两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌生物被膜厚度的影响

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铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究

复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518中文摘要背景细菌生物膜（Ｂｉｏｆｉｌｍ，ＢＦ）是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和ＤＮＡ等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。

生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。

细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。

生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是临床上难治性感染的一个重要原因。

近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的Ｒ益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。

第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用４种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，ＣＬＳＭ观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。

分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。

结果ＣＬＳＭ观察显示２４ｈ生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，７２ｈ生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；２４ｈ和７２ｈ生物膜厚度分别为２７．６¨ｍ、６４．６ｐｒｏ。

扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。

结晶紫染色法测得８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的吸光度值分别为０．０８土０．０４、０．２０土０．０７、０．４１士０．３３、Ｏ．４７士０．３３和０．６８＋０．３４，结果有统计学差异（Ｐ＜０．００１）。

2种培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的影响

2种培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的影响摘要目的：评估低氨基酸培养基和MH培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的区别。

方法：采用琼脂稀释法分别使用MH和低氨基酸培养基测定亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等10种抗菌药物对我院临床分离60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度（MIC），比较其结果的差异。

结果：使用MH琼脂作为药敏培养基时，60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和帕尼培南的敏感率分别为90%、85%和68.3%和15.7%、23.6%和15%；使用低氨基酸琼脂作为药敏培养基时，它们的敏感性分别上升到100%（P=0.272）、96.7%（P=0.053）、93.3%（P=0.001）和90.7%（P=0.001）、98.6%（P=0.001）和91.4%（P=0.001），其中铜绿假单胞菌对帕尼培南的敏感率上升有显著差异，而鲍曼不动杆菌对三者的敏感率上升均有显著差异。

结论：我院分离的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药率较高。

碳青霉烯类药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的抗菌活性高于其它类抗菌药物。

低氨基酸培养基，由于其碱性氨基酸浓度降低至与人血清中相近的浓度，适宜用于帕尼培南体外敏感性测定。

ABSTRACT Objective：To evaluate the effects of low-amino-acid agar and Mueller-Hinton （MH）agar on the susceptibility of clinical non-fermentative isolates to three carbapenems. Methods：The activities of imipenem，meropenem，panipenem and so on were tested against 40 Pseudomonas aeruginosa and 160 Acinetobacter baumannii strains isolated from our hospital. The minimum inhibitory concentration （MIC）of each antimicrobial agent against these strains was determined by a standard agar dilution procedure on the MH and low-amino-acid agars，respectively. Results：The susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to imipenem，meropenem，panipenem was 90%，85%，68.3% and 15.7%，23.6% ，15%，respectively when they were incubated on MH agar，however，their susceptibility was enhanced to 100% （P=0.272），96.7% （P=0.053），93.3% （P=0.001）and 90.7% （P=0.001），98.6% （P=0.001）and 91.4% （P=0.001）on low-amino-acid agar，respectively，which were statistically significant. Conclusion：Carbapenems had good antibacterial activity in vitro against P. aeruginosa and A. baumannii. Low concentrations of basic amino acid medium should be used in order to get consistent result between in vitro susceptibilities and clinical effect of panipenem against P. aeruginosa..KEY WORDS carbapenems；non-fermentative isolates；in vitro susceptibilities；low-amino-acid agar碳青霉烯类抗菌药物于20世纪90年代初开始用于临床，由于其对β内酰胺酶较强的稳定性，对几乎所有的肠杆菌科细菌具强大的抗菌作用，是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）等多重耐药革兰阴性杆菌包括某些非发酵菌所致感染的重要药物[1]。

两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生物被膜的研究的开题报告

两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生
物被膜的研究的开题报告
一、研究背景和意义
希瓦氏菌和假单胞菌是两种常见的口腔微生物，它们常常聚集在口腔表面形成牙菌斑，是口腔疾病的主要病因。

