绿色荧光蛋白基因重组与鉴定
实验绿色荧光蛋白
生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。
2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。
3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。
二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。
本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。
再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。
将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达三.实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。
CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定
CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定岳恺;张文超;吴延升;曹晓莉;王旭东【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2010(037)010【摘要】目的:构建CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体并鉴定其在人舌癌细胞株Tb3.1(以下简称Tb3.1)中的表达.方法:设计特定引物,以人基因组DNA 为模板,PCR扩增目的基因CXCL12-KDEL,经纯化的目的基因连接19T载体,插入pIRES2-EGFP表达载体中,使用Bgl Ⅱ/SalⅠ进行双酶切,酶切初步鉴定后,测序鉴定.测序正确的重组质粒经脂质体(LipofectamineTM 2000)介导体外转染Tb3.1,转染48h及72h在倒置荧光显微镜下观察.利用Western-blot检测重组质粒CXCL12-KDEL表达情况.结果:经酶切及测序鉴定证实目的基因(CXCL12-KDEL)已成功扩增并插入重组质粒;重组质粒转染Tb3.1细胞,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blot检测转染可见E-tag蛋白表达.结论:成功构建了CXCL12-KDEL 融合基因绿色荧光蛋白表达载体,为进一步完成CXCL12-CXCR4生物学轴的阻断实验奠定了基础.【总页数】4页(P550-553)【作者】岳恺;张文超;吴延升;曹晓莉;王旭东【作者单位】天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060【正文语种】中文【相关文献】1.利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 [J], 林朝贵;范林;陈良龙2.人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建 [J], 梁旭竞;陈小佳;金玲;李丽玲;汤绍辉;陈友鹏;杨冬华3.nm23-H1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达 [J], 车国卫;周清华;刘伦旭;覃杨;孙芝琳4.单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 [J], 吴映雅;谭宇蕙;宁异真;杜标炎;李杰芬5.原钙黏蛋白7b与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在MCF10A细胞中的表达定位 [J], 陈昂;袁龙;张峥嵘;梁剑青;闫敏;李世崇;王启伟;孙强;刘真真因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定
绿色荧光蛋白GFP多克隆抗体的制备及在多种细胞中的特异性鉴定董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【摘要】绿色荧光蛋白是当前在生物及生物医学研究当中应用最为广泛的一种荧光标记蛋白.为开发一种高灵敏度、高特异性以及简单经济的GFP多克隆抗体,并使之适用于在跨物种细胞里表达的GFP蛋白进行检测,本文利用gfp基因cDNA全序列分别构建了带有6×His和GST标签的原核表达载体pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞进行诱导表达,而后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表达鉴定,分别获得了相对分子质量为2.6×104和5.2×104的重组6×His/GST-GFP融合蛋白.将亲和纯化的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,采集第5次免疫后血清用ELISA测定效价为1﹕32,000.抗血清依次经Protein A亲和纯化和GST-GFP抗原抗体纯化后,用免疫印迹实验(Western blot)方法检测抗体特异性,结果表明制备的多克隆抗体能很好地识别在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的GFP,对继续开展GFP相关研究具有重要意义.%GFP is one of the most popular fluorescent proteins used to detect and quantify targeted proteins in living organ-isms.To develop a high sensitive antibody for its detection or signal capture in di fferent kind of organisms,6×His-tagged and GST-tagged prokaryotic expression plasmids,pET28A-gfp and pGEX-2T-gfp,were constructed,by insertinggfpinto the pGEX-2T and pET28A vectors respectively and then were transformed intoEscherichia coli BL21(DE3)for protein expres-sion. 12% SDS-PAGE analysis results showed that the molecular weights of the fusion protein 6×His-GFP and GST-GFP were2.6×104 and 5.2×104,respectively.The 6×His-GFP fusion protein was purified by affinity adsorption purification to immunize New Zealand white rabbits.The 5th immune serum was collected and the antibody titer was determined to be 1﹕32,000 by ELISA.The antiserum was purified by Protein A affinity adsorption purification and immobilized GST-GFP puri-fication,and the specificity of polyclonal antibodies was evaluated by Western blot in three kind of organisms including chlamydomonas,HEK293 cells and bacteria.Results show that the polyclonal antibody prepared can specifically and pre-cisely bind GFP in all kind of organisms,which can be used for more GFP and GFP related research.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2017(032)002【总页数】6页(P7-12)【关键词】原核表达;蛋白纯化;多克隆抗体;免疫印迹【作者】董彬;胡贺贺;王晶;孟德梅;樊振川【作者单位】食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津300457;食品营养与安全教育部重点实验室,天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457;天津科技大学新农村发展研究院,天津 300457【正文语种】中文【中图分类】Q786绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)于1974年由 Morise等[1]在水母中发现并分离出来．该蛋白包含238个氨基酸，第 65～67位残基(Ser-Tyr-Gly)自发形成荧光发色基团为对羟基本咪唑啉酮[2].