“100%”键, 此时显示器显示“100.0%”;按<模式>键至吸光度, 按0%键至显示“000.0”。
(6) 将被测样品推入光路, 读出显示器上的吸光度值。
(7)每次换样品重复(3)、(4)和(5)步操作。
6.吸量管的使用方法:
1.洗净: 自来水、去离子水、待吸液
2.吸液：左手持洗耳球, 右手拿吸量管
3.放液: 垂直、靠壁、停留15s、每次从“0”刻度放液
PS: ①计算公式自己看看教材的相应部分。
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第四章比色分析及分光光度法Colorimetric and Spectrophotometric Analysis§1 概述许多物质本身具有明显的颜色，例如KMnO4溶液显紫色，K2Cr2O7溶液显橙色等。
另外，有些物质本身并无颜色，或者颜色并不明显，可是当它们与某些化学试剂反应后，则可以生成有明显颜色的物质，例如Fe3+本身具有黄色，当与一定量的KSCN试剂反应后，生成的Fe(SCN)3具有血红色；浅蓝色的Cu2+与氨水作用后，则生成深蓝色的Cu(NH3) 42+。
当这些有色物质溶液的浓度改变时，溶液颜色的深浅液会改变。
浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。
因此，可以肯定地说，溶液颜色的深浅与有色物质的含量之间有一定的关系。
在分析化学中，把这种基于比较有色物质溶液的颜色深浅以确定物质含量的分析方法称为比色分析。
实践证明，无论物质有无颜色，当一定波长的光通过该物质的溶液中时，根据物质对光的吸收程度，也可以确定该物质的含量。
这种方法称为分光光度法。
目前的比色分析常用分光光度计将光源变为单色光，并选择对待测物质具有最大吸收的单色光进行比色测定。
比色分析法、分光光度法与前面所讲的容量分析法、重量分析法相比，具有以下优点：1.灵敏度高比色分析法和分光光度法测定物质的浓度，下限一般可以达到10-5～10-6 mol/L，可以测定相当于含量0.001～0.0001%的微量组分。
如果将被测物质加以富集，灵敏度还可以提高。
2.准确度高一般比色分析的相对误差为5～20%，分光光度法的相对误差为2～5%，其准确度虽不如容量分析及重量分析，但对微量组分来说，这个灵敏度还是可以的，因为微量组分用容量分析及重量法已无法测定，更谈不上准确了。
例如1滴KMnO4滴入100mL水中时，仍可得到明显的适于比色分析的颜色，但这一滴溶液在滴定分析中只相当于它的误差的大小，根本无法进行准确测定。
由此看来，比色法的准确度较高，可进行微量组分的分析。
3.操作简便，测定速度快比色法和分光光度法的仪器设备都简单，操作方便。
进行分析时，试样处理成溶液后，一般只经历显色和比色两个步骤，就可得出分析结果。
近年来，由于新的灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，使得一些干扰物可以不经分离，既可以进行测定。
在生产过程的分析中，一般只要几分钟就可以得出结果，对于生产中的快速分析，起了很大的作用。
4.应用广泛几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定，由此可见，比色及分光光度法应用范围之广泛。
在环境监测中，适用最多的也是分光光度法，绝大多数污染物都可以用分光光度法测定，大多数中小型实验室都可以配备分光光度计，因此不受仪器设备条件的限制。
§2 比色分析及分光光度法的基本原理一、光的基本性质光是一种电磁波，按波长的顺序排列，有：名称波长X射线0.1～10nm紫外线10～400nm可见光400～780nm红外线780nm～1000μm无线电波1～1000m二、物质的颜色与光的选择性吸收如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处，则什么颜色都看不到。