同时，希瓦氏菌和假单胞菌也是耐药性较强的细菌，其引发的感染不易被治愈。

因此，寻找新的药物来对抗这两种细菌及其形成的生物膜是十分重要的。

多酚是一种广泛存在于植物中的天然产物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌等。

现有研究表明，许多植物多酚具有抑制细菌生长的能力，但其对希瓦氏菌和假单胞菌的影响尚不明确。

因此，本研究将选取两种植物多酚，探讨其对希瓦氏菌和假单胞菌的抑制作用及对其形成的生物膜的影响，旨在为口腔微生物感染的治疗提供新的方向和思路。

二、研究内容和方法
本研究将选取两种植物多酚进行体外抗菌实验。

首先，采用菌落计数法测定细菌在不同浓度的多酚处理下的生长状况。

进一步，利用聚合酶链式反应（PCR）技术检测多酚对细菌生物膜的影响，观察其对生物膜形成的影响及抗生素穿透的情况。

三、研究预期成果
通过本研究的实验结果，预计能够找到在体外体系中对希瓦氏菌和假单胞菌具有较强抑制作用的植物多酚，并探讨其对这些细菌生物膜的影响。

同时，本研究将为寻找新的口腔微生物感染治疗药物提供新的思路和方向。

细菌耐药——挑战与对策

细菌耐药——挑战与对策自19 世纪晚期德国科学家Robert Koch 证实了感染性疾病的细菌起源学说起，人类一直致力于与细菌感染性疾病的斗争。

以青霉素为代表的抗生素的发现和发明，曾一度有效控制了细菌感染性疾病。

人们在庆幸一代又一代新型广谱高效抗菌药物出现的同时，也惊叹越来越多的耐药菌株种类和越来越高的耐药比例。

细菌耐药已经成为严重的公共卫生问题，而且其发展速度远远超过抗菌药物研制，有专家预言，长此以往，人类将再次陷入对细菌感染无药可治的困境，即进入“后抗生素时代”。

通过对细菌耐药机制的研究来研发新的抗菌药物、正确合理应用现有抗菌药物是应对这种挑战的关键。

一、细菌耐药机制细菌耐药的原因很复杂，抗菌药物滥用所造成的压力使细菌产生获得性耐药，如产生各种灭活酶或钝化酶、抗生素结合位点改变、细胞膜通透性改变、泵出机制。

研究者和临床工作者近年来发现细菌表现为生物被膜的多细胞结构群体也是临床上抗菌药物治疗无效的重要原因。

美国疾病预防与控制中心（CDC）的研究结果表明，约65％的感染性疾病与细菌生物被膜有关，这也是抗感染治疗面临的新挑战。

细菌生物被膜是指附着在有生命或无生命物体表面的由细菌自身产生的胞外多聚基质包裹的菌细胞结构群体。

与浮游细菌相比，生物被膜细菌对抗菌药物的抗性可提高10－1000 倍，现有药物难以清除生物被膜，造成感染反复发作。

本课题组曾对铜绿假单胞菌生物被膜的胞外多糖主要成分之一——藻酸盐做过深入研究，并从临床一位反复肺部感染的老年患者的痰标本中分离出一株含新的mucA 基因突变的黏液型铜绿假单胞菌。

本课题组通过同源重组对改突变基因的功能进行了研究，目前的结果表明该新型突变的mucA 基因通过藻酸盐以外的途径影响铜绿假单胞菌生物被膜的形成和耐药。

进一步的深入研究还在进行中。

二、中国细菌耐药流行趋势根据中国CHINET 2005 年度的调查结果，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRS A）与甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）的检出率分别为69%与82%，明显高于2002－2003 年度的调查结果（分别为41.0%与29.1%）。

pH值对铜绿假单胞菌耐药特征的影响及机制研究

pH值对铜绿假单胞菌耐药特征的影响及机制研究研究背景和目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属于革兰氏阴性菌,它在自然界的分布十分广泛,是导致人类疾病的最重要的条件致病菌之一。

尤其在呼吸系统感染疾病中最为常见,而且是呼吸机肺炎和获得性感染的重要病原体。

由于目前抗生素滥用问题十分严重,铜绿假单胞菌的耐药率呈现逐年提高的趋势,由于铜绿假单胞菌极易生成生物被膜(Biofilm)从而逃避免疫系统攻击,也降低了抗生素疗效;并可通过基因突变、获得外源耐药基因、外排泵等多种方式导致对青霉素类、先锋霉素类、碳青霉烯类、单菌霉素、氨基糖甙类、多粘菌素类和氟喹诺酮类抗生素耐药甚至是泛耐药。

面对严峻的耐药形势,除了开发新型抗生素以外,目前研究方向有“老药新用”和“利用共生菌抑制致病菌”等方法,但存在新药开发周期长、新技术应用范围窄等缺点,因此急需简便易行有效的方法来改善抗生素疗效。

我们发现,致病菌感染部位的内环境在感染控制与治疗过程中起到了关键作用。

然而,以往的耐药研究多集中在体外,而人体内环境对致病菌耐药性的影响却知之甚少。

由于感染部位的表面性质、基础疾病以及pH值都会对细菌生理活动甚至是耐药性产生影响。

为了达到通过改变感染部位内环境提高抗生素治疗效果,因此必须在感染环境中研究致病菌耐药性和致病性的影响及并探讨其分子机制。

pH值对维持人体正常生理活动至关重要,为了维持组织的正常生理功能,内环境一般具有稳定的pH值。

在临床上多种疾病能够导致气道内及体液中的pH 值发生改变,这种改变将会对定植在气道表面的病原微生物产生作用,影响抗生素的抑菌活性、生物被膜生成以及毒力因子的分泌,但pH值的改变如何影响以上致病性相关表型?这一过程中有哪些关键基因或蛋白参与?如何通过改变环境pH 提高感染状态下抗生素疗效?对于以上问题目前尚无明确结论。