直到 1994年，Chalfie[3]首次将绿色荧光蛋白应用在活体当中，在原核细胞大肠杆菌(Escherichia coli)和真核细胞秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)中表达成功，可以通过观察绿色荧光的方法对该蛋白在活体内进行定位．随后通过对GFP的DNA序列进行分析，并对其中一些氨基酸进行替换和突变，证实突变可以导致产生红色荧光的蛋白(red fluorescent protein，RFP)[4]和黄色荧光的蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)[5]．突变蛋白如红色荧光蛋白和黄色荧光蛋白等已经被广泛应用于活体细胞定位、内源蛋白检测以及单分子成像[6]等方面．GFP相对分子质量约为2.6×104，易于与其他蛋白融合表达，对受体细胞无毒副作用，且对其检测方式多样，如可以直接在荧光显微镜中观察其在活体中的定位和定量[7]，亦可进行免疫印迹实验(Western blot)对其进行检测和定量．然而，利用 GFP对相应内源蛋白进行活体定量时，由于活体细胞本身的一些自荧光物质的存在，会对实验结果产生较大影响[8–9]，因而不能对荧光信号进行准确定量．此外，组织或细胞在各种理化处理过程中，GFP易被猝灭，不利于对组织中 GFP标记蛋白进行细胞内定位及所在组织的结构和功能的原位分析[10]．因此，如果有一种对 GFP高灵敏度和高特异性的抗体存在，就可以通过利用免疫印迹方法对 GFP 及其标记蛋白进行定量．目前，抗 GFP蛋白抗体的研究已有很多，存在的问题是大多数多克隆抗体或单克隆抗体仅能对在一种或少数几种细胞内表达的 GFP蛋白进行特异性识别，而对于其他种属细胞内表达的 GFP并不能进行很好的专一性识别，主要原因是细胞背景干扰过高．对于如今科学研究的需要，如果一种抗体可以广泛地应用于检测多种种属细胞，可以显著提高效率，降低成本．目前，能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体还未见报道，而多克隆抗体成本低廉，生产快速的特点引人注目．因此，制备能针对多种种属细胞的 GFP多克隆抗体势在必行，本实验室采用简单和经济的原核表达方法制备了高特异性的 GFP抗体，并运用多种方法对抗体纯化以提高抗体特异性．此外，利用 Western blot在多种属细胞中检测了抗体的特异性，从而为 GFP 作为一种标记蛋白使用提供了一种更为经济有效的检测抗体．1.1 菌株、质粒及实验动物大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-blue、BL21 (DE3)感受态细胞、HEK293细胞、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-125野生藻株和质粒pBSK-gfp、pGEX2T、pET28A均为本实验室保存．新西兰雄性大白兔 2只，1.5～2.0,kg，由天津欧阳实验种兔场提供．1.2 主要试剂蛋白Marker、限制性核酸内切酶、DNA连接酶，美国Thermo公司；DNA marker，北京全式金生物技术有限公司；蛋白纯化用填料 Ni SepharoseTM6,Fast Flow和Glutathione SepharoseTM4B以及抗体纯化介质Protein A SepharoseTMCL-4B，美国GE Healthcare公司；免疫动物用弗式完全佐剂和不完全佐剂，美国Sigma公司；NC膜，美国PALL公司；HRP标记的羊抗兔抗体，美国Jackson Immuno Research公司；ECL显色液，美国Millipore公司；脱脂奶粉，美国 BD公司；曝光底片，美国柯达公司；其他试剂均为国产分析纯．1.3 pGEX-2T-gfp 和 pET28-gfp 原核表达载体的构建以 pBSK-gfp质粒为模板，用上游引物5′-GCGGATCCATGGCCAAGGGCGAGGA-3′(加BamHⅠ酶切位点)、下游引物5′-CTAAGCTTTTACTT GTACAGCTCGTCCA-3′(加HindⅢ酶切位点)进行gfp基因扩增，反应条件为：95,℃ 1,min；95,℃ 30,s、55,℃ 30,s、72,℃ 2,min，30个循环；72,℃ 10,min．取2,μL PCR产物进行0.8%,的琼脂糖凝胶电泳分析．然后再用BamHⅠ和HindⅢ回收的目的基因、pGEX-2T和pET28A载体进行双酶切，然后将带有黏性末端的目的基因和载体用 T4 DNA连接酶连接后，转化入E．coliXL1-blue感受态细胞，挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，酶切和测序验证．1.4 融合蛋白的表达与纯化1.4.1 6×His-GFP和 GST-GFP融合蛋白的诱导表达及鉴定将正确的重组质粒pET28-gfp和pGEX2T-gfp转化至大肠杆菌 BL21(DE3)，分别挑取单菌落于含有100,µg/mL卡那霉素的 LB液体培养基中和含有120,µg/mL氨苄青霉素 LB液体培养基中过夜培养，再以1﹕20的比例放大培养至吸光度为0.6～0.8时，加入0.2,mmol/L IPTG于23,℃诱导6,h使蛋白大量表达，同时设置对照组即不加 IPTG诱导组．离心收集菌体并超声裂解获得全蛋白，全蛋白经4,℃、12,000,r/min离心 15,min后，收集上清液和沉淀．取全蛋白、上清液和沉淀分别与2×蛋白上样缓冲液混合后进行12%, SDS-PAGE电泳检测．1.4.2 6×His-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后，加入到预先平衡好的 Ni Sepharose 6,Fast Flow纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，5,mmol/L咪唑，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，500,mmol/L NaCl，500,mmol/L 咪唑，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白，使用核酸微量测定仪对其进行蛋白浓度测定．将洗脱出的目的蛋白进行12%,的SDS-PAGE分析[11]．1.4.3 GST-GFP融合蛋白的纯化将诱导表达后的菌体进行超声波破碎后，4,℃、12,000,r/min离心 15,min，取上清液用0.45,μm滤膜过滤后加入到预先平衡好的Glutathione SepharoseTM4B纯化柱中，室温结合1,h后使样品流经纯化柱，用洗涤缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，pH 7.4)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl，300,mmol/L NaCl，2,mmol/L MgCl2，10,mmol/L还原型谷胱甘肽，pH 7.4)洗脱并收集目的蛋白．将目的蛋白进一步通过分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化，流量 1,mL/min，将洗脱出的目的蛋白进行12%, SDS-PAGE分析．1.5 多克隆抗体的制备及效价的测定1.5.1 多克隆抗体的制备取2,mg纯化后的6×His-GFP融合蛋白与2,mL弗氏佐剂混合后乳化完全，免疫新西兰大白兔，采用颈背部多点注射法，初次免疫使用弗氏完全佐剂且免疫前耳动脉采血作为阴性对照血清．之后每 10,d进行加强免疫，使用弗氏不完全佐剂，一共加强免疫 4次，最后 1次加强免疫后耳动脉采血，利用间接ELISA法测定抗血清的效价，效价合格后，股动脉采血，4,℃静置过夜后收集血清，分装冻存．1.5.2 多克隆抗体效价的测定本实验采用间接 ELISA法测定抗血清的效价，以 GST-GFP融合蛋白作为包被抗原，用 5%,的脱脂乳粉封闭后，以所得的抗血清为一抗，辣根过氧化物酶(HPR)标记的羊抗兔抗体为二抗，然后经过 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)显色，利用酶标仪测定A450处的吸光度，并计算出抗血清的效价．以实验组血清A450与阴性对照血清A450的比值大于等于 2.0为阳性，其最高稀释度即为抗血清的效价[12–13]．1.6 多克隆抗体的纯化及特异性分析1.6.1 多克隆抗体的纯化分离完的抗血清首先使用Protein A SepharoseTMCL-4B亲和纯化专一性吸附IgG，去除IgG之外的其他抗体分子，纯化条件为：结合缓冲液(12,mmol/LNa2HPO4，8,mmol/L NaH2PO4，pH 7.0)，洗脱缓冲液(0.1,mol/L甘氨酸，pH 2.7)，流量 0.5,mL/min．收集吸收峰对应的洗脱液，用1,mol/L Tris-HCl(pH 9.0)将洗脱液pH调至中性．然后将Protein A SepharoseTM纯化完的抗体采用GST-GFP免疫亲和纯化法进一步纯化：将 GST-GFP融合蛋白固定在硝酸纤维素膜亲和纯化法进一步纯化[14]，随后经Western blot检测多克隆抗体的特异性．1.6.2 抗体特异性检测免疫印迹：取20,μg处理后的含有GFP表达的莱茵衣藻裂解上清液[15]、HEK293细胞裂解上清液[16]和E．coli细胞裂解上清液[17]加入1.5,μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE和电转印后，蛋白转移到NC膜上，5%,的脱脂奶粉封闭；多克隆抗体稀释度 1﹕1,000，二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，稀释度为1﹕5,000，然后曝光压片显影(ECL法)[18]．