ELISA检测冷沉淀中纤维连接蛋白含量初探讲解

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ＥＬＩＳＡ检测冷沉淀中纤维连接蛋白含量初探

徐树良吴慧民孙启俊（南京红十字血液中心，江苏南京２１０００８）

摘要：目的

探索用ＥＬＩＳＡ检测冷沉淀中Ｆｎ的含量。方法

用Ｆｎ＿ＥＬＩＳＡ试剂、Ｆｎ标准品，建立Ｆｎ．ＥＬＩＳＡ标

准曲线，进行方法学研究。并与常规免疫扩散法作相关比较。结果

Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ重复性好，批内两种浓度的吖分别

为４．５％［而士ｓ＝（２１３０±９６）ｐｇ／ｍ１］，３．８％［而士５＝（１０８６士４１）ｐｇ／ｍ１］；批问Ｃｙ分为５．６％［而士ｓ＝（２１５４士

１２１）ｐｇ／ｍ１］，５．３％［而士ｓ＝（１０９５土５８）ｐｇ／ｍ１］。与常规免疫单扩散法比较，两者相关性好，ｒ—ｏ．８８４４，ｙ—ｏ．７１２７Ｘ免疫单扩散法＋８４３．４。结论

Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ较免疫单扩散法，灵敏、特异、重复性好，结果更客观。

关键词：ＥＬＩＳＡ冷沉淀／纤维连接蛋白中图分类号：Ｒ３９２．３３

文献标识码：Ａ

文章编号：１００４—５４９Ｘ（２００５）Ｏｌ—００３０—０２

１．６实验标本最佳稀释度的选择根据该试剂盒的标准曲线，０Ｄ值在ｏ．８～１．３曲线的斜率最大，且一般的酶标仪酶免试验的０Ｄ值在ｏ．８～１．３最为敏感，将随机抽取的１０份冷沉淀标本用生理盐水作１：２、１；３、ｌ：４、ｌ：５……１：ｌｏ稀释测定，结果标本在５倍稀释后其（）Ｄ值落在ｏ．８～１．３之问，故标本稀释５倍测定。２结果

１．１标本来源５０份标本取自本中心常规制备冷沉淀时，成品混匀后留取的一段辫子。置一８０℃保存备用，

１．２

纤维连接蛋白（Ｆｎ）作为与机体细胞间连接、排列及网状内皮系统的调控关系密切的血液成分，在某些疾病治疗、康复中发挥着重要的作用［１“］。国外已有Ｆｎ纯品供应，国内主要用富含Ｆｎ的冷沉淀制剂作为代用品。笔者用ＥＬＩＳＡ法检测冷沉淀中Ｆｎ的含量，探索建立一套灵敏、特异、准确、客观的检测冷沉淀中Ｆｎ含量的方法．报道如下。１材料与方法

２．１重复性取２份不同浓度的定值标本，同时连续检测１０次，其批内而士ｓ一（２１３０±９６）ｐｇ／ｍｌ。Ｃｙ＝４．５％；勘士

检测试剂

Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ（进口分装，上海森雄科技，批

号０３０９０６０）；Ｆｎ单价抗体和标准参考品（上海生物制品研究所，批号０２０１０８）。

１．３

ｓ一（１０８６士４１）肛ｇ／ｍｌ，吖＝３．８％。

２．２批间差异取Ｆｎ定值标准液随标本连续检测ｌｏ次，计算批间而土ｓ一（２１５４±１２１）ｐｇ／ｍｌ，Ｃｙ＝５．６％；磊士ｓ

＝（１０９８士５８）ｐｇ／ｍｌ，Ｃｙ一５．３％

主要仪器ＧＢ孓自动洗板机（美国产）；ＡＮＴＨ０孓３型

酶标仪（奥地利产）。

１．４检测方法Ｆｎ免疫单扩散法，参照《全国临床检验操作规程》Ｆｎ测定法；Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ严格按试剂说明书操作。

１．５

２．３与免疫单扩散法的比较分别用免疫单扩散法与Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ测定３０份冷沉淀标本，结果见表１。

２．４

Ｆｎ—ＥＬＩＳＡ标准曲线的建立将Ｆｎ标准品（４０００ｐｇ／

ｍｌ冻干粉）加入２００ｐｌ双蒸水溶解，设标准孔８孔，每孔中加入样品稀释液ｌｏｏ肛ｌ。第１孔加标准品１００ｐｌ，混匀后用加样器吸出１００ｐｌ，移至第２孔；如此反复作倍比稀释至第７孔，最后从第７孔中吸出１００ｐｌ弃去。使之体积均为１００ｐｌ；第８孔为空白对照。以下按试剂操作说明书操作，测定结果以标

