水质 粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
环境水样品中大肠杆菌及粪(耐热)大肠杆菌的检测
环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用水果湖样点水样）。
本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，37℃下培养24h，观测结果。
产酸产气为阳性结果，不产酸产气为阴性。
将阳性管中菌液取定量接种于EC肉汤培养液中，45℃下培养24h，观测结果。
产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。
将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，于对应温度下培养24h，镜检。
根据菌落形态和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。
根据大肠杆菌阳性管数的MPN检索可查水样中总大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。
再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)对比，判定水质。
【关键词】环境水样大肠杆菌耐热大肠杆菌多管发酵法最大或然数（MPN）产酸产气【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，使两种染料结合成复合物，使菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。
耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，由于它多见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。
当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。
【材料与方法】：（一）材料乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管20支）EC肉汤培养基：胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管10支）伊红美蓝培养基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml （150ml/瓶）4.5 mL无菌水：4支（二）器材无菌1 mL移液管：4支；40~200 微升移液器、吸气器：各1支；200微升无菌Tip：20只；载玻片和盖玻片若干；革兰氏染色各试剂；培养皿若干套；酒精灯；显微镜等（二）原理及方法1、样品的稀释和培养：取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成 10-1样品；再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。
水中粪大肠菌群的测定
初 发 酵 阳 性 结 果
A组 共6 （初）阳性数：5 现象：变乳黄色，产气
初 发 酵 阳 性 结 果
B组 共6管 （初）阳性数：5 现象：变乳黄色，产气
初 发 酵 阳 性 结 果
C组 共6管 （初）阳性数：2 现象：变乳黄色，产气
复 发 酵 阳 性 结 果
C组 共2管 （复）阳性数：2 现象：产气
试剂
仪器设备
单倍乳糖蛋白 胨培养液 三倍乳糖蛋 胨培养液 EC培养液
试管 移液管 漏斗 天平 高压灭菌锅 超净工作台 接种环
实验步骤
培养基的制备 初发酵 复发酵
培养基的制备
1、乳糖蛋白胨培养液 （1）单倍乳糖蛋白胨粉 单倍乳糖蛋白胨培养液 +小倒管（10ml/支，共12支） （初发酵阶段用） （2） 三倍乳糖蛋白胨粉 三倍乳糖蛋白胨培养液+小倒管（5ml/支，共6支） （初发酵阶段用） 2、EC培养粉
序号
备注
①
②
B
10
6
0
2
200
③
C
1000
2
2
结果报告
v 查MPN表，计算MPN值 MPN=2×10÷1×10＝200个／L
v 根据地表水环境质量标准（GHZBI-1991）中， 对环境质量卫生指标粪大肠菌群项目做出明确规 定：
Ⅰ类水质标准值≤200个／L
讨论题
配制好的培养基保存多少时间？存放时应注意哪 些事项？
配制好的培养基不宜保存过久，以少量勤配为宜。 已灭菌的培养基可在4—100C存放一个月。存放 时应避免阳光直射，并且避免杂菌侵入和液体蒸 发。
4.6g----200ml
3.45g----50ml
大肠菌群检验作业指导书 (1)
有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定大肠菌群的检验方法，以按标准化进行操作。
2 适用范围适用于大肠菌群检验。
3 术语大肠菌群：在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌。
4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图无6 作业内容6.1 设备和材料净化工作台、培养箱（36±1℃）、新飞展示柜（0-10℃）、刻度吸管（10mL）、试管（18×200mm）、酒精灯、镊子、放大镜、培养皿、三角瓶（500mL）、显微镜等、40孔口的试管架、洗耳球等实验器材6.2 培养基和试剂75%酒精、生理盐水（0.9%）、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液等培养基及试剂。
6.3 操作步骤6.3.1 样品处理一般情况下，产品没有受到污染，按照以下方法检验：取待检样品10mL接种于含10mL双料乳糖胆盐发酵管内,接种5管，置于36±1℃生化培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，按下列程序进行。
6.3.2 分离培养从产酸产气的发酵管中用接种环挑取样液，划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃生化培养箱内，培养18-24h。
取出观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
6.3.3 证实试验有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页用接种环挑取疑似大肠菌群菌落（菌落呈黑紫色，表面有金属光泽），接种于乳糖发酵管内，置36±1℃生化培养箱内培养24±2h。
同时对上述可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
6.3.4 MPN值计算及报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL样品中大肠菌群的最可能数。
方法验证水质的粪大肠菌群
方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。
2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。
44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。
通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
3.主要仪器3.1 净化工作台。
3.2 立式高压蒸汽灭菌器。
3.3恒温恒湿培养箱。
3.4电热恒温鼓风干燥箱。
3.5电子天平。
3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。
4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。