2.1 pET28A-gfp 和pGEX-2T-gfp 原核表达载体的构建PCR扩增获得723,bp的片段，与GFP预期大小一致．将构建的 pGEX-2T-gfp 和pET28A-gfp重组表达载体进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，均获得条带大小为 723,bp的目的片段，并经测序验证序列完全正确，说明表达载体构建成功(图1)．2.2 融合蛋白的表达与纯化2.2.1 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的诱导表达在IPTG的诱导下，含有pET28A-gfp和pGEX-2T-gfp质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株会大量表达目的蛋白，菌体经超声破碎后获得全蛋白，所得全蛋白经低温高速离心分离上清液和沉淀，然后经电泳、染色、脱色后分别在约2.6×104和5.2×104处可以看到目的蛋白大量表达，且蛋白的表达主要在上清液中，其表达结果如图2所示．2.2.2 6×His-GFP和GST-GFP融合蛋白的纯化6×His-GFP融合蛋白的表达主要为可溶性表达，因此将诱导表达后的菌体经超声破碎以及高速离心后取上清液，于含有Ni SepharoseTM6 Fast Flow填料的重力柱中进行亲和纯化，由于融合蛋白所含有的6×His标签能够特异性与上述填料结合，因此经过洗涤、洗脱等步骤即得到目的蛋白(图3 (a))，可作为免疫动物所用抗原．同时，GST-GFP融合蛋白经亲和纯化后，还有两条杂带(图3 (b))，经分子筛(SuperdexTM-200,pg)进行分离纯化如图4 (a)所示，可以得到较纯的目的蛋白如图4 (b)所示，可作为后续抗体纯化用抗原．2.3 多克隆抗体的制备2.3.1 抗血清效价的检测用纯化得到的6×His-GFP融合蛋白免疫新西兰大白兔，经耳缘静脉少量采血，室温静置 2,h或4,℃过夜后获得析出血清，以间接 ELISA法测定抗血清的效价，利用酶标仪测定A450处的吸光度后计算出抗血清的效价，结果如图5 所示．由图5 可知，1号兔抗血清的效价大于 16,000，2号兔抗血清效价大于32,000，满足实验要求．2.3.2 抗血清灵敏度和特异性检测最终纯化的多克隆抗体能够正确地与莱茵衣藻、HEK293细胞和大肠杆菌中表达的2.6×104大小的GFP蛋白特异结合，证明所制备的多克隆抗体具有很好的特异性，可专一性识别不同种属细胞中表达的GFP蛋白(图6)．GFP现在已经广泛应用在各个物种中作为标记蛋白进行细胞定位以及蛋白分析，因而开发适用于多种属细胞的 GFP抗体是非常有必要的．由于单克隆抗体的生产成本高、生产周期较长，所以开发具有成本优势的 GFP多克隆抗体就显得尤为迫切．本研究使用具有表达时间短、表达量高、蛋白较易纯化等优势[19]的大肠杆菌作为抗原制备的宿主．选择6× His(组氨酸)标签[20–21]纯化免疫原蛋白，由于其标签相对分子质量小，对免疫动物产生的免疫反应也比其他如GST、MBP标签小，产生的抗体特异性和灵敏性也会更高，有研究使用 GST-GFP 融合表达后使用凝血酶对融合蛋白进行酶切得到的[10]GFP蛋白作为免疫原，相比这种方法，本研究所采用的小相对分子质量标签亲和纯化后直接免疫动物具有更高效和经济的优势．对于抗血清的纯化，先采用亲和纯化，得到相应的 IgG，随后采用抗原抗体纯化，使用高纯度的GST-GFP融合蛋白作为抗原与亲和纯化后的抗血清进行2次亲和纯化，这种方法能有效地提高抗体的特异性和灵敏度，使最终得到的抗体具有非常高的特异性，而且可以对不同种属来源的 GFP蛋白进行特异性结合．由于 GFP广泛应用在原核和真核细胞中，本研究利用本实验室具有的莱茵衣藻、HEK293细胞以及大肠杆菌这3种来源的表达GFP的宿主对抗体特异性进行测试，结果表明该多克隆抗体特异结合人源、植物源和细菌中来源的表达 GFP蛋白．综上所述，本研究成功制备了 GFP多克隆抗体，并通过免疫印迹实验证实其具有很好的特异性，为 GFP的相关研究提供了实验基础．【相关文献】[1]Morise H，Shimomura O，Johnson F H，et al. 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绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋黑(GFP)基果的克隆、表黑战细提与之阳早格格创做北圆医科大教2011防止医教（卫死考验检疫）纲要脚法：钻研绿色荧光蛋黑（green fluorescent protein，GFP）基果正在大肠杆菌中的基果克隆与重组表黑，以及对于其举止细提与.要收：从E.coli DH5ɑ中用碱提与量粒的要收提与量粒pEGFP-N3战量粒pET-28a.而后用量粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对于已经提与的产品举止电泳，决定从大肠杆菌中乐成提与了量粒.再用节造性内切酶BamHI战NotI对于乐成提与的量粒举止酶切，并对于酶切后的量粒举止琼脂糖凝胶电泳，用以决定已经提与了GFP基果.将含有GFP基果的量粒变化到体验态夸大培植.用IPTG诱导GFP 基果表黑不妨瞅到浅绿色菌降.末尾对于绿色荧光蛋黑举止细提与.论断：本真验有帮于教死掌握最基础的分子死物教真验技能，为进一步的真验奠定前提.关键词汇：绿色荧光蛋黑基果克谨慎组表黑变化细提与目录1 序止32 真验脚法43 真验设备44 资料及试剂55 真验支配步调55.1支配过程55.2量粒DNA的分散与杂化65.2.1 量粒的培植65.2.2 量粒的DNA的碱提与法65.2.3 量粒DNA的审定与杂化75.3酶切及连交85.3.1 单酶切85.3.2 回支酶切产品（采与DNA回支试剂盒举止回支）8 5.3.3 连交95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体战固体培植基的配造（参照附录）95.4.2．体验态细胞的造备 (CaCl2法)95.4.3 变化涂板105.5GFP蛋黑的诱导表黑105.6绿色荧光蛋黑的细提与11参照文件11附录121LB培植基的配造：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE慢冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样慢冲液139．PEGFP-N3量粒齐图谱1310．P ET-28A量粒齐图谱141 序止绿色荧光蛋黑（green fluorescent protein，GFP）是一类存留于包罗火母、火螅战珊瑚等腔肠动物体内的死物收光蛋黑.当受到紫中或者蓝光激励时，GFP 收射绿色荧光.它爆收荧光无需底物或者辅果子收色团是其蛋黑量一级序列固有的.1962 年，下村建仄分散杂化了火母中收光蛋黑火母素，并创造一种绿色的荧光蛋黑.1974年，他们分散得到了那个蛋黑，当时称绿色蛋黑，以去称绿色荧光蛋黑(GFP)[1]GFP 动做一种新的报告基果，其便宜正在于①荧光强度下，宁静性下；②GFP 分子量小，易于混同，适用于多种变化办法，对于受体无毒害，仄安稳当；③出有需要反应底物与其余辅帮果子，受蓝光激励爆收绿色荧光，更加适用于体内的坐即检测；④GFP 出有具备种属依好性，正在多种本核战真核死物细胞中皆表黑；⑤通过替换一些特殊氨基酸，不妨使之爆收分歧颜色的光，进而符合分歧的钻研需要.连年去广大用于基果的表黑与调控、蛋黑量的定位、变化以及相互效用、旗号传播、转染与变化，以及细胞的分散与杂化等钻研范围[ 2～3].采与GFP 动做标记表记标帜基果，可曲交支集变化细胞供真验，支缩了筛选时间、缩小对于细胞活性的效用并可动做活体标记表记标帜，为钻研收育的基果调控战分子体造提供了一种简净灵验的脚法[ 4、5 ].采与基果工程脚法死产GFP标记表记标帜的要收，可建坐一种烦琐、赶快的免疫诊疗技能[6].量粒变化加进大肠杆菌（Escherichia coli）体验态细胞是分子克隆的关键步调[7]，是基果克隆以及DNA文库建坐等钻研中一项要害的惯例支配.暂时，体验态细胞的造备主要采与CaCl2法，该要收支配简朴、简单掌握、重复性佳、变化率下，可广大应用于普遍的真验室.其本理是Ca2+ 损害细胞膜上的脂量阵列，并与膜上多散羟基丁酸化合物、多散无机磷酸产死复合物以好处中源DNA的渗进[8].大肠杆菌是第一个用于重组蛋黑死产的宿主菌，它出有但是具备遗传背景收会、培植支配简朴、变化战转导效用下、死少繁殖快、成本矮廉、不妨赶快大规模天死产脚法蛋黑等便宜[9].而且其表黑中源基果产品的火仄近下于其余基果表黑系统，表黑的脚法蛋黑量以至能超出细菌中蛋黑量的30%，果此大肠杆菌是暂时应用最广大的蛋黑量表黑系统[10].大肠杆菌表黑系统是暂时最时常使用的中源蛋黑表黑系统,大肠杆菌由于遗传背景收会、易支配,以及有洪量可供采用的克隆或者表黑载体,使之成为人们克隆表黑中源基果的主要菌株[11].随着科研的收达，建坐出了多种具备分歧特性的表黑载体战工程菌株，以谦脚表黑分歧本量、央供的脚法基果的需要.正在本核细胞中表黑蛋黑量的载体时常使用开用子有T7开用子、Trp开用子-色氨酸开用子、Tac开用子、T7噬菌体中基果10 的开用子及Lac开用子等.Lac开用子受收会代开系统活化蛋黑战cAMP的正调控战阻拦物的背调控，当加进乳糖或者某些类似物IPTG可与阻拦蛋黑产死复合物，使阻拦蛋黑构型改变，阻拦蛋黑出有再能与把持基果分散，进而使结构基果表黑.