为了揭示铜绿假单胞菌在不同pH值条件下耐药特征的一般规律,发现不同pH值对影响铜绿假单胞菌耐药与生物被膜生成的关键调控分子,进而通过改善内环境来提高抗生素治疗效果,本研究利用微生物学、分子生物学以及RNA-seq 等现代技术,通过模拟呼吸道中的pH值,对铜绿假单胞菌耐药特征与基因背景的相关性进行深入分析与研究,10揭示pH值对铜绿假单胞菌毒力分泌、被膜生成等致病因素的作用规律,为提高抗生素治疗效果、延缓或逆转铜绿假单胞菌耐药及抑制生物被膜生成提供重要理论支持。

大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究

大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究耿朝萌;刘林波;郭瑞林;苏冰;张晓雪【摘要】目的：刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验检测大肠埃希菌生物膜的敏感性和特异性比较。

方法：对临床分离的83株大肠埃希菌进行生物膜形成实验，分别经刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验，随机抽取25株进行激光共聚焦显微镜（CLSM ）观察。

结果：临床分离的83株大肠埃希菌经刚果红-阿利新蓝联合染色阳性率37．3％，敏感性81．8％，特异性100％；半定量粘附实验阳性率45．8％，敏感性100％，特异性78．6％；两种检测方法比较差异无统计学意义。

结论：刚果红-阿利新蓝联合染色、半定量粘附实验均可用于大肠埃希菌生物膜的检测。

【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】2页(P364-365)【关键词】大肠埃希菌;生物膜/细胞学;刚果红-阿利新蓝联合染色;细菌粘附;染色与标记;显微镜检查 ,共焦;比较研究【作者】耿朝萌;刘林波;郭瑞林;苏冰;张晓雪【作者单位】陕西中医药大学医学技术系咸阳712000;陕西中医药大学医学技术系咸阳712000;陕西中医药大学第二附属医院检验科;陕西中医药大学第二附属医院检验科;陕西中医药大学第二附属医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R446.5·临床检验·主题词@大肠埃希菌生物膜/细胞学刚果红-阿利新蓝联合染色细菌粘附染色与标记显微镜检查，共焦比较研究细菌生物膜形成在细菌感染中的作用已引起广泛关注，对生物膜的检测也得到了越来越高的重视，出现了各类不同的检测方法[1-5]。

本文对我院临床分离的83株大肠埃希菌在体外能否形成生物膜进行实验，并分别采用刚果红-阿利新蓝联合染色，半定量粘附实验，比较其阳性检出率、敏感性和特异性，对其临床意义进行探讨，现报告如下。

1 实验菌株、主要试剂与仪器收集2014年8～11月陕西中医药大学第二附属医院临床标本中分离的83株大肠埃希菌，删除同一患者相同感染部位分离的重复分离菌株，所有菌株均经临床鉴定。

铜绿假单胞菌解析

发酵型
氧化型
产碱型
分离培养
• 本菌生长对营养要求不高。对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基（MAC）；对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通或血琼脂培养基。
• 在普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落，该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色；在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环，菌落呈金属光泽；如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长，在液体表面形成菌落，而在培养基底部细菌的生长不良。
绿或灰绿有溶血环 • MACc平：微小无光泽半透明 48h后菌落呈棕色
鉴定
• 初步鉴定菌体形态菌落特征产色素气味氧化酶 • 最终鉴定非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
• 细菌耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗生素泵出胞外 –抗菌药物作用靶位改变 –膜孔蛋白突变 –生物膜屏障作用
• 绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。
培养基成分：
• • • • •
胆盐乳糖培养基（BL）
胨 20. 0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5. 0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (或去氧胆酸钠）（0.5g) 磷酸氢二钾 4. 0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节P H值使灭菌后为7 . 4 ± 0 . 2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
培养基成分：
PDP斜面，是否有色素，有，用氯仿3-5ml萃取，用无菌玻璃棒搅碎培养基、混匀，色素完全在氯仿层。吸管把氯仿层移到另一试管，加入盐酸1M1ml，静置后，盐酸出现粉红为阳性，无粉红为阴性，阴性斜面培养1-2天再重新做一遍。如果仍是阴性。做下一步试验。绿脓菌素从有机相转到酸性水相中会由蓝绿色变为粉红色。

铜绿假单胞菌生物被膜研究进展

铜绿假单胞菌生物被膜研究进展摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是最严重的医院内获得性感染的病原菌之一,生物被膜(Biofilm,BF)多粘附在生物材料和植入的各种导管及人体组织表面,它的形成使得铜绿假单胞菌生物被膜相关感染不断上升,致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制,给治疗增加更大的难度。

临床上已有许多被证实可用于治疗PA生物被膜感染的药物,藻酸盐、密度感应系统对PA生物被膜形成的作用也为治疗生物被膜病提供了新思路。

关键词:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐感应密度系统生物被膜(Biofilm,BF)是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构,而并非单一细菌的膜成分。