5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。
对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。
当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。
按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。
水质 粪大肠菌群(一般水样)测定作业指导书
水质粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。
在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。
一般水样特指除医院污水外的各种水样。
本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。
1.2方法原理多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002）表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005）a 加工、烹调及去皮蔬菜b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001）2分析方法2.1方法名称、方法来源及适用范围方法名称：多管发酵法方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。
接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
粪大肠杆菌群测定方法
水质粪大肠菌群的测定℃温度下能发展并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群.用进步造就温度的办法,造成晦气于来自天然情形的大肠菌群发展的前提,使造就出来的菌重要为来自粪便中的大肠菌群,从而更精确地反应出水质受粪便污染的情形.粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法.第一篇多管发酵法1. 实用规模本尺度实用于地表水.地下水及废水中粪大肠菌群的测定.2. 道理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN来暗示实验成果的.现实上它是依据统计学理论,估量水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种办法.假如从理论上斟酌,并且进行大量的反复检定,可以发明这种估量有大于现实数字的偏向.不过只要每一稀释度试管反复数量增长,这种差别便会削减,对于细菌含量的估量值,大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度.是以在实验设计上,水样磨练所请求反复的数量,要依据所请求数据的精确度而定.3. 造就基和试剂本尺度所用试剂除尚有注明外,均为相符国度尺度的剖析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水.3.1单倍乳糖蛋白胨造就液：成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨.牛肉浸膏.乳糖.氯化钠加热消融于1000mL 蒸馏水中,调节pH为7.2～7.4,再参加 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用.3.2 三倍乳糖蛋白胨造就液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外）,配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨造就液,制法同上.3.3 EC造就液：成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4） 4g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加热消融,然后分装于含有玻璃倒管的试管中.置高压蒸汽灭菌器中,115℃灭菌20min.灭菌后pH应为6.9.3.4 造就基的存放在密封瓶中的脱水造就基成品要存放在大气湿度低.温度低于30℃的暗处,存放时应防止阳光直接照耀,并且要防止杂菌侵入和液体蒸发.当造就液色彩变更,或体积变更显著时放弃不必. 4. 步调4.1 水样接种量将水样充分混匀后,依据水样污染的程度肯定水样接种量.每个样品至罕用三个不合的水样量接种.统一接种水样量要有五管.相对未受污染的水样接种量为10mL.1mL.0.1mL.受污染水样接种量依据污染程度接种1mL.0.1mL.0.01mL或0.1mL.0.01mL.0.001mL等.应用的水样量可参考下表1.表1 接种用水量参考表＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿接种量(mL）水样种类检测办法 100 50 10 1 0.1 10-210-310-4 10-5井水多管发酵法×××河水.塘水多管发酵法×××湖水.塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨造就液5mL;如接种量为1mL或少于 1mL,则可接种于通俗浓度的乳糖蛋白胨造就液10mL中.4.2 初发酵实验将水样分离接种到盛有乳糖蛋白胨造就液的发酵管中.在37℃±℃下造就24h±2h.产酸和产气的发酵管标明实验阳性.如在倒管内产气不显著,可轻拍试管,有吝啬泡升起的为阳性.4.3 复发酵实验℃±℃温度下造就24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中造就基液面）.接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中.造就后立刻不雅察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性.5．成果的盘算依据不合接种量的发酵管所消失阳性成果的数量,从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群.接种水样为100mL2份.10mL10份.总量300mL时,查表2可得每升水样中的粪大肠菌群;接种5份10mL水样.5份1mL水样.5份0.1mL水样时,查表3求得MPN指数,MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群.。
水—粪大肠菌群的测定实验作业指导书
粪大肠菌群的测定1、方法依据水质粪大肠菌群的测定多管发酵法 H J/ T 3 47-20072、适用范围本标准适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
3、测定原理多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌的密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验室设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
3、1 单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 1000ml制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
3、2 三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外），配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。
