《蛋白质样品的制备》PPT课件
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蛋白质样品制备技术课件
防止蛋白质降解
尽量缩短采集和保存的时间，避免蛋 白质在体外长时间暴露导致降解。
03 蛋白质样品的分 离与纯化
蛋白质样品的分离
01
02
03
04
细胞破碎
通过物理或化学方法破碎细胞， 释放出细胞内的蛋白质。
离心分离
利用离心机将细胞碎片与蛋白 质分离。
沉淀法
通过加入盐、有机溶剂等使蛋 白质沉淀。
膜过滤
利用膜的孔径大小将蛋白质与 其他杂质分离。
05 蛋白质样品的分 析与鉴定
蛋白质样品的分子量测定
总结词
分子量测定是蛋白质样品鉴定的基本步 骤，通过测定可以了解蛋白质的相对分 子质量，有助于进一步分析蛋白质的结 构和功能。
VS
详细描述
常见的蛋白质分子量测定方法有SDSPAGE、质谱技术和光散射技术等。SDSPAGE通过电泳分离蛋白质并依据相对迁 移率与分子量的关系进行测定；质谱技术 利用离子化后蛋白质离子的质量进行分析； 光散射技术则是利用散射光强与分子量的 关系进行测定。这些方法各有优缺点，应 根据具体情况选择合适的方法。
蛋白质样品的纯化
凝胶电泳
利用蛋白质带电性质在电场中迁移，实现蛋 白质分离。
亲和色谱
利用蛋白质与配体之间的特异性结合进行分 离。
色谱技术
利用不同物质在固定相和流动相之间的吸附、 分配等性质差异进行分离。
高效液相色谱
结合了色谱技术和电泳技术的优点，具有高 分辨率和高效分离效果。
分离与纯化过程中的质量控制
蛋白质样品的等电点测定
总结词
等电点测定是蛋白质样品鉴定的关键步骤， 通过测定可以了解蛋白质的电荷性质，有助 于进一步分析蛋白质的生物活性和相互作用。
详细描述
蛋白质的研究方法优秀课件.ppt
就是利用SDS的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白 完全变性的特性。
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
蛋白质的研究方法优秀课件
18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
蛋白质的研究方法优秀课件
22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
蛋白质的研究方法优秀课件
25
#
蛋白质的研究方法优秀课件
26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
蛋白质的研究方法优秀课件
5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
蛋白质的研究方法优秀课件
这样经过SDS变性的蛋白质在电场中完全按大小分离开。
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18
非离子去污剂：
相对温和，一般不会使蛋白质变性。只是将蛋白质 分子从膜上溶解下来而已。
➢当[去污剂]＜其CMC值的时候，去污剂分子与膜蛋 白表面的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解 而不聚集。 ➢当[去污剂]≧其CMC值的时候，去污剂分子将与膜 磷脂一起形成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的 形式存在。
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22
细胞碎片的去除——离心( centrifugation)
原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度 的颗粒（如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子 等）沉降到试管的底部的速度是不一样的，质 量越大、或密度越高沉降的速度越快。
沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的 底部形成；
蛋白质颗粒表面有一层水膜，也称水化层。水化层 的存在使蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒 而沉淀。
蛋白质有两性解离性质。如果溶液的PH值偏离了PI， 所有分子都带相同电荷，又会进一步增进它们的分 散能力。
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25
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26
等电点（PI）：
1.能破坏蛋白质分子水化作用 2.是减弱分子间同性相斥作用的因子
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5
制备过程中注意事项：
要求自始至终保持在天然状态
• 避免一切过激因素如：过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。
2. 通常都在低温条件下操作。
3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高
水平。
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《蛋白质的分离纯化》PPT课件
蛋白质的理化性质及分离纯化
精选课件ppt
1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
精选课件ppt
2
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
精选课件ppt
40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
精选课件ppt
11
5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
43
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
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1
第一节 蛋白质的理化性质 第二节 蛋白质的分离纯化 第三节 蛋白质的分子量测定 第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定
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2
第一节 蛋白质的理化性质
一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的紫外吸收性质 三、蛋白质的胶体性质和沉淀 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的呈色反应
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40
等电聚焦电泳装置
实际上是利用缓冲液在 电场作用下在凝胶内沿电场 方向制造一个pH梯度。所 用的缓冲液是低分子量的有 机酸和碱的混合物，该混合 物称之两性电解质。
当蛋白质样品在这样的