可见，物质呈现的颜色与光有着密切的关系。
一种物质呈现何种颜色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。
1.光的组成：从光本身来说，有些波长的光线，作用与人的眼睛而引起了颜色的感觉。
我们把人眼能看见的光叫做可见光。
其波长范围在400～780nm之间。
白光是由各种不同颜色的光按一定的比例混合而成的。
如果让一束白光通过三棱镜，就会分成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种颜色，每种颜色的光都具有一定的波长范围，我们把只具有一种颜色的光叫单色光，而把白光叫做复合光。
七种单色光可以混合成白光，如果把适当颜色的两种单色光按一定比例混合，也可以成为白光，这两种单色光叫互补色，如图。
处于直线关系的两种单色光互为互补色，如绿色和紫色互补，可以组成白光。
红橙黄绿青青蓝蓝紫2.物质的结构：对固体物质来说，当白光照射到物质上时，物质对不同波长的光线吸收、反射、透射、折射的程度不同，而使物质呈现出不同的颜色。
如果物质对各种波长的光完全吸收，则显黑色；如果物质对各种波长的光完全反射，则显白色。
如果物质选择性地吸收某些波长的光，则该物质的颜色由它所反射或投射的光的颜色来决定。
对溶液来说，其颜色是由于溶液中的物质（分子、离子）选择性地吸收某些颜色的光引起的。
如果光全部透射，则溶液是无色透明的；如果只让一部分波长的光透过，其他波长的光被吸收，则溶液就呈现透过光的颜色，即，溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。
如，CuSO 4溶液在600nm 处有吸收峰，此波长下吸收的是黄光，其互补色为蓝色，因此我们看到的CuSO 4溶液呈现出蓝色。
如果测量某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以λ为横坐标，以A （absorption ）为纵坐标，可得到一条曲线——光吸收曲线。
例：KMnO 4溶液的光吸收曲线（见教材）讨论：1.在可见光范围内，KMnO 4溶液对波长525nm 的绿光吸收最大，而对紫色和红色光吸收最弱，溶液呈现紫色。
光吸收程度最大处的波长——最大吸收波长λmax 。
2.浓度不同时，光吸收曲线形状相同，最大吸收波长不变。
3. 浓度不同时，相应的吸光度大小不同。
浓度越大，吸光度越大，比色就是以此为依据的。
三、 光吸收定律 mber 定律当溶液的浓度一定时，光的吸收程度与液层厚度成正比——Lamber 定律。
C 一定，L k II A 10lg ==吸光度 入射光强透射光强 比例常数液层厚度2.Beer 定律（如果吸光物质溶于不吸光的溶剂中），当液层厚度一定时，光的吸收程度和吸光物质的浓度成正比——Beer 定律。
C k II A L 20lg==一定， mber —Beer 定律如果要求同时考虑溶液浓度C 和液层厚度L 对光吸收(A)的影响，可将上述两定律合并，即Lamber —Beer 定律。
当一束单色光通过均匀溶液时，其吸光度与溶液的浓度、厚度的乘积成正比——Lamber —Beer 定律。
kCL II A ==0lg式中：k —比例系数，与入射光的波长、物质的性质、溶液温度有关。
I IT 入射光强度透射光强度透光率=kCL T A =-=∴lg0%,1001,0====A T I I 溶液无吸收，4.吸光吸数、摩尔吸光吸数kCL A =式中k 的单位随C 、L 单位不同而不同。
浓度C g/L mol/L 液层厚度L Cm Cm 比例常数k 吸光系数 a(L/g·Cm)摩尔吸光系数 ε(L/mol·Cm)L —B 定律aCL A =CL A ε=例：已知Fe 2+的浓度为500μg/L ，用邻二氮菲比色法测Fe 2+，比色皿长度L 为2Cm ，在波长508nm 处测得吸光度A 为0.19，计算摩尔吸光系数。
