1 分子克隆
分子克隆名词解释
分子克隆名词解释分子克隆是指利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质（DNA）复制并传递给另一个生物体的过程。
在分子克隆中，一个主要的步骤是将要克隆的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA，然后将其传递给宿主细胞进行复制和表达。
分子克隆有许多不同的应用领域，其中最著名的是基因工程和医学研究。
在基因工程中，分子克隆可以用于生产重组蛋白、生产转基因生物和制造药物。
在医学研究中，分子克隆可以用于研究疾病的发病机制、开发新型疗法和筛选药物靶点。
在分子克隆的过程中，有几个重要的术语需要理解。
首先是重组DNA。
重组DNA是将要克隆的DNA片段与载体DNA连接而形成的复合物。
载体DNA通常是质粒，可以在宿主细胞中自主复制和表达。
其次是限制性内切酶。
限制性内切酶是一类酶，可以识别DNA的特定序列，并在该序列上切割DNA。
这些酶在分子克隆中起到“剪刀”的作用，将DNA切割成特定的片段，用于进行重组。
另外一个重要概念是DNA合成。
DNA合成是通过化学合成方法制备DNA片段的过程。
这些合成的DNA片段可以与其他DNA片段连接，形成重组DNA。
在分子克隆的过程中，有几个关键的步骤。
首先是选择合适的限制性内切酶。
限制性内切酶的选择根据克隆的目的和需要选择不同的酶切位点。
然后是DNA切割和连接。
通过酶切和连接反应，将要克隆的DNA片段与载体DNA连接，并形成重组DNA。
接下来是转化过程。
将重组DNA导入宿主细胞，并使其进行自主复制和表达。
最后是筛选或鉴定过程。
通过筛选或鉴定宿主细胞中的重组DNA，筛选出目标克隆。
总之，分子克隆是一种利用重组DNA技术，将一个生物体的遗传物质复制并传递给另一个生物体的过程。
通过克隆可以研究基因功能、生产重组蛋白和制造药物。
分子克隆的关键步骤包括选择限制性内切酶、DNA切割和连接、转化和筛选或鉴定。
分子克隆在生物科学和医学研究中具有广泛的应用前景。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是生物学中一种重要的技术手段，它是指利用分子生物学技术对DNA进行复制和重组，从而得到与原始DNA相同或相似的分子。
分子克隆技术的应用范围非常广泛，涉及基因工程、药物研发、农业生产等多个领域。
本文将介绍分子克隆的原理及其在生物学研究和应用中的重要性。
首先，分子克隆的原理是基于DNA的复制和重组。
DNA复制是生物体细胞分裂时进行的一种重要过程，它使得细胞在分裂时能够传递遗传信息。
而分子克隆则是通过模拟DNA复制的过程，将目标DNA片段复制出来，并将其插入到载体DNA中，从而得到包含目标DNA片段的重组DNA分子。
这样一来，就可以在细胞内大量复制目标DNA片段，为后续的研究和应用提供充足的材料。
其次，分子克隆的关键步骤包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、连接和转化。
首先，需要从生物体中提取目标DNA片段，这可以通过PCR技术或限制性内切酶切割等方法来实现。
然后，需要选择一个合适的载体DNA，一般来说，质粒是最常用的载体，因为它具有独立的复制和表达机制。
接下来，将目标DNA片段和载体DNA进行连接，一般采用DNA连接酶来实现。
最后，将重组的DNA分子导入到宿主细胞中，通过细胞内的复制和表达机制，使得目标DNA片段得以大量复制和表达。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义。
首先，它为基因工程和生物技术的发展提供了重要的技术手段。
通过分子克隆，可以对目标基因进行定点突变、基因组编辑等操作，从而揭示基因的功能和调控机制。
其次，分子克隆也为药物研发和生物医学研究提供了重要的工具。
许多重要的药物和治疗方法都是基于分子克隆技术的发展而来。
此外，分子克隆还在农业生产中发挥着重要作用，例如转基因作物的育种和疾病抗性的培育等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物学技术手段，它基于DNA的复制和重组原理，通过一系列的操作步骤，可以实现对目标DNA片段的复制和重组。
分子克隆技术在生物学研究和应用中具有重要的意义，为基因工程、药物研发、农业生产等领域提供了重要的技术支持。
分子克隆法
分子克隆法
分子克隆法是一种分子生物学技术，用于在体外制备和复制DNA 分子，包括基因、DNA片段和整个染色体。
这种技术允许科学家复制和操纵DNA，以进行各种研究和应用，包括基因工程、药物开发和基因治疗。
下面是分子克隆法的主要步骤：
1.DNA提取：首先，需要从源材料（通常是细胞或组织样本）中