根据本核死物基果表黑特性采用载体举止脚法基果克隆，而后转进相映的菌种中表黑脚法蛋黑量[12].钻研绿色荧光蛋黑正在大肠杆菌体内的基果克隆战表黑.通过量粒重组产死所需要的重组量粒pET-28a-GFP，将重组量粒导进大肠杆菌体内，通过酶切及用IPTG诱导检测是可正在大肠杆菌体内诱导表完毕功.根据电泳截止及荧光局里得出论断，重组量粒正在大肠杆菌体内乐成诱导表黑.2 真验脚法教会绿色荧光蛋黑基果表黑载体的建坐及正在大肠杆菌中的表黑所有历程中的每一步，掌握其要收.本真验是通过基果工程脚法对于脚法基果EGFP举止克隆，并举止EGFP表黑载体的建坐，并正在大肠杆菌中诱导表黑，赢得GFP蛋黑.①教会最时常使用的小量造备量粒DNA的碱裂解要收②教会时常使用的DNA琼脂糖凝胶电泳技能③教会用节造性内切酶切割DNA④教会用琼脂糖凝胶中回支DNA片段⑤教会DNA片段的体中连交技能⑥教会用CaCl2法治备大肠杆菌体验态细胞⑦教会用量粒DNA变化体验态受体菌的基础支配技能⑧教会用酶切法筛选重组量粒变化乐成的克隆菌⑨相识中源基果正在本核细胞中表黑的特性战IPTG诱导表黑的要收⑩教习SDS-PAGE 胶的基础灌造要收战用SDS-PAGE 检测表黑蛋黑3 真验设备恒温培植箱，超净台，恒温摇床，造冰机，台式离心机，核酸电泳仪，小型混同器，冰箱，蓝盾可睹光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、造冰机、凝胶成像仪，火浴锅，下压灭菌锅、振荡培植箱，脚持式紫中灯.4 资料及试剂BamH I ；NotI(10U/μL)；T4 ligase ；LB 培植基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE 慢冲液；20×TBE ；GeneFinder-溴酚蓝上样慢冲液.5 真验支配步调5.1 支配过程量粒提与量粒提与酶切回支酶切回支连交图一过程图5.2 量粒DNA的分散与杂化5.2.1 量粒的培植1）正在含有pEGFP－N3量粒的DH5α仄板上菌降上挑与菌种，置于含有5mL LB培植基的试管中.摇摆过夜.2）有pET-28a量粒的仄板上挑与单菌降于其余一个试管中，共样摇荡培植过夜.5.2.2 量粒的DNA的碱提与法1）与1.5ml DH5α培植液倒进1.5mL eppendorf 管（微量离心管）中, 13000rpm离心1min.2）重复1.3）弃上浑,将管倒置于卫死纸上数分钟,使液体流尽.4）菌体重淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下搁置10min.5）加进新配造的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管心，赶快温战颠倒eppendorf 管5次,以混匀真量物(千万出有要振荡),冰浴5min.6）加进150μL预热的溶液Ⅲ,盖紧管心，并倒置离心管，温战振荡3次,使重淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min.7）上浑液移进搞净eppendorf 管中,加进等体积的氯仿/同戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min.8）将火相移进搞净eppendorf 管中,加进等体积的氯仿/同戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min.9）将火相移进搞净eppendorf 管中,加进2 倍体积的无火乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，而后13000rpm离心5min.10）弃上浑,将管心关关倒置于卫死纸上使所有液体流出,加进1mL 70％乙醇洗重淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min.11）吸除上浑液,将管倒置于卫死纸上使液体流尽,室温搞燥.12）将重淀溶于30μL TE慢冲液(pH8.0，含20μg/mL RNaseA)中，保存正在-20℃冰箱中.13）依照共样的过程战要收将pET-28a的量粒也提出去，保存正在-20℃冰箱中.5.2.3 量粒DNA的审定与杂化1)1%琼脂糖凝胶的配造①加20ml 1×TBE慢冲液于三角瓶中，②透彻称与0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至真足熔化，③热却至60℃安排，2)琼脂糖凝胶电泳①沉慢倒进启佳二端战加上梳子的电泳胶板中，静置热却30分钟以上，②将胶板与消启胶戴，搁进电泳慢冲液（TBE）中，使电泳慢冲液刚刚佳出过凝胶约1mm，沉沉革除梳子，③与5μl量粒DNA及2μl GeneFinder混匀上样⑤蓝盾可睹光透射仪瞅察截止.3)回支产品①用搞净的刀片将需要的DNA条戴从凝胶上切下去，称与重量.②以0.1g凝胶对于应300μL的体积加进PN.③50℃火浴搁置10min，功夫出有竭温战上下翻动离心管至胶真足融解.④将上一步得到的溶液加进到一个吸附柱中，吸附柱再搁进支集管，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑤加进800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑥加进500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.⑦将离心吸附柱搁回支集管，13000rpm离心2min.⑧与出吸附柱，搁进一个搞净的离心管中，正在吸附膜的中间位子加进适量洗脱慢冲液EB 30μL，洗脱慢冲液先正在65℃火浴预热，室温搁置2min，13000rpm离心1min，而后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min.⑨置于－20℃保存.5.3 酶切及连交5.3.1 单酶切按如下单酶切体系（30μL）混同:表1 单酶切体系的配造反应物（μL）pEGFP-N3 pET-28a量粒1818BamH I 2 2Not I 2 210×buffer K 3 30.1%BSA慢冲液 3 3灭菌单蒸火至 30ul体系1)离心10s，混匀.2)37℃火浴酶切3-4h.3)配造1.0%（M/V）一般琼脂糖凝胶30ml.4)适合搁置热却，45℃安排倒于电泳胶板上，插佳梳子.5)待凝胶凝固佳以去，拨下梳子.6)酶切样品中加进5µl溴酚蓝-GeneFinder混同液混匀，上样.7)1×TBE Buffer，80V(3-4V/cm)下电泳30min.8)荧光激励器瞅察量粒DNA条戴的酶切情况，并照像.5.3.2 回支酶切产品（采与DNA回支试剂盒举止回支）1)配30mL 1％进心琼脂糖凝胶，尽管少一些（用细梳子），对于酶切产品举止电泳分散；2)将酶切产品局部加进加样孔中3)跑胶，瞅察截止，而且拍照.4)用搞净的刀片将需要的DNA条戴从凝胶上切下去，称与重量.5)以0.1g凝胶对于应300μL的体积加进PN.6)50℃火浴搁置10min，功夫出有竭温战上下翻动离心管至胶真足融解.7)将上一步得到的溶液加进到一个吸附柱中，吸附柱再搁进支集管，13000rpm离心60s，弃掉兴液.8)加进800μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.9)加进500μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉兴液.10)将离心吸附柱搁回支集管，13000rpm离心2min.11)与出吸附柱，搁进一个搞净的离心管中，正在吸附膜的中间位子加进适量洗脱慢冲液EB 30μL，洗脱慢冲液先正在65℃火浴预热，室温搁置2min，13000rpm离心1min，而后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min.12)置于－20℃保存.5.3.3 连交依照连交体系举止，16℃连交过夜.表2 连交体系反应物体积/μL回支杂化的pET-28a量粒5gfp基果片段12T4连交酶 1慢冲液（10×） 25.4.1 LB（Luria-Bertain）液体战固体培植基的配造（参照附录）氨苄青霉素战卡那霉素等抗死素出有抗热，如果培植基温度过下，简单引导抗死素做兴，应使培植基降温至60℃安排后，再加进抗死素.但是也出有该使培植基的温度过矮，可则简单出现气泡.75mm曲径的培植皿约需15ml培植基.5.4.2．体验态细胞的造备 (CaCl2法)1)挑一大肠杆菌单菌降搁进3ml LB液体培植基（含Kan+），37℃培植过夜.2)活化大肠杆菌：与3ml新陈的LB液体培植基加进50-150μl的过夜菌，培植2-3个小时.3)将昨夜摇出去的DH5α或者BL21培植液转进离心管中,冰上搁置10min,而后于4℃下4000rpm离心5min.4)弃去上浑,用预热的0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL沉沉悬浮细胞,冰上搁置20min, 4℃下4000rpm离心5min.5)弃去上浑,加进300μL预热的0.1mol/L的CaCl2溶液,沉沉悬浮细胞,冰上搁置5min,即成体验态细胞悬液，可-80℃少久保存.5.4.3 变化涂板1) 与2个无菌离心管，分别加进100μL BL21体验态细胞悬液，第1管加5μl 无菌火，第2管加进量粒DNA 溶液5μl,沉沉摇匀,冰上搁置30min.2)42℃火浴中热激90s,热激后赶快置于冰上热却5min. 3) 分别背管中加进100μL LB 液体培植基,混匀后正在37℃振荡培植30min.4) 从管1中与50μL 涂布于含抗死素战出有含抗死素的仄板上,从管2中与50μL 战100μL 涂布于含抗死素的仄板上.