细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用,而且还可以对抗人体的免疫清除作用,对人类的健康造成了很大的危害,从而导致严重的临床问题。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染最常见的细菌之一,其生物被膜形成常给临床治疗带来许多困难。

本文就铜绿假单胞菌生物被膜的研究情况进行综述。

1 生物被膜的形成生物被膜的形成过程包括3个方面:①浮游细菌粘附到表面形成单细胞层;②细菌通过群落生长或聚集形成微菌落,进而形成蘑菇状结构;③细菌分泌细胞外多聚物,形成基质,细菌深埋于基质内,成为成熟的生物被膜。

细菌生物被膜结构坚实稳定,不易受到破坏,是细菌为了适应环境、维持自身发展所发生的形态变化。

2 藻酸盐对生物被膜形成的作用据报道,铜绿假单胞菌会在活体内产生藻酸盐,而且在铜绿假单胞菌感染住院的病人的体内也检测到藻酸盐抗体的存在。

这些多糖藻酸盐结构主要成分是甘露糖醛酸和古洛糖醛酸。

研究表明铜绿假单胞菌可以分成粘液型及非黏液型两种表型,粘液型铜绿假单胞菌可借助其表面分泌的藻酸盐,而粘附于异物表面。

Sauer K 等在流动的介质中建立的铜绿假单胞菌生物被膜模型,发现黏液型菌株的生物被膜为塔状或蘑菇状,非黏液型菌株的生物被膜为薄膜状[1]。

培养基对不同产酶铜绿假单胞生物膜菌敏感性的影响

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维普资讯
山东医药２０年第４卷第１期０８８３
培养基对不同产酶铜绿假单胞生物膜菌敏感性的影响
李钊，蒋捍东
（青岛大学医学院附属医院，山东青岛２６０）６０３
［摘要］目的研究不同培养基中产不同类型Ｂ内酰胺酶的铜绿假单胞生物膜菌对抗菌药物的敏感性。方一法 ①选取产超广谱Ｂ内酰胺酶、．头孢霉素酶和金属型ｐ内酰胺酶的铜绿假单胞菌菌株，用Ｌ肉汤（Ｂ、酶一应一Ｌ）胰大豆肉汤（Ｂ、ＭＨ）水解酪蛋白胨肉汤（Ｓ）ＴＢ三种培养基建立细菌生物膜模型； ②选用环丙沙星、头孢他啶和亚胺培南，应用微量稀释法和ＭＢＣ — ｅｉＥＴＤｖｅ测定最低抑菌浓度和最低生物膜菌清除浓度。结果Ｍｃ ① 浮游状态下，绿铜不同环境可影假单胞菌在三种培养基中对同种药物的敏感性无统计学差异（００） ②形成生物膜后，Ｐ＞．５；铜绿假单胞菌在三种培养基中对环丙沙星及亚胺培南的敏感性为ＬＭＨＢ＜Ｂ＜ＴＢ，Ｓ存在统计学差异（Ｐ均＜．５。结论００）响生物膜状态下铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性。［关键词］铜绿假单胞菌；生物膜；最低抑菌浓度；最低生物膜菌清除浓度；培养基

铜绿假单胞菌耐药率与生物膜形成能力之间的相关性分析

铜绿假单胞菌耐药率与生物膜形成能力之间的相关性分析摘要：铜绿假单胞菌与多种人类感染有关，主要与医疗保健服务有关。

在医院里，它与对几种抗生素的耐药性有关，这对治疗造成了巨大的挑战。

然而，治疗铜绿假单胞菌感染的最大挑战是与生物膜相关的感染，其引起的感染是危及生命的，因此，本研究旨在评价具有生物膜形成能力与铜绿假单胞菌分离株的抗生素耐药性。

关键词：铜绿假单胞菌；生物膜；耐药性铜绿假单胞菌是一种革兰染色呈阴性的微生物，是继金黄色葡萄球菌和大肠杆菌之后的第三大最常见的医院感染原因。

此外，患恶性肿瘤、血液病和代谢性疾病的患者，以及术后或接受某些治疗后的患者易感染本菌，特别是在囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、烧伤或免疫缺陷患者和那些接受人工通气的患者中[1]。

一、研究背景医院感染铜绿假单胞菌是发达国家和发展中国家的医学所面临的主要问题之一，它促进了传染病在社区中的传播。

烧伤伤口患者对微生物感染的敏感性较高，导致免疫系统减弱，烧伤损伤能力较强。

近年来广泛使用抗生素导致铜绿假单胞菌抵抗广谱抗生素，使其形成不同程度的多重耐药性(multidrug resistance，MDR)，现有研究表明，这些菌株的抗性模式是由获得其他遗传因子产生的，如转座子、噬菌体和含有抗性基因的可移动基因盒，这些可移动的遗传元件具有转移耐药基因的很高的潜力[2]。