凝胶上电泳时，每种蛋白质
都将迁移至与它的pI 相一
致的pH处，具有不同pI的
各种蛋白质最后都迁移至凝
当 pH < pI， 蛋白质带正电荷与
生物碱试剂
反应
某些酸根负离子
不溶性沉淀
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11
5. 加热变性沉淀法
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 当蛋白质处于等电点时,加热凝固最完全和最迅速。
加热变性引起蛋白质凝固的原因：
可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外 露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破 坏了带电状态。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等
电点相同而分子量不同的蛋白质分精选开课件。ppt
43
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
特种多缓冲液 混和蛋白质样品
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
特种多 缓冲液
PH 降低
换特 剂种
多 缓 冲 交
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
《蛋白质的提取》PPT课件
血红蛋白的分离和纯化红细胞离心破碎红细胞释放血红蛋白从各红细胞的成分中获取血红蛋白离心初步纯化血红蛋白透析精选ppt48精选ppt49精选ppt50精选ppt51精选ppt52精选ppt53精选ppt54精选ppt55精选ppt56精选ppt57精选ppt58精选ppt59精选ppt60精选ppt61比较项目实验原理方法步骤适用范围水蒸气蒸馏法萃取法压榨法利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来使芳香油溶解在有机溶剂中蒸发后得到芳香油通过机械加压压榨出果皮中的芳香油水蒸汽蒸馏分离油层除水过滤粉碎干燥萃取过滤浓缩石灰水浸泡漂洗压榨过滤静臵再次过滤提取玫瑰油薄荷油等挥发性强的芳香油原料颗粒尽可能细小能充分浸泡在有机溶剂中适用于柑橘柠檬等易焦糊原料的提取精选ppt62精选ppt63采集玫瑰花
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46
本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化
获取 红细胞 （离心）
破碎红细胞， 释放血红蛋白
从各红细胞 的成分中获 取血红蛋白 （离心）
初步纯化 血红蛋白 （透析）
精选课件ppt
47
从生物材料中提取某些特定 成分
精选课件ppt
48
背景知识
早在古代，人类就已发现芳香气味 的植株或花卉能使人神清气爽，将这些 植物制成干品后，可当做药物和香料使 用。但是，植物香料易挥发，不易储存。 欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植 物芳香油提取技术的诞生。
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34
血清蛋白参考值
清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白
等电点 4.64
分子量 （kDa）
69
5.06
200
5.06
300
5.12
90~150
6.85
156~950
精选课件ppt
46
本节内容目标：血红蛋白的分离和纯化
获取 红细胞 （离心）
破碎红细胞， 释放血红蛋白
从各红细胞 的成分中获 取血红蛋白 （离心）
初步纯化 血红蛋白 （透析）
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47
从生物材料中提取某些特定 成分
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48
背景知识
早在古代，人类就已发现芳香气味 的植株或花卉能使人神清气爽，将这些 植物制成干品后，可当做药物和香料使 用。但是，植物香料易挥发，不易储存。 欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植 物芳香油提取技术的诞生。
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34
血清蛋白参考值
清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白
等电点 4.64
分子量 （kDa）
69
5.06
200
5.06
300
5.12
90~150
6.85
156~950
蛋白质组学课件样品制备-中文
基因组学（Genomics）
转录组学（Transcriptomics）
蛋白质组学（Proteomics）
代谢组学（Metaboliomics）
系统生物学
脂类组学（Lipidomics）
……
蛋白质组学分类： 细胞蛋白组学(Cell Proteomics)
结构蛋白组学(Structural Proteomics)
功能蛋白组学(Functional Proteomics) 磷酸化蛋白组学(Phosphoproteomics) 临床蛋白组学(Clinical Proteomics) 毒理蛋白组学(Toxicoproteomics) ……
蛋白质组学
基本生物问题
翻译后修饰 蛋白质-蛋白质相互作用 基因组-转录组-蛋白质组 临床问题
并且技术的难度也远远大 于基因组的研究技术；
蛋白质组研究技术可以简 单地分为两大类：蛋白质 组分离技术，蛋白质组的 鉴定技术，其核心是质谱 技术。
蛋白质组学与基因组学研究互补与互助
在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已 知基因组的基因数据的比较
蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注 释的正确率
“组学”时代
空间定位密切相关；
许多蛋白质在细胞内不是静 止的，他们常常在不同的亚 细胞环境里运动而发挥作用； 细胞的信号传导和转录调控
也常常依赖于蛋白质的变化 和运动。
基因组
孤立行为
基因组表达的各种
蛋白组
蛋白质组中的各种蛋白质 却是彼此间有着广泛的相 互作用； 蛋白质互作的研究有两类： 第一类是研究蛋白质相互
疾病生物标志物-诊断 疾病的机理 药物目标-治疗
蛋白质组学
确定蛋白质组 鉴定 定量 定位 修饰 相互作用 功能
转录组学（Transcriptomics）
蛋白质组学（Proteomics）
代谢组学（Metaboliomics）
系统生物学
脂类组学（Lipidomics）
……
蛋白质组学分类： 细胞蛋白组学(Cell Proteomics)
结构蛋白组学(Structural Proteomics)
功能蛋白组学(Functional Proteomics) 磷酸化蛋白组学(Phosphoproteomics) 临床蛋白组学(Clinical Proteomics) 毒理蛋白组学(Toxicoproteomics) ……
蛋白质组学
基本生物问题