3、3 EC培养液成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾 4g磷酸二氢钾 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000ml制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。
置高压蒸汽灭菌器中，115℃灭菌20min。
灭菌后pH应为6.9。
3、4 培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液的颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
4、步骤4、1 水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样的接种量。
大肠菌群检验作业指导书[1]
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密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码1/81.0 水源水1.1 范围本法适用于天然泉水水源水大肠菌群的检验。
1.2 原理根据大肠菌群细菌具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃培养24h能发酵乳糖并产气的特点，将不同量的水样接种到含乳糖的培养基中，经培养后根据阳性反应结果可测出原水样中大肠菌群的MPN值。
1.3 培养基和试剂1.3.1 乳糖胆盐发酵培养液。
1.3.2 亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）。
1.3.3 灭菌生理盐水。
1.4 仪器1.4.1 超净工作台。
1.4.2 高压蒸汽灭菌锅。
1.4.3 培养箱：36℃±1℃。
1.4.4 冰箱：0℃～8℃1.4.5 电子天平：感量0.1g。
1.4.6 培养皿。
1.4.7 小倒管。
1.4.8 试管：150mm×20mm,140mm×15mm。
1.4.9 吸管：10mL、5mL、1mL。
1.4.10 接种环。
1.4.11 酒精灯。
1.5 检测步骤1.5.1 推测性检验1.5.1.1 吸取10mL水样接种到盛有10mL双料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.2 吸取1mL水样接种到盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，共接种5份。
1.5.1.3 另吸取1mL水样接种到9mL灭菌生理盐水中，混匀，用5mL灭菌吸管吸取5mL稀释液，分别加到5支盛有10mL单料乳糖胆盐发酵培养液中，每管1mL（即0.1mL水样）。
轻摇试管，使液体充分混合，置36℃±1℃培养箱内培养24h。
观察每支管是否产气，若有气体产生该管则为推测性检验阳性。
如不产气则为大肠菌群阴性。
密级一般大肠菌群检验作业指导书生效日期2011年8月1日文件页码2/81.5.2 确证性试验1.5.2.1 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到亮绿乳糖胆盐培养液（BGB）管中，置36℃±1℃培养箱中培养48h。
1.5.2.2 观察BGB管中的产气情况，如有气体产生，就可确定为“大肠菌群阳性”；如无气体产生则为“大肠菌群阴性”。
总大肠菌的测定实验作业指导书
水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质水中总大肠菌群的测定多管发酵法2、适用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的抵抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
不过只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。
4、试剂4.1 乳糖蛋白胨培养液:蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g氯化钠 5g乳糖 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 100ml将蛋白胨、酒肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，与高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
粪大肠菌群检测方法作业指导书
粪大肠菌群检测方法作业指导书(多管发酵法)1、方法原理及适用范围多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2、培养液和试剂2.1单倍乳糖蛋白胨培养液2.2三倍乳糖蛋白胨培养液2.3EC培养液2.4氯化钠3、样品测定3.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一水样接种量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。
受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等。
使用的水样量可参考下表一。
水样种类检测方法接种量（mL）1005110.110-210-310-410-5井水多管发酵法×××河水、塘水多管发酵法×××湖水、塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××如接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml 中。
3.2初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如有倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
3.3复发酵试验轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
水中大肠菌群的检测
水中大肠菌群的检测一、实验目的1、了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
2、了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。
3、掌握大肠菌群对人体健康的影响以及作为水体评价的指标和对象。
4、学习检测水中大肠菌群的方法。
二、实验原理1、大肠菌群大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。
主要生活在大肠内。
在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
所以在平常外界环境中不能正常存活很长。
在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。
若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。
因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。
（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）2、初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。
溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养：（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；（2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。
以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。
（3）48h后仍不产气的为阴性结果。
3、MPN - 概述最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
水质 总大肠菌群测定作业指导书
WJES/QZ-0030-2003文件编号：常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质总大肠菌群测定作业指导书第1页共6页水质总大肠菌群测定作业指导书1含义及执行标准1.1含义总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24小时内产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
1.2方法原理多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准表1-1 总大肠菌群地下水质量分类指标（GB/T 14848-93）ⅡⅢⅣⅤ3.01001003.0表1-2 总大肠菌群生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）表1-3 总大肠菌群渔业水质标准（GB 11607-89）贝类养一般渔业用500-83（）1-4 总大肠菌群船舶污染物排放标准表沿海（距最近陆沿（距最近陆1里以内海里10000（GB 13457-92）禽类屠宰加工、畜类屠宰加工、肉制品加一二三25002500100002分析方法方法名称、方法来源及适用范围2.11WJES/QZ-0030-2003文件编号：常州市武进区环境监测站作业指导书名称：水质总大肠菌群测定作业指导书第2页共6页方法名称：多管发酵法方法来源：《水和废水监测分析方法》(第四版)国家环保总局2002年第五篇第二章五(一) 方法适用范围：此法适用于各种水样（包括底泥）的总大肠菌群测定。
2.2仪器高压蒸汽灭菌器电热干燥箱恒温培养箱显微镜冰箱采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌和山夫登堡沙门氏菌两种对照。
水质粪大肠菌群操作注意事项 作业指导书1
水质粪大肠菌群的测定多管发酵法作业指导书本试验基本操作参照《HJ/T 347—-2007 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行）》制定此作业指导书。
1。
培养基、试剂与仪器本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水;操作者必须建立“无菌概念"和掌握“无菌操作技术",所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌，试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。
单倍乳糖蛋白胨培养液:称取23。
0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的玻璃倒管（杜氏小管)的20x200mm试管中，每试管10ml（注意玻璃倒管中不能有气泡，若出现气泡,可用手指轻弹玻璃管）塞紧塞子，置于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
三倍乳糖蛋白胨培养液：称取69。
0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中(注意煮沸步骤可能糊底，也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代）,其它操作同上.EC 培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管10ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液）,于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
伊红美蓝培养基:称取36。
0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后,分装于三角烧瓶中。
于高压蒸汽灭菌器中,在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用.生理盐水:在烧杯中配制适量的质量分数为0.9%的生理盐水,分装于试管中，每试管9.5mL,于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min,贮存于暗处备用。
（本实验室中灭菌锅蒸发量为0。
5mL)培养基的存放：在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射,并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
本实验室将培养基放置在4℃冰箱中保存。
水质粪大肠菌群的测定
将10g蛋白胨、3g牛肉寖膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水 中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混 匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 (此溶液用于检验大肠菌群)
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：1.6g溴甲酚紫用无水乙醇定容到100mL。
3.从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大, 放水3~5min,然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌或用70%~ 75%的酒精 对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1min，以充分除去水管中的滯留杂质 。 采样时控制水流速度，小心接入瓶内。
4. 采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用 采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以 免不同层次的搅扰。
无论是哪一种方法，都是利用其可在高温生长并发酵乳糖 产酸、产气的特点，所以实验过程最终要的环节是严格地 控制好温度。
(1) 初发酵
将样品加入
培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠
菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸、产气，产生的酸使溴甲酚紫指
示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。 (
③耐热，在44-44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖。 (耐热大肠菌群)
粪大肠菌群是大肠菌群的一种，是生长于人和温血动物肠道中的一组 肠道细菌，随粪便排出体外，约占粪便干重的1/3以上，故称为粪大 肠菌群。
受粪便污染的水、食品、化妆品和土壤等物质均含有大量的这类菌群。 若检出粪大肠菌群即表明已被粪便污染。
1.