５０份冷沉淀标本的正常值取冷沉淀标本５０份．用

Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ测定，结果为ｚ士ｓ一（２２３６．Ｏ±１７５．５）肛ｇ／ｍｌ。表ｌ

Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ与免疫单扩法检测冷沉淀中Ｆｎ结果

准品１０００、５００、２５０、１２５、６２、３ｌ、ｏｐｇ／ｍｌ之ｏＤ值在半对数纸上，以标准品浓度为横坐标，０Ｄ值为纵坐标，作出标准曲

线（图１）。

注ｌｙ＝Ｏ．７３２７Ｘ免疫扩散法＋８４３．４

３讨论

Ｆｎ是一种大分子糖蛋白，分血浆型Ｆｎ（ＰＦｎ）和细胞表面型Ｆｎ（ＣＦｎ）。ＰＦｎ由２个亚单位组成，以可溶形式存在于血浆中，是一种冷不溶球蛋白；ＣＦｎ由多个亚单位组成．以不溶形式存在于细胞表面和细胞之间的结缔组织中。Ｆｎ不仅对细胞起支架作用，而且是细胞与细胞间连结的重要因子・

ＲａｔＦｎ浓度（斗ｇ，ｍ１）

它具有类似调理素作用，可促进单核吞噬细胞系的吞噬作用，在炎症和创伤中起修复作用。冷沉淀制剂中含有丰富的

图１Ｆｎ标准曲线

Ｆｎ，作为Ｆｎ的代用品，业已在眼科、骨科、烧伤康复、血液病

万方数据

主垦熊堕壅查！！！！堡；旦蔓！！鲞簦！塑坠也』堡！！型！！！！！垒！堕！！￡！！！！！！ｚ！！！！！！ｙ！！：！！！堕！：！

及新生儿疾病治疗等领域得到较好的应用。因此建立快速、成本提高，这些就其方法学而言，需要进一步的改进。灵敏、特异、准确的Ｆｎ定量检测方法。对于血液成分的质量

控制及临床用量指标都是非常必要的。Ｆｎ定量检测方法文参考文献

献少见，现行方法为《全国临床检验操作规程》推荐的免疫单１唐焕钧，曲洪晶，陈峨．纤维结合蛋白在角膜损伤治疗中的研扩散法．该法操作烦琐、需时长（至少要２４ｈ）．定量检测影响究进展．中国输血杂志１９９６，９（４）：２２２

因素多，其中操作人员的主观因素也常影响结果的正确定２李军，李静旗，白恒美，等．血浆纤维结合蛋白的动态变化在骨量。笔者的实验结果显示，Ｆｎ—ＥＬＩＳＡ方法灵敏、特异，结合折愈合中的临床意义．中国输血杂志，１９９５，８（２２）ｔ５８先进的酶标检测仪使结果较免疫单扩散法更客观、重复性３申法奎，刘焕亮，丁培芳，等．冷沉淀点眼剂治疗角膜损伤的动物好，其平均叫值为４．１５％（３．８％，４．５％）；标本中Ｆｎ含量实验和临床观察．中国输血杂志，１９９０，３（３）ｔ１７５

在（１００～１０００）ｐｇ／ｍｌ内具有良好的线性关系。实验结果还４温建华，刘育霞，马永健，等．富含纤维结合蛋白的冷沉淀滴眼液表明，Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ与免疫单扩散法结果间相关性较好（ｒ—ｏ．治疗角膜损伤的临床观察．中国输血杂志，１９９９，１２（２）：８５

５洪兴金，周华友，林玉贞，等．血浆纤维连接蛋白的动态变化在烧

８８４４）。但同一份标本Ｆｎ－ＥＬＩＳＡ之结果要比免疫单扩散法伤刨面修复中的临床意义．中国输血杂志，１９９８，１１（３）；１５５高．这与两种方法的标准曲线制作、标准品不同及方法的灵６李晓静，王梅，王晓鸥，等．新生儿疾病血浆纤维结合蛋白的检敏度等有关（标准品为试剂盒配备）。因此不同的方法，应当测及替代治疗初探．中国输血杂志，１９９７，１０（３）；１２６