提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白质分离等方法来完成。
2.DNA切割：提取的DNA通常是大片段，需要将其切割成较小
的片段，以便后续克隆。
这一步通常使用限制性内切酶来实现，
这些酶可以在特定DNA序列上切割。
3.DNA连接：切割后的DNA片段可以通过DNA连接酶与载体
DNA（如质粒或病毒DNA）连接在一起，形成重组DNA分子。
这个过程称为DNA重组。
4.DNA转化：重组DNA可以被引入宿主细胞中，这个过程称为
DNA转化。
这可以通过热激冷却法、电穿孔法、化学法等方法
来实现。
5.宿主细胞培养：转化后的细胞被培养，以允许它们繁殖并扩增
重组DNA。
6.筛选与识别：在宿主细胞中，可以筛选出携带重组DNA的细
胞，通常使用抗生素抗性标记或荧光标记等方法来进行筛选。
7.DNA提取与纯化：从筛选出的细胞中提取和纯化重组DNA，
以便进一步的研究或应用。
8.分析与验证：最后，分析和验证克隆的DNA，确保它是所需的
目标DNA，并不包含错误或突变。
分子克隆法有许多应用，包括基因表达、基因编辑、蛋白质生产、疾病研究等。
它在生物学研究和生物工程领域发挥着关键作用，允许科学家操纵和研究DNA，以深入了解生命的分子机制。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录1.分子克隆技术的概念与原理2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用领域4.分子克隆技术的优势与局限性正文一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是一种在生物体外将特定 DNA 片段复制并插入到载体DNA 中的技术。
这种技术可以使得新的 DNA 分子与载体 DNA 相结合，形成一个具有自我复制能力的 DNA 分子。
在实际应用中，分子克隆技术主要通过将目的基因与载体 DNA 连接，从而实现对目的基因的扩增和表达。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：从待研究的生物体中提取需要克隆的 DNA 片段，通常使用 PCR 技术进行扩增。
2.构建载体：选择合适的载体 DNA，将其与目的基因连接，构建成一个完整的克隆载体。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体转化到受体细胞中，让受体细胞表达出目的基因。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从转化后的细胞中筛选出含有目的基因的克隆子。
5.鉴定克隆子：对筛选出的克隆子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、分子克隆技术的应用领域分子克隆技术在生物学研究中具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 连接，实现对目的基因的扩增和表达。
2.蛋白质工程：通过分子克隆技术，可以研究蛋白质的结构和功能，为药物研发提供重要依据。
3.基因组学：通过分子克隆技术，可以对基因组 DNA 进行拼接和分析，揭示生物体的基因组结构。
4.转基因技术：通过分子克隆技术，可以将目的基因插入到载体 DNA 中，实现对转基因生物的研究和开发。
四、分子克隆技术的优势与局限性分子克隆技术在生物学研究中具有明显的优势，如操作简单、扩增效率高、可控性强等。
然而，分子克隆技术也存在一定的局限性，如克隆效率受载体 DNA 大小限制、克隆过程中可能出现突变等。
分子克隆技术的基本原理与应用
分子克隆技术的基本原理与应用分子克隆技术是一种重要的生物学实验技术，它通过复制DNA分子来生成大量相同的DNA分子，并将其插入到宿主细胞中，从而实现对基因的精确操控和研究。
本文将介绍分子克隆技术的基本原理和应用。
一、基本原理分子克隆技术主要包括DNA片段的制备、载体的选择、DNA插入和转化等步骤。
1. DNA片段的制备DNA片段可以通过多种方法获得，例如PCR扩增、限制性内切酶切割、化学合成等。
其中，PCR扩增是最常用的方法，它利用DNA聚合酶酶与引物的特异性序列，选择性地复制目标DNA序列。
2. 载体的选择载体是DNA分子在宿主细胞中复制和表达的媒介。
常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
选择载体时需要考虑其复制数目、大小、选择标记和表达效率等因素。
3. DNA插入将目标DNA片段与载体连接形成重组DNA，常用的连接方法有限制性内切酶连接、DNA连接酶连接等。
连接后的重组DNA称为重组载体。
4. 转化将重组载体导入宿主细胞中，使其内复制和表达。
转化方法多种多样，包括化学法、电渗法、电穿孔法等。