解：L mol L g C Fe /109.885.55/10500662--⨯=⨯=+CL A ε=)/(101.12109.819.046Cm mol L CL A ⋅⨯=⨯⨯==-ε注：①ε表示物质对某一特定波长光的吸收能力。
②ε越大，则该物质对某波长光的吸收能力越强。
③ε越大，比色测定的灵敏度越高。
④ε与C、L无关，与物质的性质有关，为了提高灵敏度，应选择ε值大的有色化合物。
5.偏离Lamber—Beer定律的原因①非单色光②化学因素③其它因素（如含有胶体、乳浊液、悬浮物质等）§3 比色分析方法和仪器一、目视比色用眼睛比较被测溶液同标准溶液（standard solution）颜色深浅的比色方法——目视比色法。
在这类比色法中，最简单和使用最多的是标准系列法。
标准系列法一般是取一套相同玻璃质料制造的、形状大小相同的比色管（不可几套混用），向管中逐一加入不同浓度的标准溶液，其他试剂的加入量相同，然后稀释到刻度，即形成颜色由浅到深的标准色阶。
另取一支比色管，加入被测溶液，和与标准色阶相同体积的试剂，稀释到刻度。
然后从管口垂直向下观察，并与标准色阶比较，若试液与某一标液颜色深度相同，则可确定试液的浓度与该色阶浓度相同；如果被测试液介于两标液之间，可取两标液的平均值来表示该溶液的浓度。
目视比色法的优点：1.设备与操作简单；2.因比色管较长，对颜色很淡的溶液（稀溶液）也能测出其含量，因而测定灵敏度高；3.比色法可在复合光（白光）下测定，且测定条件相同，所以某些不完全符合吸收定律的显色反应，也可用目视比色法测定；4.适于野外大批试样的分析。
目视比色法的缺点:1.由于许多有色溶液不够稳定，标注系列不能久存，经常需要在测定时同时配制，比较费时费事。
为了克服这一缺点，有时采用某些比较稳定的有色物质来配制标准色阶，如一定比例的K2Cr2O7(橙色)、CuSO4（蓝色）、CoSO4（粉色）配成标准色阶，也可制成各种色阶的有色玻璃、有色纸片（pH试纸）等来代替标准色阶。
2.目视比色的准确度低，一般相对误差为±5～20%。
二、仪器比色方法（一） 工作原理及仪器结构 1.原理光电比色和分光光度比色原理是相同的，都是比较溶液对某一波长光的吸收程度。
溶液的浓度透射光强度光电池产生的电流→∝2.仪器结构 ⑴光源常用光源为6～12V 钨灯，波长：300～1000nm ，电源由变压器供给，为了保持光源强度的稳定，以获得准确的结果，电源的电压必须稳定，因此采用磁饱和稳压器作为电源。
为了使通过溶液的光线变成平行光束，在光源后，有聚光透镜。
⑵单色光器仪器比色法是以Lamber —Beer 定律为基础的，而这个定律是建立在单色光上，即只有当入射光为单色光时，kCL A =才成立。
因此需要将单色光（复合光）变成单色光。
仪器光电比色计分光光度计滤光片光栅或棱镜波长范围宽的光电流II 0光源滤光片光栅或棱镜近似单色光有色溶液光电池检流计A or T光电比色法波长范围窄的单色光分光光度法将连续光源发出的连续波长的光分解为单色光的装置——单色器。
a. 滤光片滤光片的作用：主要使有色溶液吸收最大的那部分波长范围的光通过，吸收其余波长的光。
滤光片的质量：用半宽度来表示。
例如：470nm 的蓝色滤光片，λmax =470nm ——光强I ，在1/2I 处，λ=442～498nm ，半宽度：56nm 。
半宽度越小，滤光片的选择性吸收越好，透过的单色光越纯。
滤光片的选择：在比色分析中，正确地选择滤光片很重要。
要准确地选择合适的滤光片，应根据有色溶液、滤光片透过最大的波长及半宽度。
一般来说，选择滤光片的原则是：滤光片最易透过的光应是有色溶液最易吸收的光。
①滤光片只允许和它颜色相同的光线通过，如：绿色滤光片可透过绿光； ②有色溶液吸收与所见颜色互补的光；③所以，比色中选用的滤光片颜色应是待测溶液颜色的互补色。