正里进与搁置约10分钟,待菌液真足被培植基吸支后倒置培植皿,37℃培植20小时.图2 变化涂板模式图5.5 GFP 蛋黑的诱导表黑1)与阳性克隆量粒DNA 变化BL21； 2)正在含有Kan ＋的固体培植基上，37℃培植20h ； 3)挑与单菌降，37℃振荡培植过夜； 4) 与4支无菌戴盖试管，加进新陈LB 液体培植基（含有Kan 管1 管1 管2 管250μL 50μL 50μL 100μL＋）5ml，按1：20密释比率加进过夜菌，37℃培植至死少久,约2-3小时.5)加进IPTG（1：1000）至末浓度1mmol/L，分别诱导0h，1h，2h，4h.6)分别与1.5ml，10000rpm离心5min，去除上浑，支集重淀，再重复一次支集重淀.7)分别与IPTG诱导培植液20μl涂布正在含Kan＋的固体培植基上，37℃培植20小时.8)瞅察蛋黑表黑：用紫中线映照菌体重淀及培植仄板，不妨瞅到绿色荧光.分别对于匀称涂布的仄板以及表黑蛋黑的样品管照相，保存照片.5.6 绿色荧光蛋黑的细提与1)挑与上述审定透彻的单菌降交进5 mL 液体LB 培植基( 含50μg/mL 卡那霉素) , 37 ℃振荡培植过夜,2)将过夜培植菌以1: 500 体积比交种进新的LB 液体培植基夸大培植, 37 ℃培植1 h 后, 加进0.1 mmol/L IPTG 诱导表黑3 h.3)将上述诱导表黑菌液4 ℃、5 000×g 离心10 min 支集菌体,4)用提与慢冲液(2 mmol/L Tris, pH 8.0, 0.5 mmol/L PMSF,0.2mmol/L NaN3)洗涤菌体一遍,5)将菌体超声破碎( 50 %功率, 超声20 s, 共20 次,二次超声隔断40 s) 后, 10 000 ×g离心20 min.6)与离心后的上浑，即为细提与绿色荧光蛋黑.参照文件[1] Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y. 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GeneFinder-溴酚蓝上样慢冲液6×loading buffer：0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖火溶液.配造佳后不妨按50：1的比率密释GeneFinder.9．PEGFP-N3量粒齐图谱真验使用的EGFP蛋黑与自本核-真核脱梭量粒pEGFP-NB3B的蛋黑量编码序列.此量粒本本被安排于正在本核系统中举止扩删，并可正在真核哺乳动物细胞中举止表黑.真量粒主要包罗位于PCMV真核开用子与SV40 真核多散腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位面；一个由SV40 早期开用子开用的卡那霉素/新霉素抗性基果，以及上游的细菌开用子可开用正在本核系统中的复造与卡那抗性.正在EGFP编码序列上下游，存留特同的BamH I及Not I节造性内切酶位面，可切下整段EGFP编码序列.10．pET-28a量粒齐图谱表黑EGFP 蛋黑使用的pET-28 本核载体包罗有正在多克隆位面二侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表黑蛋黑的T7 开用子，T7 转录起初物以及T7 末止子；采用性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 开用子，以及为爆收单链DNA 产品的f1 开用子.。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告----绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和纯化一、实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长2.6kb；GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0 kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。
本质粒主要包括位于PCMV真核启动子与SV40 真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。
在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。
表达EGFP 蛋白使用的pET-28 原核载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag polyHis 编码序列；用于表达蛋白的T7 启动子，T7 转录起始物以及T7 终止子；选择性筛选使用的lacI 编码序列及卡那霉素抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA 产物的f1 启动子。
南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
/view/992207.ht m /view/2261117.h tm 郝福英 周先碗 朱玉贤 主编《基础分子生物 学实验》 北京大学出版社 2010年11月第 一版
实验仪器 实验材料 实验试剂
将pET-28a-GFP重组质粒转化入表达菌株 · 制备BL21（DE3）菌株的感受态细胞
10uL BL21（DE3）菌液接入3mL LB液体培养基，摇床培养过夜
二次活化：1:50比例接入新的试管摇床培养2h
1.5mL冰上10min
4 度，4000r/min离心2min收集细胞
涂平板： a）分别取50、100、150uL加入重组质粒的感 受态细胞悬液涂布于含抗生素的平板 b）抗生素板+IPTG+100uL重组质粒的感受态 细胞悬液 c）对照组感受态细胞100uL+抗生素平板 d）正面向上放置片刻，后37度倒置培养20h
重组阳性克隆菌接至3mL LB（Kan）液体培养基中，37度 培养16h 过夜菌1:50比例接种至4支试管中（每支试管含3mL LB(Kan)），扩大培养2h，测量A600值为0.5，停止 分别使用IPTG（最后总浓度为1mmol/L）诱导 0,2,4h 离心并照相
丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸 生色基团 蛋白质折叠，生色基团得以“亲密接触”, 经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。但此 时还不能发射荧光,只有当有分子氧存在的 条件下,发生氧化脱氢,方能导致绿色荧光蛋 白发色团的“成熟”,形成可发射荧光的形 式。
蓝光、绿光与黄光 基因克隆 变体
分子标记 药物筛选 融合抗体 生物传感器 信号传导
标记！
真核细胞表达载体，pEGFP-N3载体上携带 有EGFP蛋白表达基因 很强的复制能力 高效的功能强大的启动子SV40和PCMV 多克隆位点 具有neo基因，可以采用G418来筛选已成 功转染了该载体的靶细胞
携带增强绿色荧光蛋白基因的TSLC1真核表达载体构建及鉴定
携 带增 强 绿 色 荧 光蛋 白基 因 的 Ｔ Ｌ 真 核 ＳＣ １ 表 达 载体 构 建 及 鉴定
肖钟迪 。 张玉成 房 学东¨ ，
（ １吉林 大学第二 临床 医院 ， 长春 １０４ ； ３０ １２大庆 油 田总 医院 ；
３吉林 大学 中 日联 谊 医院）
摘要 ： 目的 构建携带增强绿色荧光蛋 白基因的 Ｔ Ｌ １ Ｓ Ｃ 真核表 达载体 ， 为研究其抗 肿瘤功 能奠定基 础。方法
提取基 因组 Ｒ Ａ， Ｎ 利用特异性引物进 行 Ｒ —Ｃ ＴＰ Ｒ反应 ， 扩增全长 Ｔ Ｌ １ 因片段 ， ＳＣ 基 与真核表达载体 ｐ ｅｅ ｅ－ ９ Ｒ ｃｉ ｒ ｖ Ｍ２ 载体进行连接 ， 并转化到 大肠杆菌 Ｊ ０ Ｍ１９中扩增 ， 以获得重组载 体 ， 应用 酶切 、Ｃ Ｐ Ｒ及测 序鉴定此重 组载 体。结果 Ｒ ．Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ获得约 １ ２ ｐ大小的特异性 Ｔ Ｌ １ 因片段 ； ９ｂ ３ ＳＣ 基 测序鉴定证实 ，Ｓ Ｃ 基 因片段正确插入真核表达 载体 ＴＬ１ ｐ ｅｅ ｅ． ２ Ｒ ｅｉ ｒ ９中。结论 ｖ Ｍ
基金项 目： 吉林省发展与改革委员会资助课 题（０ ６ ５０ 。 ２０ １５ ） ・ 通讯作者
公 司 ； 物 由上 海 生 工 生 物 公 司 合 成 ；Ｒ ｃｉｅ． 引 ｐ ｅｅ ｒ ｖ
Ｍ ９购 自广 州 复能基 因公 司 。 ２ 的重组质 粒送 上海 生工 生物公 司行 测序 鉴
定。
２ 结果
． Ｎ Ｎ 凝 １２ １ 引物设计 根据 Ｇ ｎ ａｋ中 Ｔ Ｌ １ 因的 ２ １ 总 Ｒ Ａ 提 取 总 Ｒ Ａ， 胶 电泳 可 明 显 见 到 ．． ｅＢｎ ＳＣ 基
产物， 连接 产物转 化 到 已制 备 好 的感 受 态 Ｊ ０ Ｍ１９菌 中， 且涂 布在含 有氨 苄青 霉 素 的 Ｌ Ｂ平 板 上 ， 夜后 过
GFP实验报告
绿色荧光蛋白的克隆摘要：目的：研究绿色荧光蛋白基因的基因克隆。