二、应用领域分子克隆技术在许多领域都有重要的应用，主要包括基因工程、基因功能研究和药物开发等方面。
1. 基因工程基因工程利用分子克隆技术对特定基因进行精确操控，可以实现基因的克隆、修饰和表达。
通过基因工程，可以生产重组蛋白、转基因植物、转基因动物等，为农业、医学和工业等领域提供了许多重要的应用。
2. 基因功能研究分子克隆技术为基因功能研究提供了有力的工具。
通过构建基因敲除、基因突变或过表达等模型，可以研究基因在生物体发育、生理、代谢等方面的功能和调控机制，深入了解生物体的生物学过程。
3. 药物开发分子克隆技术在药物开发中起到了重要的作用。
通过分子克隆技术可以快速高效地获得特定基因的大量DNA片段，从而加速对新药靶点的筛选和鉴定，提高药物研发的效率。
总结：分子克隆技术由于其独特的原理和广泛的应用领域，成为现代生物学研究中不可或缺的技术手段。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录一、引言二、分子克隆技术的概念与原理1.分子克隆的定义2.分子克隆的基本原理三、分子克隆技术的应用1.大肠杆菌受体2.基因工程3.蛋白质工程四、分子克隆技术的操作步骤1.目的基因的获取2.载体的选择与构建3.转化与筛选4.克隆子的检测与鉴定五、分子克隆技术的优缺点1.优点2.缺点六、总结正文一、引言分子克隆技术作为一种生物技术手段，广泛应用于基因工程、蛋白质工程等领域。
通过对生物分子的切割、拼接和转化，实现对生物信息的复制和传递，从而为生物科学研究和应用提供有力支持。
本文将简要介绍分子克隆技术的概念与原理，重点阐述其在实际应用中的操作步骤和优缺点。
二、分子克隆技术的概念与原理1.分子克隆的定义分子克隆是指在体外将各种来源的生物分子（如基因、DNA 片段、蛋白质等）与适当的载体结合，形成一个新的分子体系，并通过转化等手段将其导入受体细胞，从而使目的分子在受体细胞中得以复制和表达。
2.分子克隆的基本原理分子克隆的基本原理主要包括以下几个方面：（1）分子切割：利用限制性内切酶（限制酶）对目的基因和载体进行切割，产生相同的黏性末端；（2）分子拼接：通过 DNA 连接酶将切割后的目的基因和载体连接起来，形成重组子；（3）分子转化：将重组子导入受体细胞，使其在受体细胞中得以复制和表达；（4）分子筛选：通过筛选和鉴定，获得成功克隆的目的基因或蛋白质。
三、分子克隆技术的应用1.大肠杆菌受体大肠杆菌（Escherichia coli，简称 E.coli）作为分子克隆的常用受体细胞，具有生长快速、繁殖周期短、易于培养等优点。
在基因工程中，大肠杆菌常被用作基因克隆和表达的宿主细胞。
2.基因工程分子克隆技术在基因工程中的应用主要包括目的基因的克隆、基因的定点突变、基因的拼接等。
通过分子克隆技术，可以实现对基因的精确操作，为生物学研究和基因治疗等提供基础。
3.蛋白质工程分子克隆技术在蛋白质工程中的应用主要包括蛋白质的表达和纯化。
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是指利用体外的人工方法将一个DNA分子（称为目的DNA）复制到一组DNA分子（称为载体DNA）中的过程。
这项技术能够在体外精确复制和扩增DNA分子，从而可以用于研究基因功能、制备重组蛋白、基因治疗等领域。
下面是分子克隆技术的详细步骤：1.选择载体DNA：首先需要选择一个合适的载体DNA，一般会使用细菌的质粒作为载体，因为细菌质粒具有稳定、易扩增和实验操作简单的特点。
2.制备DNA片段：将目的DNA通过PCR扩增或者其他方法制备出来。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶在体外将目的DNA的特定序列进行大规模复制的过程，一般需要利用引物引导PCR反应。
3.处理载体DNA：将载体DNA进行处理，一般需要进行酶切。
通过选择性酶切酶将载体DNA的一部分切除，形成切口，为接下来的目的DNA连接提供空位。
4.连接DNA：将目的DNA与处理后的载体DNA连接起来。
一般利用DNA连接酶进行连接，将目的DNA的末端与载体DNA的末端互补连接。
连接反应通常需要一定时间和温度来保证连接的效率和稳定性。
5.转化细胞：将连接好的DNA转化到细菌等宿主细胞中。
这一步可以通过热激转化、电转化等方法实现。
转化后，将细胞培养在含有相应抗生素的培养基上，只有携带目的DNA的细菌才能存活，从而筛选出含有目的DNA的克隆。
6.筛选克隆：通过筛选抗生素抗性或其他标记物的方法来筛选出含有目的DNA的细菌克隆。
一般需要进行筛选接种、PCR鉴定、酶切及测序等手段来确认克隆是否含有目的DNA，并进一步分析目的DNA的表达和功能。
这些步骤是分子克隆技术的基本流程，但在实际操作中可能会根据具体情况进行相应的调整和优化。
分子克隆技术的发展和应用使得我们可以对基因进行精确操作和研究，对于推动生命科学的发展和应用具有重要的意义。