位于转座子上的整合子有好几类，其中第1、2、3类，特别是第1类在抗生素耐药性中起着重要作用。

在铜绿假单胞菌中，金属-β-内酰胺酶(MBL)由可移动的遗传元件编码，包括第1类和第2类整合子[3]。

二、研究意义了解这些菌株是如何在传播过程中形成生物膜来抵抗药物，对于寻找疾病的来源和治疗手段具有特殊的流行病学意义，因此，本研究旨在评价具有生物膜形成能力的铜绿假单胞菌分离株的抗生素耐药性模式。

三、采集标本与方法本研究于2021年1月至2021年12月，共获得439例济宁市第一人民医院烧伤病房收治医院（尿路感染、伤口感染、软组织和皮肤感染、菌血症）感染患者的临床标本（尿液、血液、伤口、脑脊液）。

医院分离铜绿假单胞菌多药耐药与细菌生物被膜之间的关系

菌ＡＴＣＣ２７８５３。
１．４统计学方法
成的关系。
２结果
采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件，单因素
ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析铜绿假单胞菌多药耐药与生物被膜形
１．２药敏实验
药敏试验采用纸片扩散法，药物采用
１材料与方法
晶紫室温染色１５ｍｉｎ，生理盐水冲洗，每孑Ｌ加９５％乙醇室温脱色１０ｍｉｎ。分光光度计测定ＯＤ值。将空白
对照的平均ＯＤ值加上其标准差定义为ＯＤｃ，待测菌株的ＯＤ与ＯＤｃ比较，将菌株生物被膜形成能力依次分为阴性（一）、弱阳性（＋）、中等阳性（＋＋）、强阳性（＋＋＋）４种（阴性：无生物膜形成，ＯＤ≤ＯＤｃ；弱阳性：
美国实验室标准化委员会（ＣＬＳＩ２００９）规定的Ａ组（头
孢他啶、庆大霉素、妥布霉素、哌拉西林）、Ｂ组（阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林／他唑巴坦、替卡西林）共１３种药物，结果按ＣＬＳＩ相应标准判定。药敏纸片购自英国Ｏｘｏｉｄ公司。对于以上１３种药物７大类：头孢菌素类（头孢他啶、头孢吡肟）、青霉素类（哌拉西林、替卡西林）、碳青霉烯类（亚胺培南、美罗培南）、单环内酰胺类（氨曲南）、喹诺酮类（左氧氟沙星、环丙沙星）、氨基糖苷类（庆大霉素、妥布霉素）、Ｂ一内酰胺酶抑制复合剂（哌拉西林／他唑巴坦）至少３类耐药为多药耐药铜绿假单胞菌。

两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌生物被膜厚度的影响

ｌｖｒｉｍｄａｃｔ［．Ｃｎｉａｉ，０，：９．ａａａｅａｓｅｃｎＴ］ｌＭｃｂ２Ｏ３１１ｔｔ￣ｎｅｉｌｅｅＪＪｌｒｄ０８７［］ａｏｌｏｌｅｆｉｃｂｒｏａｄｒ．ｅｏａｃｎａｓ３ＮｔａｃｔｅｏｃｎａｌｏｒｓｎａｓＰｒｒｎｅｔｄｒｉ￣ｎｔｒｌｉｌａｍｙｔｄｎｆｍｓａｄ
严岩，彤刘树林卜．李一，
（．１北京大学医学部病原生物学系，北京１０８；２北京大学第一医院检验科）００３．
摘要：目的探讨营养成分不同的两种培养基对临床分离的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌形成生物被膜形态的影
响。方法使用电击转化将ｐＭ２转入临床分离的３ＳＣ１株铜绿假单胞菌和３株大肠埃希菌体内，构建表达绿色荧光蛋白的菌株。在Ｌｒ－ｅ＇ｉＬ）ＭｕｉＢｒｎ（Ｂ和９葡萄糖基础培养基中以盖玻片为支持表面，ａｔａ进行细菌生物被膜的连续培养。经
ｓｔｍ￣ｍｅａｌｃａｍｓａｎｌｉａｓｌｔｓ０ｅｓｅｌｎｕｎａｂｔ—ａｔｚ￣ｍｏｇＣｉｃｌＩｏａｅｆＫｌｂｉｌＰｅｍｃｉｅｎａ
参考文献：
［］１牟立东，张立平．产超广谱Ｂ内酰胺酶细菌的检测及耐药性分析［］中国现代应用药学杂志，０，（）７．Ｊ．２５１２：０２７［］０ＤＥＭａＳ］ａ￣Ｓ（ａｍｃｄｅｃｎｆｎ２Ｃｕｌ，ｄｎＥ，ａｏＫ．￣ｎａｔｔ士１Ｐｄｈｘｎｋｕｅｎｄｅｉ０Ａｏ

铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究

生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。

细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。

分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。

扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。

氧浓度变化对铜绿假单胞菌生物被膜生成的影响

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ；ｂｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ｑｕｏｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇｓｙｓｔｅｍ；ｔｙｐｅⅢ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍＡｃｔａＡｃａｄＭｅｄＳｉｎ，２０１０，３２（３）：３１０－３１４
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＢｅｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００７３０，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＳＵＮＴｉｅｙｉｎｇＴｅｌ：０１０８５１３６２４２，Ｅｍａｉｌ：ｓｕｎｔｉｅｙｉｎｇ３＠ｈｏｔｍａｉｌｃｏｍ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｍｏｎｇｏｘｙｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｑｕｏｒｕｍｓｅｎｓｉｎｇｓｙｓｔｅｍ，ｔｙｐｅⅢ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ａｎｄｂｉｏｆｉｌｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａＭｅｔｈｏｄｓＡｔｏｔａｌｏｆ２３ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｒａｉｎｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｓｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｏｘｙｇｅｎｆｏｒｔｈｒｅｅＬａｓＩａｎｄＲｈｌＩｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｄａｙｓＴｈｅｎｂｉｏｆｉｌｍｍａｓｓａｎｄａｌｇｉｎａｔｅｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｆｉｅｄＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＰＣＲ）ＴｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｅｘｏｅｎｚｙｍｅＳｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔＲｅｒｅａｌｔｉｍｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｓｕｌｔｓＢｏｔｈｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍｍａｓｓ（Ｒ＝０４５５，Ｐ＝００００）ａｎｄａｌｇｉｎａｔｅ（Ｒ＝０３６７，Ｐ＝００００）ｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｏｘｙｇｅｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＬａｓＩａｎｄＲｈｌＩｗｅｒｅｎｏｔ

美罗培南对胞内不同c-di-GMP浓度表型铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

广西医科大学学报2020Jun ；37（6）JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY美罗培南对胞内不同c-di-GMP 浓度表型铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响*谢杰鹏，孔晋亮△，陈一强，王可，罗劲，张真强，刘冬梅（广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，南宁530021）摘要目的：探究美罗培南对胞内不同环二鸟苷酸（c-di-GMP ）浓度表型铜绿假单胞菌（PA ）生物被膜形成的影响。

方法：两倍稀释法测定美罗培南对各菌株的抑菌浓度(MIC)；设阴性对照组和3个美罗培南干预组（1/2MIC 、1/4MIC 、1/8MIC ）。

用1/2MIC 、1/4MIC 、1/8MIC 的美罗培南分别干预野生株PAO1、PA 胞内c-di-GMP 高表达株(PAO1ΔwspF)、PA 胞内c-di-GMP 低表达株(PAO1/P lac -yhjH )，观察美罗培南对其运动能力的影响，用结晶紫染色法测定美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF 、PAO1/P lac -yhjH 菌株的生物被膜形成以及对生物被膜清除能力的影响。

结果：在美罗培南的干预下，PAO1、PAO1ΔwspF 、PAO1/P lac -yhjH 的运动区域直径均比阴性对照组小（P ＜0.05），所形成的的生物被膜也均比阴性对照组少（P ＜0.05），而破坏的生物被膜均比阴性对照组多（P ＜0.05）。

结论：美罗培南能抑制PAO1、PAO1ΔwspF 、PAO1/P lac -yhjH 的运动能力以及生物被膜形成，美罗培南能破坏PAO1、PAO1ΔwspF 、PAO1/P lac -yhjH 形成的生物被膜，美罗培南对PAO1、PAO1ΔwspF 、PAO1/P lac -yhjH 的抑制效果不同。