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用
粪大肠杆菌检测作业指导书
粪大肠杆菌检测作业指导书1.试剂及培养基配制1.1试剂配制a)溴甲酚紫乙醇溶液：称取1.6g的溴甲酚紫溶于2~3ml乙醇中，然后用蒸馏水定容到100ml。
b)碳酸钠溶液：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100ml。
1.2培养基的配制1.2.1乳糖蛋白胨培养液：a)成分：蛋白胨10.0g；牛肉膏3.0g；乳糖5.0g；氯化钠 5.0g；溴甲酚紫乙醇溶液1ml；蒸馏水1000ml。
b)制法：将规定量的蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，用碳酸钠溶液调节PH为7.2~7.4。
加入1ml溴甲酚紫乙醇溶液，混匀，分装于置有倒管的试管内（10ml左右）。
置高压蒸汽灭菌器中，于115℃灭菌20min。
1.2.2EC培养基a)成分：胰蛋白胨20.0g；乳糖5.0g；胆盐混合物1.5g；磷酸氢二钾4.0g；磷酸二氢钾1.5g；氯化钠5.0g；蒸馏水1000ml。
b)制法：将上述成分加热溶解，分装于内装倒管的试管中。
灭菌后PH值应为6.9。
此培养基用钱不宜置冰箱，以防检测时出现假阳性。
2.样品采集2.1样品瓶应用可耐灭菌处理的广口玻璃瓶或无毒的塑料瓶。
灭菌前，把具有玻璃瓶塞得采样瓶用铝箔或厚的牛皮纸包裹，瓶颈系一长绳，在121℃经15min高压灭菌。
2.2水样采集开瓶塞时，要连同铝箔一起拿开。
手执长绳的末端，将采样瓶投入选定点的海水内，采集水下约10cm处水样。
采好的水样需盖紧瓶塞，编号瓶号，按表所列项目记录。
水样在瓶内要留下足够的空间以备在检验前摇荡混匀。
该法适用于沿岸水域的采集。
2.3泥样采集用小型底栖生物柱状采泥器或弹簧采泥器采集泥阳，采泥器出水后，在预先选定的泥层中用无菌刮板取一定量的样品置于灭菌容器中。
2.4样品保存和储藏采集的水样和泥样应立即送检，时间不超过2h，否则，应将样品置于冰瓶或冰箱中，但不得超过24h，否则影响检验结果。
3.检验步骤3.1初发酵试验a)以无菌操作方法，等量吸取10ml经充分摇匀的水样，分别加入5支各盛有5ml已灭菌的三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中。
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水质粪大肠菌群（一般水样）测定作业指导书
1含义及执行标准
1.1含义
粪大肠菌群基本性状与总大肠菌群相似，属于总大肠菌群的一部分。
在培养温度为37℃时可检出总大肠菌群的存在，为区别存在于自然环境和温血动物肠道内的粪源性大肠菌群细菌，将培养温度提高倒44.5℃，仍能使乳糖发酵产酸产气的总大肠菌群为粪大肠菌群。
一般水样特指除医院污水外的各种水样。
本实验通过定性区别实验产酸产气，检索MPN表，导出定量的粪大肠菌群结果。
1.2方法原理
多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
1.3水环境质量标准
表1-1 粪大肠菌群地表水环境质量标准（GB 3838-2002）
表1-2 粪大肠菌群农田灌溉水质标准（GB 5084-2005）
a 加工、烹调及去皮蔬菜
b 生食类蔬菜、瓜类及草本水果
表1-3 粪大肠菌群畜禽养殖污染物排放标准（GB 18596-2001）
2分析方法
2.1方法名称、方法来源及适用范围
方法名称：多管发酵法
方法来源：水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）(HJ/T 347─ 2007) 方法适用范围：此法适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2.2仪器
高压蒸汽灭菌器
电热干燥箱
恒温培养箱
冰箱
采样瓶、三角烧瓶、试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高压蒸汽灭菌后于电热干燥箱中烘干。
2.3 标准菌株制备
将标准菌株的母种或稳定工作种接种到单倍乳糖蛋白胨培养液中培养对照控制。
必须包括大肠埃希氏菌、产气场杆菌和山夫登堡沙门氏菌三种对照。
接种完后需记录：母种的来源，母种和工作种的保存方法、保存温度、传代间隔时间、生长培养基及孵育条件，确认试验（存活度、纯度、关键诊断指标等），母种到工作种的传代代数。
2.4培养基
2.4.1 单倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌配制，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.2 三倍乳糖蛋白胨培养液：市售乳糖蛋白胨培养基，按铭牌比例，三倍配制（蒸馏水除外），用定量加液器分装每个试管5ml或每个大试管50mL，加塞，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
2.4.3 EC培养液：市售EC培养基，按铭牌配制，在115℃灭菌20min，用定量加液器分装每个试管10ml，加塞，贮存于暗处备用。
2.4.4 培养基存放于带紫外灯的灭菌物品专用贮藏柜中，当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。
2.5分析步骤
2.5.1 水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一接种水样量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