方法：分别提取DH-5α(pEGFP-N1)和DH-5α(pMD-18T)质粒，将两个质粒酶切并连接形成重组质粒pMD-18T-GFP，将重组质粒导入DH-5α克隆菌中进行转化，用抗生素抗性筛选后，通过限制性核酸内切酶EcoR I 和 Hind III对所建质粒进行分析鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白 DNA重组The cloning of green fluorescent proteinAbstract：Objective: Studies indicated the cloning of the GFP gene.Methods: Extract the plasmid of the DH-5α(pEGFP-N1) and DH-5α (pMD-18T). Then cutting by enzyme and connecting the two plasmids to form pMD-18T-GFP recombined plasmid. The recombinant plasmid confirmed by restriction enzyme and PCR was transferred into E.coli DH-5αto ensure the expression of green fluorescent protein. After resistant screening with antibiotics, analyze and identify the recombined plasmid.Keywords: Green Fluorescent Protein DNA recombination随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用，重组DNA技术在发展蛋白质、多肽类药物与疫苗、转基因和基因敲除动物、HGP、基因诊断和基因治疗等方面得到广泛应用。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子。
发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。
1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到200kb 。
质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制10-200 个拷贝。
当宿主细胞的蛋白时所用的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析
石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
绿色荧光蛋白(GFP)基因地克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
《2024年用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究》范文
《用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究》篇一一、引言随着生物技术的飞速发展，转基因技术已成为现代生物学研究的重要手段。
转基因技术通过将外源基因导入动物体内，实现基因的修饰和改造，从而获得具有特定性状或功能的转基因动物。
绿色荧光蛋白（GFP）和肝再生增强因子（HRE）基因作为两种重要的外源基因，在转基因研究中具有广泛的应用前景。
本研究以绵羊为研究对象，利用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因研究，旨在探讨其在胚胎发育及肝再生等方面的应用。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的材料包括：绿色荧光蛋白基因、肝再生增强因子基因、绵羊胚胎、培养基、转染试剂等。
2. 方法（1）基因构建与转染：首先构建包含绿色荧光蛋白基因和肝再生增强因子基因的重组载体，然后通过显微注射法将重组载体导入绵羊胚胎中。
（2）胚胎培养：将转染后的胚胎置于培养基中，进行体外培养，观察其发育情况。
（3）转基因动物鉴定：通过PCR、荧光显微镜等方法，检测转基因动物的基因型及表达情况。
（4）肝再生实验：对转基因动物进行肝切除手术，观察其肝再生能力。
三、实验结果1. 胚胎发育情况转染后的胚胎在培养过程中，其发育情况良好，能够正常分化成囊胚和胎膜等组织。
绿色荧光蛋白基因在转基因胚胎中成功表达，使胚胎在荧光显微镜下呈现出明显的绿色荧光。
2. 转基因动物鉴定通过PCR和荧光显微镜等方法，成功检测到转基因动物的基因型及表达情况。
绿色荧光蛋白基因在转基因动物体内稳定表达，而肝再生增强因子基因的表达情况也得到了验证。
3. 肝再生实验结果对转基因动物进行肝切除手术后，发现其肝再生能力较非转基因动物有显著提高。
这一结果表明肝再生增强因子基因的转染确实有助于提高动物的肝再生能力。
四、讨论本研究利用绿色荧光蛋白和肝再生增强因子基因进行转基因绵羊胚胎的研究，探讨了其在胚胎发育及肝再生等方面的应用。
结果表明，通过显微注射法将外源基因导入绵羊胚胎中，可实现基因的稳定表达。
绿色荧光蛋白(EGFP)克隆并在大肠杆菌表达
绿色荧光蛋白（EGFP）克隆并在大肠杆菌表达详细项目实施计划书生物技术1001班①EGFP基因完整的序列: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTA AACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAG TTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTG CAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTC GAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTG GGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGC ATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAG CAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCC CTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATC ACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTA②PCR引物引物序列（5’-3’）酶切位点描述Pl GAC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGABamHI5’GFP geneP2GCC GAATTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATG EcoR I 3’GFP gene实验使用的EGFP蛋白取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-NB3B的蛋白质编码序列。
绿色荧光蛋白科技名词定义
绿色荧光蛋白科技名词定义中文名称：绿色荧光蛋白英文名称：green fluorescence protein;GFP;green fluorescent protein 定义1：从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。
分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。
其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。
应用学科：生物化学与分子生物学〔一级学科〕；方法与技术〔二级学科〕定义2：最初从水母〔Aequorea victoria〕体内发现的发光蛋白。
含有发光团，在不同物种中均能稳定发出荧光，其基因是常用的报道基因。
应用学科：细胞生物学〔一级学科〕；细胞生物学技术〔二级学科〕以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布求助编辑百科名片绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
目录根本介绍什么是绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白有什么用呢GFP性质发现过程GFP应用骨架和细胞分裂细胞器动力学和泡囊运输发育生物学生物技术中的应用研究GFP在肿瘤发病机制研究中的应用在信号转导中的应用光伏发电神经生物学其他应用GFP vectors and technologyOther Interesting GFP Link应用前景获得诺贝尔奖根本介绍什么是绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白有什么用呢GFP性质发现过程GFP应用骨架和细胞分裂细胞器动力学和泡囊运输发育生物学生物技术中的应用研究GFP在肿瘤发病机制研究中的应用在信号转导中的应用光伏发电神经生物学其他应用GFP vectors and technologyOther Interesting GFP Link应用前景获得诺贝尔奖展开编辑本段根本介绍由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色荧光蛋白科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光绿光的范围下是较弱的位置。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达
