致突变作用实验方法

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v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
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七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
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v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
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v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
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v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
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常用于染色体畸变分析的细胞株
细胞株代号 CHO V79 L5178Y W138 细胞来源 二倍体染 色体数 22(18-22) 核型 不稳定 不稳定 不稳定 稳定 稳定
中国仓鼠 卵巢 中国仓鼠 22(21-22) 肺组织 小鼠淋巴 40(38-40) 细胞 人体肺组织 46 46
人淋巴细胞 人外周血液
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v 先 用低倍镜、高倍镜粗检，以有核细胞形态 完好作为判断制片优劣的标准，选择细胞分 散均匀、细胞完整、染色好的区域，再换成 油镜计数。每只动物至少观察计数1000个嗜 多染红细胞，观察其微核出现的频率及嗜多 染红细胞和成熟红细胞的比例。微核率一般 以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现两 个或更多个微核，仍按一个微核细胞计算。
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v 观察与解剖: 雌雄同笼后，小鼠以阴栓（鼠 于交配后，精液在阴道内凝固，如一白色栓 塞堵在阴道中，叫做阴栓。小鼠的阴栓比较 牢固，可在阴道内存留1~2天；大鼠的阴栓 不牢固，容易脱落。检查大鼠的阴栓时，还 应在笼底寻找阴栓）的出现作为妊娠第1天， 若未检出阴栓，则从同笼的第三天记为妊娠 第1天。于妊娠第14天处死雌鼠，观察双角 子宫内着床数，吸收胎，晚期死胎及活胎数。
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v （ 5 ）突变指数（ M1 ）＝总死胎数／总 着床数×100 v （6）显性致死率（DL, ％）＝（1－实 验组的平均生存胎仔数/阴性对照妊娠鼠 的平均生存胎仔数）×100
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v 结果判断: 根据上述结果综合评价，生 存胎仔总数减少，死亡胎仔总数增加; 胚胎总着床数（活胎、早期死亡胚胎和 晚期死亡胚胎的总和）减少或未着床胚 胎数增加。 v 结 果有统计学意义并有剂量反应关系时 记为阳性显性致死效应。
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六、程序外DNA合成试验(unschedule DNA synthesis UDS)
正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行 DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复 合成可发生在S期以外的时期，这种合成称为 程序外DNA合成。 基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的 量，这一掺入量可反映 DNA 损伤后修复合成 的量。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细 胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则 就需要人为地将细胞阻断于 G1 期，使增殖同 步化。
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v 整 体动物染色体畸变分析常用大鼠、小鼠或中 国地鼠的骨髓细胞、肝细胞或精原细胞作分裂 中期染色体分析。但由于整体动物实验操作繁 琐 、 试 验 时 间 长 、 工 作 量 较 大 、 又 不 够 灵 敏， 所以目前多使用包括人在内的哺乳类细胞株的 体外实验代替整体动物实验。 v 其 优点是取材于哺乳动物或人类，在一定程度 上能反映哺乳动物的实际情况，并能对结果进 行定量的、统计学处理，能在较短的时间内得 出结果，缺点是试验离开整体动物在试管内进 行，一般较易诱发突变。
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v 对照: 设阳性和阴性（溶剂）对照 v 剂量: 一般采用3个剂量组，最高剂量应导 致毒性症状或减低繁殖力。 v 交配方法 （1）在最后一次给药当天开始与雌鼠交配. （2）每只雄鼠单独饲养，与2～3只未交配过 的雌鼠同笼，5天后取出雌鼠，间隔1～2天后， 再放入第二批雌鼠，如此持续6～8周。
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v 对照组: 用溶媒作为阴性对照；已知能诱发微核 率升高的药物作为阳性对照。常用的阳性药物为 环磷酰胺。 v 骨髓采样 涂片 固定 染色 镜检
v 典型的微核是单一的，呈圆形，边缘光滑整齐， 嗜色性与核质一致，直径相当于红细胞直径的 1/20～1/5。偶有肾形、环形、马蹄形、椭圆形 等。用 Giemsa 染色后，微核呈紫红色或蓝紫 色。
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实验步骤：