关键词美罗培南；c-di-GMP ；铜绿假单胞菌；生物被膜中图分类号：R446.5文献标志码：A文章编号：1005-930X （2020）06-1001-06DOI ：10.16190/ki.45-1211/r.2020.06.002Effect of meropenem on biofilm formation of phenotype pseudomonas aeruginosa with differ⁃ent c-di-GMP concentrations in cellsXie Jiepeng,Kong Jinliang,Chen Yiqiang,Wang Ke,Luo Jin,Zhang Zhenqiang,Liu Dongmei.(Department ofRespiratory and Critical Care Medicine,The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)Abstract Objective:To investigate the effect of meropenem on the biofilm formation of phenotype pseudomo-nas aeruginosa (PA)with different concentrations of intracellular c-di-GMP.Methods:Two-fold dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC)of meropenem on each strain;a negative con-trol group and three meropenem intervention groups (1/2MIC,1/4MIC,1/8MIC)were set up.1/2MIC,1/4MIC,and 1/8MIC meropenem were used to intervene in the wild strain PAO1,PA intracellular c-di-GMP high expres-sion strain (PAO1ΔwspF ),and PA intracellular c-di-GMP low expression strain (PAO1/P lac -yhjH )to observe the ef-fect of meropenem on their exercise ability.The effect of meropenem on the biofilm formation of PAO1,PAO1ΔwspF ,PAO1/P lac -yhjH strains and its effect of biofilm removal were detected by crystal violet staining.Re-sults:Under the intervention of meropenem,the diameters of the exercise areas of PAO1,PAO1ΔwspF ,and PAO1/P lac -yhjH were smaller than those of the negative control group (P ＜0.05),less biofilms were formed than in the negative control group (P ＜0.05),and more biofilms were destroyed than in the negative control group(P ＜0.05).Conclusion:Meropenem can inhibit the exercise ability and biofilm formation of of PAO1,PAO1ΔwspF ,and PAO1/P lac -yhjH .Meropenem candestroy the biofilm formed by of PAO1,PAO1ΔwspF ,and PAO1/P lac -yhjH .The inhibitory ef-fects of meropenem on of PAO1,PAO1ΔwspF ,and PAO1/P lac -yhjH are different.Keywords meropenem;c-di-GMP;pseudomonas aeruginosa;biofilm*基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81760743)；广西高校中青年教师科研基础能力提升资助项目（No.2019KY0125）；广西自然基金资助项目(No.2016GXNS-FAA380297)；广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题资助（No.Z20200825，No.Z20170960）△通信作者，E-mail ：**************收稿日期：2019-12-02··1001广西医科大学学报2020Jun；37（6）铜绿假单胞菌（PA）是一种条件致病菌，容易引起各种感染。

铜绿假单胞菌在不同培养基培养状态

铜绿假单胞菌在不同培养基培养状态
铜绿假单胞菌原名绿脓杆菌、广泛分布在自然界中，是土壤中存在常见的细菌之一，在水、空气、人的皮肤、呼吸道和肠道等都有铜绿假单胞菌的存在。

铜绿假单胞菌在潮湿的环境中存在，铜绿假单胞菌是一种常见条件致病菌，是非发酵革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈现球杆状或线状，成对或者短链状排列。

菌体一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌活波运动。

培养基培养
1.铜绿假单胞菌在普通琼脂平板培养基上，经18～24小时培养，可形成圆形，大小不一，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑、湿润的菌落。

2.铜绿假单胞菌在S-S琼脂培养基上可形成类似沙门菌的菌落，稍久菌落可呈棕绿色。

3.铜绿假单胞菌在血液琼脂培养基上经18～24小时培养，可形成扁平、湿润、有特殊气味的灰绿色或蓝绿色菌落。

4.铜绿假单胞菌在肉汤中经35℃18～24小时培养，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。

5.铜绿假单胞菌在麦康凯琼脂培养基上，经18～24小时培养，可形成微小、无光泽半透明菌落，48小时菌落中心常呈棕绿色。

不同营养条件对大肠埃希菌生物膜形成的影响

不同营养条件对大肠埃希菌生物膜形成的影响摘要】目的：分析不同营养条件对大肠埃希菌生物膜形成的影响。

方法：收集3株大肠埃希菌（25922），均对其实施血平板培养。

在分别在复温30min、1h以及6h的营养条件下对其生长情况，尤其是生物膜形成情况进行观察和分析。

结果：在复温30min后，大肠埃希菌菌落有所生长，在复温1h后的菌落数量最多，在复温6h后菌落数量有所下降。

并且在使用瑞氏吉姆萨染色法检查后显示，在复温1h后的生物膜厚度明显高于复温30min以及复温6h，差异均显著（P＜0.05）。

结论：在复温1h的营养条件下，更有利于大肠埃希菌生物膜形成。

【关键词】不同营养条件；大肠埃希菌；生物膜形成；影响【中图分类号】R574 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2018）17-0180-02大肠埃希菌是临床较常见的致病菌，诸多感染类疾病和大肠埃希菌均有较大关系[1]。

因而对大肠埃希菌生物膜形成情况进行分析有着更加重要的意义。

本研究分析了不同营养条件对大肠埃希菌生物膜形成的影响，具体报道如下。

1.对象和方法1.1 对象大肠埃希菌选择为ATCC25922冻干菌株，生产厂家南京便诊生物科技公司。

试剂选择为梅里埃诊断产品（上海）有限公司生产的革兰氏阴性细菌药敏卡片，珠海贝索生物技术有限公司生产的染液。

培养基选择为郑州安图生产的血平板。

比色仪器选择迈瑞2000生化仪。

抗生素选择为美国Invivogen公司生产的zeocin，紫色结晶液生产厂家为北京路桥公司。

1.2 方法分别对不同的大肠埃希菌进行30min、1h以及6h的复温处理，其余培养方法相同。

在培养24h后，需分析其生物膜的形成情况。

在生物膜半定量检测中，本研究中使用免疫比浊法进行研究，在实际的检测过程中须严格按照迈瑞2000生化仪说明书中的步骤进行，使用生理盐水对有利细菌进行清洗处理，并实施瑞氏吉姆萨染色，在实施1min的染色后将吸出，使用生理盐水对其进行彻底冲洗，并放置1h，当完全干燥后加入二甲基亚砜200μl，检测A550值，结果取平均值。