翻译后修饰 蛋白质-蛋白质相互作用 基因组-转录组-蛋白质组 临床问题
并且技术的难度也远远大 于基因组的研究技术；
蛋白质组研究技术可以简 单地分为两大类：蛋白质 组分离技术，蛋白质组的 鉴定技术，其核心是质谱 技术。
蛋白质组学与基因组学研究互补与互助
在质谱测定蛋白质的过程中，离不开对已 知基因组的基因数据的比较
蛋白质组的数据可以帮助大大提高基因注 释的正确率
“组学”时代
空间定位密切相关；
许多蛋白质在细胞内不是静 止的，他们常常在不同的亚 细胞环境里运动而发挥作用； 细胞的信号传导和转录调控
也常常依赖于蛋白质的变化 和运动。
基因组
孤立行为
基因组表达的各种
蛋白组
蛋白质组中的各种蛋白质 却是彼此间有着广泛的相 互作用； 蛋白质互作的研究有两类： 第一类是研究蛋白质相互
疾病生物标志物-诊断 疾病的机理 药物目标-治疗
蛋白质组学
确定蛋白质组 鉴定 定量 定位 修饰 相互作用 功能
蛋白质的研究方法与原理课堂PPT
30
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）
第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳--PI 第二向采用SDS一凝胶电泳--分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不 同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率 可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。 是蛋白质组学研究的核心技术。
21
高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）
又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以 液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性 的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相 泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
44
一、凯氏定氮法
凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%， 通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。
基本操作过程：
①用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被 还原成NH3 ，并形成(NH4)2SO4 ； ②加入强碱，使硫酸铵释放出NH3，并将NH3收集在无机酸液中； ③用标准碱溶液滴定，确定NH3量； ④根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。
36
3. 胶束电动毛细管色谱（Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）
45
(1) H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (2) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (3)(NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3
双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）
第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳--PI 第二向采用SDS一凝胶电泳--分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不 同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率 可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。 是蛋白质组学研究的核心技术。
21
高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLC）
又称“高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以 液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性 的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相 泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后， 进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
44
一、凯氏定氮法
凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%， 通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。
基本操作过程：
①用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被 还原成NH3 ，并形成(NH4)2SO4 ； ②加入强碱，使硫酸铵释放出NH3，并将NH3收集在无机酸液中； ③用标准碱溶液滴定，确定NH3量； ④根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。
36
3. 胶束电动毛细管色谱（Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC）
45
(1) H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (2) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (3)(NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3
蛋白质样品制备技术(共53张PPT)
20mmol/L DTT 的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或 冻干去除残留的丙酮。此方法仍然存在难再溶的现象。
⑸ 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
这对于杂质含量高的植物样品很有效。
蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从 酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几 次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但 是这种方法比较复杂，并且耗时较多。
脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进
