猪瘟病毒蛋白的结构与功能

猪瘟病毒蛋白的结构与功能

李　军　杨　威3　陈凤莲　赵　武　(广西兽医研究所　广西南宁　530001)

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性的病毒性传染病。猪瘟因其流行广泛、发病率和死亡率高,给许多国家的养猪业造成巨大的经济损失,在世界动物卫生组织制定的《国际动物卫生法典》中,它被列为A类16种法定传染病之一;在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。当前猪瘟防治主要还是依赖于疫苗,虽然猪瘟疫苗的使用降低了猪瘟的发病率和死亡率,但是CSFV持续性感染导致的免疫失败,使人们开始把研究重点转向对病毒与宿主相互作用的研究。反向遗传学技术的出现,为我们了解病毒的基因结构、蛋白功能、基因重组提供了技术平台,得以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组和蛋白组,这使得CSFV的病原学研究取得了新突破。本文现将国内外近年来对CSFV基因结构、病毒蛋白功能上的研究作一综述。1　病毒的基因组结构

CSFV是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,与牛病毒性黏膜腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV基因组大小约12.3kb,5’非编码区由373个核苷酸组成,含有RNA复制所需的顺式作用元件和一个帽不依赖性翻译所需的内部核糖体进入位点;3’非编码区约由229～244个核苷酸组成,参与RNA的复制。CSFV 只编码一个大约3900氨基酸残基的多聚蛋白开放阅读框(ORF),该多聚蛋白在翻译过程中和翻译后,在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白(C、E rns、E1和E2)和8个非结构蛋白(N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。

2　病毒的蛋白

CSFV蛋白在病毒基因组的编码顺序为:N pro、C、E rns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。N pro、C、E rns、E1、E2、P7和NS2蛋白对于病毒RNA复制是非必需的,NS3、NS4A、NS4B和NS5A形成复制复合体与具有RNA依赖性RNA聚合酶活性的NS5B共同参与病毒RNA的复制。

2.1　N pro蛋白

N pro蛋白由168个氨基酸残基组成,分子量为23K Da,是一种具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶。N pro是CS2 FV中最先翻译的非结构蛋白,能在Cys168与Ser169间自我裂解,产生自己的C端,成为成熟的病毒蛋白。G lu22、His49和Cys69是保持N pro蛋白水解酶活性所必需的氨基酸残基。Tratschin等(1998)用鼠的泛素基因替换CSFV的N pro基因,证明了N pro对病毒在传代细胞内的复制是非必需的。Mayer D等〔1〕将猪瘟中等毒力株Alfort/187和强毒株Eystrup的N pro基因分别缺失后感染猪,结果猪产生了高水平的抗体并可以抵抗强毒的攻击。用疫苗株Riems的N pro基因置换强毒株Eystrup的N pro基因,得到重组病毒仍然为强毒株。因此, N pro只是CSFV的一个毒力相关基因,对CSFV各毒株的毒力不起决定作用。

Ruggli N等〔2,3〕对CSFV干扰宿主细胞抗病毒机制进行了研究,发现CSFV感染巨噬细胞后,可以抑制poly(IC)诱导巨噬细胞产生IFN-α/β,缺失了N pro基因的病毒,虽然在生长特性和蛋白表达水平上与野型病毒相似,但是失去了抑制

细胞产生IFN-α/β的能力。

La Rocca S A等〔4〕研究了N pro抑制细胞产生IFN-α/β的机制,发现N pro可以对参与IFN-α/β转录的干扰素调节因子3(IRF-3)起到抑制作用。在辛德毕斯病毒感染的细胞,可以观察到IRF-3从细胞质移位到细胞核,启动IFN-α/β的转录;而CSFV感染的细胞却与未受感染的细胞相似,虽然也有IRF-3穿梭于细胞核与细胞质间,但IRF-3主要定位在细胞质内。随后的研究证实,N pro蛋白是通过蛋白酶体降解途径降解IRF-3〔5〕。这些结果表明N pro有助于CS2 FV逃避机体的天然免疫,建立持续性感染。

2.2　C蛋白

C蛋白由99个氨基酸残基组成,分子量为14K Da,是CSFV的衣壳蛋白,其N端由有蛋白水解酶活性的N pro蛋白在Ser169处切割产生,其C末端是宿主细胞的信号肽酶在Ala265处切割产生〔6〕。C蛋白除了与病毒基因组RNA结合,保护病毒RNA外,还具有转录调节作用。C蛋白通过自身的核定位序列KKKGKV进入细胞核,激活热休克蛋白基因的启动子,启动热休克蛋白的转录。热休克蛋白作为一种伴侣分子,它的大量表达有助于病毒蛋白的折叠和病毒粒子的装配。

2.3　E rns蛋白

2.3.1　E rns蛋白的结构:E rns蛋白是分子量为26K Da的囊膜糖蛋白,由227个氨基酸残基组成(G lu268-Ala494),有9个潜在的N-糖基化位点。多肽链中的9个半胱氨酸残基维持蛋白结构,其中Cys438起着维系E rns二聚体的作用,van G ennip H G等〔7〕将E rns的Cys438突变为Ser后,E rns单体不能形成二聚体,降低了病毒粒子与SK-6细胞表面受体硫酸乙酰肝素的亲和力,影响了病毒的复制效率。

2.3.2　E rns蛋白的RNase活性:Schneider等(1993)报道了

E rns具有RNase活性,RNase活性最适p H为6.0～6.5,最适温度为55℃,酶活性不受Ca2+、Mg2+或EDTA(1mM)的影响。E rns对DNA没有活性,只作用于单链RNA,对富含U序列活性最高。E rns蛋白的His297和His346是酶的催化位点, His297和His346的突变虽然不会影响病毒在细胞中的增殖,但可使E rns丧失RNase活性,导致病毒毒力减弱,而且His297的缺失则可直接导致病毒无感染性。由于E rns具有RNase活性,在体外试验中,它不仅可以完全抑制刀豆素A 诱导的淋巴细胞增殖,还可以导致淋巴细胞凋亡。因此,E rns 的RNase活性不仅影响了病毒的毒力,而且还可能是CSFV 发生持续性感染的原因。

2.3.3　E rns蛋白在CSFV侵入中的作用:Hulst M M等(1997)的研究表明,CSFV感染传代细胞SK-6是通过其两个囊膜糖蛋白E rns和E2分别作用于细胞表面的不同受体来进行的。首先是E rns与细胞表面受体的不可逆结合介导了病毒的吸附;其次是E2与细胞表面特异性受体的可逆结合介导病毒的穿入。CSFV Brescia株在SK-6细胞上连续传代后,位于E rns内的476位氨基酸由不带电荷的丝氨酸突变为带正电荷的精氨酸,病毒通过这种突变可以更好地吸附在细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素上,提高了病毒的复制效率,其毒力只是轻微减弱或没有改变〔8～11〕。巨噬细胞表面

3为通讯作者。 基金项目:广西自然科学基金(桂科自0728103)。

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《上海畜牧兽医通讯》　2007年第6期