使用的水样量可参考下表2。
表2 接种用水量参考表
如接种体积为10mL ，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL ；如接种量为1mL 或少于1mL ，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
2.5.2 初发酵试验
吸取适量水样，按相应的比例将其制成1：10和1：100或其他稀释比的稀释样。
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24h ±2h 。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
1:10稀释样品的制作方法为：吸取1mL 水样，注入到盛有9mL 灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。
因此，取1mL1:10稀释样品，等于取0.1mL 水样。
其它稀释比的稀释样品同法制作。
样品为地表水、废水时，取三个接种量，每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需15个试管。
样品为地下水时，取三个接种量，首个接种量为100mL,其他每个接种量的样品分别接种于5个试管内，共需12个试管。
试管内乳糖蛋白胨培养液的浓度与体积应根据接种量确定。
若接种量为100mL ，倒取100mL 样品接种于装有50mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的大试管内；若接种量为10mL ，吸取10mL 样品接种于装有5mL 三倍浓度乳糖蛋白胨培养液的试管内；若接种量为1mL 时，吸取1mL 样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内；若接种量少于1mL 时，吸取1mL 稀释样品接种于装有10mL 普通浓度乳糖胆盐培养液的试管内。
2.5.3 复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h ±2h （水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
3 结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表3 或表4中查得每升水样中的粪大肠菌群。
接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表3 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表4求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L 水样中的粪大肠菌群。
10(mL)
MPN MPN mL =⨯
值指数接种量最大的一管（）
表3、表4 见附件 4质量控制要求 4.1对照控制
采用无菌水作全过程对照控制，当有明显杂菌污染时，表明测定过程某环节无菌性失控，应重新检验；采用阳性、阴性菌株作实验室过程对照控制，当阳性菌株不能生长或阴性
菌株生长时，表明测定过程某环节失控，应重新检验。
4.2精确度
同一实验人员所作前15个阳性水样平行双样结果为X 1i 、X 2i （X 1i 、X 2i ＞0，i ＝1，2，…，15），则精确度判断值＝R ⋅27.3。
（ ，i
i i X X R 21log log -= ）
当分析所得2
1log log X X R -=＞R ⋅27.3表示精密度已失控；否则平行双样
的差距可以接受。
5 数据处理 5.1数据审核
分析结果填写原始记录表与样品送检单，应经科室内部校对、审核后，方可上交。
5.2数据填报
粪大肠菌群报告以个/L 单位填报，当数量在100以内按实有数据报告；大于100采用二位有效数字报告，有效数字后面的数值以四舍五入方法计算，为缩短数字后面的零数可用10的指数形式表示（如报告16，000或1.6×104）。
6 样品采集
6.1采样瓶应经高压或干热灭菌处理后方可使用；
6.2样品含有余氯时采样瓶灭菌前应加脱氯剂，即于500mL 采样瓶中加入0.3mL10%硫代硫酸钠溶液；
6.3样品含铜锌等重金属较高时采样瓶灭菌前应加螯合剂，即于500mL 采样瓶中加入1.0mL15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na 2）溶液；
6.4 同一地点同时采多瓶水样时，细菌学检验水样先采； 6.5采样时，采样瓶不得用水样荡洗；
6.6采样后，样品应2小时内检验，否则，应10℃以下保存且不超过6小时。
7 期间核查
7.1 人员素质
首先要参加省上岗证理论考试，理论考试合格后方能上岗。
同时站内进行操作技能考核、培训，考核合格后方能持证上岗，承但本项分析。
按国家和省环境监测中心的要求，须要进行五年换证的理论考试、操作技能考核。
7.2 仪器设备
臭氧杀菌效果、高压锅压力表指示、恒温培养箱温控情况每年由站质管中心组织持证人员检验、校正，玻璃量具每三年由站质管中心组织持证人员校正。
8分析环境条件控制 8.2仪器设备
∑
==15
1
15
/)(i i
R R
保持实验室环境整洁，定期检查，避免恒温培养箱温控失控，做好仪器设备使用和保养记录。
8.3无菌室
定期采用消毒剂清洁无菌室，定期检查臭氧杀菌效果，保证无菌室微生物实验条件的满足。
8.4分析环境条件检查和记录
每次分析样品时，作无菌室空气细菌培养对照，保证无菌室空气微生物学质量，并做好记录。
编制：日期：
审核：日期：
审批：日期：
修订记录：。