红霉素对生物膜内铜绿假单胞菌药敏的影响

红霉素对生物膜内铜绿假单胞菌药敏的影响孙安志;温红侠;王晓辉【摘要】目的：研究红霉素（E M ）在体外抑制铜绿假单胞菌（P ．a ）形成生物被膜（B F ）的同时，对BF内P ．a抗生素敏感性的影响。

方法：①构建体外PA O1生物被膜模型；②倍稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）；扫面电镜（SEM）观察载体表面BF形态；连续稀释法行活菌计数。

K-B纸片扩散法行药敏实验。

结果：建模3d、7d ，EM 组载体表面BF少于空白对照组，活菌计数少于空白对照组。

EM 组环丙沙星、头孢他啶和氨曲南对早期BF内 P ．a抑菌圈直径大于空白对照组（ P＜0．05）。

EM 组头孢吡肟、环丙沙星和左氧氟沙星对晚期BF内P ．a抑菌圈直径明显小于空白对照组（P＜0．01），但是头孢他啶抑菌圈直径明显增大（P＜0．05）。

结论：EM 抑制PAO1生物膜的形成同时，随着EM 作用时间的延长，环丙沙星、左氧氟沙星、头孢吡肟对BF内P ．a的敏感性降低。

【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2014(000)008【总页数】3页(P1036-1038)【关键词】假单胞菌 ,绿铜 /药物作用;红霉素【作者】孙安志;温红侠;王晓辉【作者单位】西电集团医院西安710077;西安交通大学医学院第二附属医院;陕西省人民医院【正文语种】中文【中图分类】R378.991铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P．a）是有引起有基础病变患者社区获得性感染和医院获得性感染的重要条件致病菌。

由于P．a易形成生物被膜（Biofilm，BF），因此该感染具有一定的难治性，且易转化为慢性感染，并对危重患者造成了一定的生命威胁。

已有多项资料研究证明14、15元环大环内酯类抗生素如红霉素、阿奇霉素等可以抑制和破坏P．a BF的作用，阿奇霉素与其他有抗铜绿假单胞菌活性抗生素有协同作用。

但亦有报道由于阿奇霉素的广泛使用，导致多重耐药菌株的产生［1］。

不同培养时间对大肠埃希菌生物膜形成影响_任伟

响。方法运用菌落计数测定及扫描电镜观察生物膜内大肠埃希活细菌量及生物膜的变化。结果 3 次建模测定的第 5、7、10 d 的实际菌落计数分别为（ 1. 72 ± 2. 14） × 105 、（ 1. 18 ± 1. 32） × 105 、（ 5. 45 ± 6. 84） × 104 CFU / cm2 ，生物膜细菌平均标准菌落计数分别为（ 4. 98 ± 0. 47）、（ 4. 82 ± 0. 46）、（ 4. 43 ± 0. 52） lg CFU / cm2 ，总体差异有统计学意
义（ F = 5. 10，P = 0. 01），第 5、7 d 比较差异无统计学意义，两者分别与第 10 d 比较，差异均有统计学意义（ P ＜
0. 05）；扫描电镜观察，持续灌流 5 d 的 Teflon 管腔内表面，生物膜细菌间粘丝样胞外基质形成并交联呈网状，细菌
紧密黏附；灌流 7 d，胞外多聚物基质黏附单个细胞形成微生物菌落；灌流 10 d 则形成稳定成熟的生物膜。结论
作者单位： 1. 郑州市儿童医院质控部，河南 450053； 2. 南方医科大学南方医院； 3. 南方医科大学护理学院
作者简介：任伟（ 1969 －），女，河南郑州人，主管护士，硕士，研究方向：感染控制。
通讯作者：蔡文智，E-mail： caiwenzhi2002@ hotmail． com
Key words： biofilm； endoscope； Escherichia coli； incubation time； viable bacteria count； scanning electron microscope （ SEM）
细菌生物膜是由细菌及其自身分泌的胞外多聚物（ extracellular polymeric substance，EPS）基质所组成，不可逆地粘附于非生物或生物表面［1］，保护细菌免于环境影响并增加细菌对杀菌剂的抵抗性［2］。生物膜内细菌的抵抗力较浮游细菌强 1 000 倍［3］。有研究发现［4］，生物膜的形成能明显降低消毒剂的效果。本研究旨在通过建立一种密闭式连续循环培养系统制备大肠埃希菌生物膜模型，探讨不同培养时间对生物膜形成的影响，为控制和清除内镜管腔内的生物膜提供科学依据，从而更好地防止交叉感染，保证医疗安全。