行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细
胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些
蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织
培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分
析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、
完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合
起来应用。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
样品制备的原则
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。
➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制 剂以防止蛋白的降解。
➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反复冻融已 制备好的样品。
➢ 通过超速离心清除所有的杂质。
➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。
⑸ 用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
这对于杂质含量高的植物样品很有效。
蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸铵从 酚相中沉淀蛋白。这些沉淀在甲醇中用醋酸铵洗涤几 次，然后用丙酮清洗，残留的丙酮通过蒸发除去。但 是这种方法比较复杂，并且耗时较多。
脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进
行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细
胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些
蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织
培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分
析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、
完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合
起来应用。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
样品制备的原则
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。
➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制 剂以防止蛋白的降解。
➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反复冻融已 制备好的样品。
➢ 通过超速离心清除所有的杂质。
➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。
蛋白质样品的制备24
• 分离土壤植物病原细菌使用放线菌酮（ 环已酰胺）或新霉素。
2020/4/26
2020/4/26
• 硫化氢试验 • 尿素酶试验
+（FeS黑色）
2020/4/26
3．尿素分解试验
变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨， 培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红 色，由此区别于沙门氏菌。 幽门螺杆菌C14尿素呼气检测试验
2020/4/26
2020/4/26
气相、液相色谱法通过对细菌
2020/4/26
红霉素
• 细菌素（Bactericin）:某些细菌能产 生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为 蛋白类物质，抗菌范围很窄，无治 疗意义，但可用于细菌分型和流行 病学调查。 细菌素以生产菌而命名。大肠 杆菌产生的细菌素称大肠菌素，绿 脓杆菌产生的称绿脓菌素，霍乱弧 菌产生的称弧菌素。
2．蛋白质代谢测定
• （1）吲哚试验（Indol test）：含有色 氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、变形杆菌
等）可分解色氨酸生成吲哚，若加入二
甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫 瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。 （2）硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤
寒杆菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、
甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅 或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅 或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。
分解代谢产物中挥发性或不挥发性 有机酸和醇类的检测，可准确、快 速地确定细菌的种类，是目前进行 细菌生化鉴定的高新技术。
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合成代谢产物
细菌通过新陈代谢不断合成菌体成分， 如多糖、蛋白质、脂肪、核酸、细胞壁 及各种辅酶等。此外，细菌还能合成很 多在医学上具有重要意义的代谢产物。
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• 硫化氢试验 • 尿素酶试验
+（FeS黑色）
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3．尿素分解试验
变形杆菌具有尿素酶，可分解尿素产生氨， 培养基呈碱性，以酚红为指示剂检测呈红 色，由此区别于沙门氏菌。 幽门螺杆菌C14尿素呼气检测试验
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气相、液相色谱法通过对细菌
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红霉素
• 细菌素（Bactericin）:某些细菌能产 生一种仅作用于有近缘关系的细菌 的抗菌物质，称细菌素。细菌素为 蛋白类物质，抗菌范围很窄，无治 疗意义，但可用于细菌分型和流行 病学调查。 细菌素以生产菌而命名。大肠 杆菌产生的细菌素称大肠菌素，绿 脓杆菌产生的称绿脓菌素，霍乱弧 菌产生的称弧菌素。