分子生物学综合实验论文题目:绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam HI和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。
取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌 E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。
重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1μL/mL的卡纳霉素的LB培养基上培养。
当A600达到0.7时，用终浓度为0.8mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。
关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight,College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam HI and Not I,the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言：01.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP）01.1.1 GFP研究背景01.1.2 GFP研究应用11.2基因的克隆与表达22.实验试剂及实验仪器：42.1实验试剂与材料：52.2实验仪器：63.实验方法63.1质粒提取方法:63.2琼脂糖凝胶电泳及回收:83.3酶切及连接：93.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入：113.5酶切验证重组质粒：123.6GFP基因的表达133.6.1活化菌种133.6.2扩大培养133.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达134.结果与分析134.1质粒提取过程中现象与结果：134.2琼脂糖凝胶电泳144.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果：154.4酶切验证重组质粒154.5GFP基因的表达结果：165.讨论：165.1提取质粒出现图六的原因是：165.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因：175.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因:17 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因：195.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因：196.参考文献20前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达陶成秋20杨晨20一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，共27kD，由238个氨基酸构成。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。
通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。
根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
二、实验流程三、具体实验方案实验一、质粒DNA的提取1.实验原理：1）质粒(Plasmid)是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。
它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。
绿色荧光蛋白的诱导表达与观察(1)
实验试剂与仪器
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. LB液体培养基（卡那抗性） pET28-GFP菌液（BL21菌株） IPTG 低温摇床 分光光度计 离心机 荧光显微镜
实验步骤
1. 将2 ml pET28-GFP菌液转接至50 ml LB液体培养基中，37℃振荡摇菌2-3小时； 2. 分光光度计测菌液OD值，当OD值达到0.4-1之间时可进行诱导； 3. 向菌液中加入25 ul IPTG母液（1 M/L）至终浓度为0.5mM； 4. 28 ℃ 诱导过夜。 5. 第二天离心收集菌体于-20 ℃保存。
3. 表达载体pET-28a
4. 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出 荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微 镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 5.最早出现的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由下 村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现，之 后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。其中水母GFP是由238 氨基酸组成的单体蛋白质，分子量约27KD，GFP荧光的产生主要是 在氧气存在下，分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧 基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的α-2β键脱 氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，这样GFP分子中就形成对 羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。
绿色荧光蛋白的诱导表达与观察
实验目的
1. 掌握在大肠杆菌中诱导蛋白表达的实验方 法和实验方法
2. 了解原核表达的原理和荧光显微镜的工作 原理
实验பைடு நூலகம்理
1. E . coli 表达系统 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化 入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主 菌内表达目的蛋白质（绿色荧光蛋白），并通过荧光 显微镜进行观察。 2. 外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将 宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减 轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本 实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源 基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同， 因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
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分子生物学综合性实验结题报告绿色荧光蛋白基因左xx1学 10110902014 10110904007 班 10G20专生物制药学生物医药摘要绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)基因是一种重要的报告基因，将其和另外一种基因融合在一起，能检测到融合蛋白的表达情况。
本实验中我们使用BamH Ⅰ和Not Ⅰ从pEGFP-N3质粒上得到EGFP基因，再把它重组到pET-28ａ表达载体上，将重组体转化入DH5ａ菌种中进行培养，采取酶切发法鉴定的方法对转化的重组子进行鉴定。