v １.细胞: 中国仓鼠肺细胞(CHL) 。 v ２.剂量: 至少应用三种不同剂量，高剂量以 50％细胞生长抑制浓度为基准，但最高不要 超过10mmol/L。中、低剂量则采用倍量稀释 法。 v 3.代谢活化: 在加S9混合液和不加S9混合液平 行的条件下测试。 v 4.药物作用时间: 药物和细胞接触,非活化组 分别作用24和48小时收获细胞，代谢活化组 作用6小时以上。 Nhomakorabea8
三、微核试验
微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有 关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺 锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂 后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内， 因比主核小，故称微核。
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v 动物: 一般用小鼠，首推NIH小鼠，每组10 只性成熟动物（雌雄各半）或至少6只性成熟 雄性动物。 v 给药剂量及途径: 至少采用三种剂量，最高 剂量以1/2 LD50为基准，目的是为了尽可能 发现药物本身可能具有的毒性作用；低剂量 的设计则应结合药效学试验及临床拟用剂量 进行考虑，在高、低剂量之间按一定比例关 系插入一个中间剂量。 v 给药途径尽可能与临床拟用途径相同。
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MN
NCE
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四、果蝇伴性隐性致死试验（Sex-linked recessive lethal test, SLRL）
v 是 利用隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征 而设计的。雄性果蝇 X 染色体的突变传给 F1 代 雌性果蝇， F1 代雌性果蝇为杂合性，不能表达； F1代雌性果蝇又传给F2代雄性果蝇，F2代雄性 果蝇为半合性，能表达出来。 v 如果亲代雄性果蝇接触受试物后X染色体出现隐 性致死突变，则F1代雌性果蝇中不表达，而F2 代雄性果蝇中因有一半接受了这个已发生突变 的 X 染色体，结果 F2 代雄性果蝇数目比雌性果 蝇少了一半。
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v 实验动物果蝇是现代遗传毒理学上常用的 实验昆虫，对化学物的代谢酶与哺乳动物相似， 且世代周期短，繁殖率高，饲养简单是该法的 优点；但蝇类的生殖腺和循环系统的结构与哺 乳动物差异较大，所以，其结果在外推到哺乳 动物或人时要慎重。
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五、啮齿类动物显性致死试验
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原理: 显性致死试验是观察哺乳动物生殖细 胞染色体损伤的一种方法。生殖细胞在减数 分裂期和受精期最易发生突变，突变后失去 与异性生殖细胞结合的能力，或者结合后会 出现发育不正常的胚胎，以致造成总着床数 减少或早期胚胎死亡及畸胎等现象。 动物: 性成熟小鼠。每组至少15只雄鼠，20 只以上孕鼠。
结果判断
（1）掺入法：计数每皿生长的回变菌落数，以 Rt/Rc比值表示，>2为阳性（Rt/Rc=诱发回变菌 落数/自发回变菌落数）。 v 当 受试物浓度达到5 mg/ 皿仍为阴性者，可以 认为是阴性。 v 更 为可靠的是观察剂量-反应关系，随受试物 剂量的增加，诱发的回变菌落数增加为阳性结 果。
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本试验系一种特异性的“β-半乳糖苷酶诱 导试验”，一旦测试菌株DNA受损伤，即可 使其产生SOS反应，组成该反应系统的RecA 蛋白即转化为RecA蛋白水解酶。此酶可分解 阻遏蛋白，使受阻遏的 sfiA 基因去阻遏，并 启动 lacZ 基因翻译、转录、表达，其表达产 物即为半乳糖苷酶。此酶可分解邻硝基苯 β D- 半乳糖苷 (ONPG) ，产生黄色可溶性物质， 根据其颜色的深浅对被诱导酶的数量进行定 量测定，从而判断DNA是否受损伤及损伤的 程度。
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（2）点试法： v 凡在滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落，该 受试物即为致突变物质。 v 如 只在平皿上出现少数散在的自发回变菌落， 则为阴性。如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明 受试物具有细菌毒性。
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二、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
v 生殖细胞和体细胞都可发生染色体畸变，因此 染色体畸变试验应分别在这两种细胞中进行。 v 一般以骨髓细胞或外周血细胞代表体细胞，睾 丸精原细胞代表生殖细胞。
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v 活 胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、 晚期死亡胚胎的鉴别方法：
（1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自 然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色 泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的 长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎 形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全， 呈紫红色，无自然动作。