2．蛋白质代谢测定
• （1）吲哚试验（Indol test）：含有色 氨酸酶的细菌（如大肠杆菌、变形杆菌
等）可分解色氨酸生成吲哚，若加入二
甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫 瑰吲哚，呈红色，称吲哚试验阳性。 （2）硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤
寒杆菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、
甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅 或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅 或硫化亚铁，可借以鉴别细菌。
分解代谢产物中挥发性或不挥发性 有机酸和醇类的检测，可准确、快 速地确定细菌的种类，是目前进行 细菌生化鉴定的高新技术。
2020/4/26
合成代谢产物
细菌通过新陈代谢不断合成菌体成分， 如多糖、蛋白质、脂肪、核酸、细胞壁 及各种辅酶等。此外，细菌还能合成很 多在医学上具有重要意义的代谢产物。
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• 细菌学检查：饮用水、牛奶的大肠菌群 • E.colide 遗传学研究
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例1：培养基中加入适量的青霉素或链霉 素，可抑制细菌和放线菌的生长，从而将 真菌和酵母菌分离出来；
例2：在马丁氏培养基中加入一定量的孟 加拉红染料、链霉素能较好地选择培养真 菌；
例3：YEM(甘露醇酵母粉培养基)加刚果红 或结晶紫可抑制G+细菌的生长。
加富培养基
• 加富培养基(enrichment medium) 也称 增殖培养基，即在基础培养基中加入有 利于某种微生物生长繁殖所需的特殊营 养物质，使这类微生物增殖速度比其它 微生物快，从而使这类微生物在混有多 种微生物的情况下占优势地位。这些特 殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、 动植物组织液或提取物等。
菌苔：把大量分散的纯种细胞密集的 接种在固体培养基的较大表面上， 结果出现大量“菌落”以相互联成 一片，这就是菌苔。
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• 半固体培养基：
无动力 有动力
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• 主要用于细菌的快速分离鉴定急分离筛选某 种特殊代谢产物的菌种。
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伊红美蓝乳糖培养基
• 即EMB(Eosin Methylene Blue)培养基可区分乳 糖发酵菌和半乳糖发酵菌（含有乳糖、盐类和 两种染料）大肠杆菌是乳糖发酵菌，会产生黑 色菌落或金属光泽的菌落。而伤寒沙门氏菌是 非乳糖发酵菌，菌落无色。
3. 非溶血作用——培养基无变化
4. 巧克力培养基，可提供必需生长因子（流感
嗜血杆菌）
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羊血平板培养基
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3
加富培养基
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4
鉴别培养基
• 鉴别培养基(differential medium) 是用于 鉴别不同类型微生物的培养基。在培养基中 加入某种特殊化学物质，某种微生物在培养 基中生长后能产生某种代谢产物，而这种代 谢产物可以与培养基中的特殊化学物质发生 特定的化学反应，产生明显的特征性变化， 根据这种特征性变化，可将该种微生物与其 他微生物区分开来。
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细菌的菌落
• 光滑型菌落（smooth colony）S型菌落 • 粗糙型菌落（rough colony）R型菌落 • 粘液型菌落（mucoid colony）M型菌落
如产荚膜的菌落表面光滑，粘稠状为光滑 型（S-型）。不产荚膜的菌落表面干燥、 皱褶为粗糙型（R-型）。
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细菌在培养基中的生长情况
• 液体培养基：表面生长 均匀混浊生长 沉淀生长
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• 固体培养基：菌落，菌苔
菌落在微生物学工 作中，主要用于微 生物的分离、纯化、 鉴定、计数等研究 和选育种等的实际 工作。
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菌落的形成
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菌落
• 如果把单个细菌的细胞接种到适合的固体培 养基上后，在适合的环境条件下细胞就能迅 速生长繁殖，繁殖的结果是形成一个肉眼可 见的细胞群体，我们把这个细菌的细胞群体 称为菌落（colony）
• 不同菌种其菌落特征不同，同一菌种因不同 生活条件其菌落形态也不尽相同，但是同一 菌种在相同培养条件下所形成的菌落形态是 一致的，所以菌落形态特征对菌种的鉴定有 一定的意义。
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菌落的特征
• 菌落特征包括菌落的大小、形态（圆形、 丝状、不规则状、假根状等），侧面观 察菌落隆起程度（如扩展、台状、低凸 状、乳头状等），菌落表面状态（如光 滑、皱褶、颗粒状龟裂、同心圆状等）， 表面光泽（如闪光、不闪光、金属光泽 等），质地（如油脂状、膜状、粘、脆 等），颜色与透明度（如透明、半透明、 不透明等）
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加富培养基
• 在胰蛋白胨琼脂或培养液加入各物质以供营养 柠檬酸盐血的胰 蛋白胨琼脂中发生不同的溶血作用而用于菌种 鉴定，有三种溶血方式：
1. α-溶血作用——菌落周围绿色至棕色的晕
2. β-溶血作用——血细胞完全溶解，导致菌落周 围的清晰的透明圈（金黄色葡萄球菌）
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铜绿假单孢菌的菌落特征 粘质沙雷氏菌的菌落特征
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放线菌的菌落特征 ① 菌落相对于其它细菌来说较小； ② 菌落质地致密，表面光平或有许
多皱折； ③ 在放大镜下观察，菌落外围具辐
射状菌丝。
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大肠杆菌在EMB平板上的典型菌落
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菌苔