关键词：绿色荧光蛋白；酶切；载体；Green fluorescent protein gene is a kind of important report gene, its and another gene fusion together, can detect the fusion protein expression. In this experiment we use BamH Ⅰand Not Ⅰfrom pEGFP - N3 plasmid get EGFP gene, again it restructuring to pET - 28 a expression vector and recombinant into DH5a strains in training and take enzyme cut hair method appraisal method to transform the restructuring of the child for identification.Keywords：Green fluorescent protein gene；enzyme cut；1..引言 ------------------------------5页2..应用前景 ------------------------------6页3..分子生物学实验原理 ------------------------------8页4..实验材料及试剂 ------------------------------12页5..实验流程 ------------------------------13页6..实验结果 ------------------------------19页7..分析 ------------------------------21页参考文献 -------------------------------22页致谢 ------------------------------ 23页附录 -------------------------------24页绿色萤光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一类存在于水母﹑水螅何珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白,这种蛋白质最早是由普林斯顿大学的科学家下村修（Osamu Shimomura）等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。
其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。
现今科学家已经成功地将绿色荧光蛋白基因表达在E.coli及线虫等异源细胞中, GFP在各种异源细胞如,细菌﹑昆虫﹑动物及植物细胞中发现。
本实验通过基因工程手段，将存储在含有pEGFP-N3的GFP基因连接到载体pET-28ａ的启动子区构成重组体，最后在表达菌BL-21中完成GFP基因的表达，结果能成功的观察到GFP发出的荧光。
2 应用前景在2008年的诺贝尔化学奖上，绿色荧光蛋白成了主角。
诺贝尔获奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁•查尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。
在诺贝尔奖新闻发布会的现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中的物质发出了绿色荧光。
2.1生物技术中的应用研究2．1．1．分子标记作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。
利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFPGFP标记的微管基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。
1996年，Ehrdardt等人首次报道了利用GFP的特性研究细胞分化蛋白FtsZ的定位。
研究显示FtsZ在细胞分裂位点形成了一个环状物，且至少有9种蛋白在细胞分裂中起重要作用，尽管对这些蛋白功能仍然不是很清楚，但是利用GFP融合蛋白已经搞清楚了它们聚合的顺序以及在蛋白定位中的一些特征。
利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
2.1.2．药物筛选许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。
基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。
荧光探针c为药物筛选的GFP分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。
由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。
2.13融合抗体近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体（杂交瘤技术一单克隆抗体）发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。
单链抗体（Single-chain vGFP在植物研究中的应用ariable fragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。
近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。
因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。
绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中3 分子生物学实验原理3.1 DNA重组技术DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合，把外源目的基因装配到载体上的过程。
包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。
体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。
3.2 DNA片段和载体的连接（1）带有相同的粘性末端：用同一种酶或同尾酶处理可得这样的末端。
由于质粒载体也必须用同样的酶消化，亦得两个相同的粘性末端，因此在连接反应中，外源目的基因片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化，而且正反两种连接方向都有。
为防止载体DNA自身环化，连接前用碱性磷酸脂酶（CIP）去除载体分子的5’-P，使之最大限度地抑制载体环化现象。
（2）带有非互补的粘性末端：用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生这样的末端，一般情况下，常用质粒载体的多克隆位点总能找到若干个不同的酶切位点；用两种酶分别消化载体和目的DNA后，可将外源目的片段定向克隆到载体上。
（3）带有平末端：由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶Klenow片段补平3’凹陷，使不相匹配的末端转变为平端。
由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA浓度均要高得多。
通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
（4）成功的连接反应需纯净的目的DNA片段和载体DNA，一般采用插入片段（目的DNA）与载体DNA分子数比为3～5：1。
目的基因比例太多，易产生基因自连后插入载体的多聚体。
3.3绿色荧光蛋白基因重组步骤本实验将通过限制性内切酶双酶切法将EGFP片段从该质粒中克隆出来，并转入另一常用表达载体Pet28a。
在质粒酶切验证后，得到含有EGFP的阳性克隆，并将EGFP蛋白在E.coli BL21菌株中进行表达，最后，所表达的EGFP蛋白可以通过SDS-PAGE法得到验证。
BamHⅠNotⅠBamHⅠNotⅠ回收回收DH5a(pEGFP-N3)DH-5a(pET-28a)质粒pEGFP-N3质粒pET-28a插入片段4 实验器材与试剂4.1实验仪器恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱，1.5mLEP管，0.5mLEP管，塑料离心架，微量加样器各一个，三角瓶，培养皿，电泳仪,玻璃刮刀，制冰机，紫外仪，电子天平，高压灭菌锅。
4.2实验材料及试剂E．coli DH5a包括含有pEGFP质粒的DH5a菌株，含有Pet-28a（+）质粒的DH5a 菌株和空载的DH5a以及E．coli BL21(DE3)菌株，含Kan的LB液体培养基，LB固体培养基，溶液Ⅰ（GET缓冲液ph8.0），溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,SDS），溶液Ⅲ（乙酸钾溶液，ph4.8）酚-氯仿，TE缓冲液，异丙醇，70％乙醇，无水乙醇，BamhⅠ、XhoⅠ和NotⅠ酶切试剂，0.1mol/L CaCI2溶液(灭菌)。
(1) 液体LB培养基（PH 7.0）蛋白胨（10 g/L）1％酵母提取物（5 g/L）0.5％NaCl （10 g/L）1％（固体LB培养基是在液体LB的基础上中加琼脂粉2%）(2) 溶液Ⅰ（0~4 ℃贮存）葡萄糖50 mmol/LTris-Cl(pH 8.0) 25 mmol/LEDTA (pH 8.0) 10 mmol/L(3) 溶液ⅡNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)（用时由母液2 mol/L NaOH、10 % (W/V) SDS稀释现配）(4) 溶液Ⅲ（0~4 ℃贮存）乙酸钾(5 mol/L) 60 mL冰乙酸11.5 mLH2O 28.5 mL(5) 0.5×TBE电泳缓冲母液（500 mL量）Tris-碱 2.7 g硼酸 1.4g0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 1mL(6) 6×DNA电泳缓冲液溴酚蓝0.25 %蔗糖水溶液40 % (W/V)(7) 卡那霉素（Kan）配成浓度为50 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用。