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
下面将详细介绍分子克隆的实验流程。
1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。
这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。
2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。
常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。
将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。
3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。
这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。
4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。
在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。
此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。
PCR检测可以验证目标基因的存在。
5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。
这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。
只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。
选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。
6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。
通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。
提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。
7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。
这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。
通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。
8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。
分子克隆原理
分子克隆原理分子克隆是指利用DNA重组技术，将感兴趣的DNA片段插入到载体DNA中，然后将这些重组的DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
分子克隆技术是生物学研究中的重要工具，它不仅可以用于基因的克隆和表达，还可以用于分析基因的结构和功能，研究蛋白质的结构和功能等。
分子克隆的原理主要包括DNA片段的获取、载体DNA的选择、DNA片段与载体的连接、重组DNA的导入宿主细胞等几个步骤。
首先，要获取感兴趣的DNA片段，可以通过PCR扩增、限制酶切割等方法进行。
PCR扩增是指利用DNA聚合酶酶和引物将目标DNA片段在体外进行大量复制，从而获得大量的目标DNA片段。
限制酶切割是指利用特异性的限制酶切割DNA，从而获得特定的DNA片段。
其次，选择合适的载体DNA。
常用的载体包括质粒、噬菌体、人工染色体等。
质粒是一种环状的DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
噬菌体是一种侵染细菌的病毒，可以将外源DNA插入到其基因组中。
人工染色体是一种由人工合成的染色体，可以在宿主细胞中稳定复制和表达。
然后，将DNA片段与载体DNA连接。
这一步通常需要利用DNA 连接酶将DNA片段与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
连接后的重组DNA可以通过转化、转染等方法导入到宿主细胞中。
最后，重组DNA在宿主细胞中进行复制和表达。
宿主细胞通常选择大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
在宿主细胞中，重组DNA会进行复制，使得宿主细胞中含有大量的重组DNA。
重组DNA还可以通过转录和翻译过程进行表达，从而产生感兴趣的蛋白质。
总的来说，分子克隆原理是利用DNA重组技术将感兴趣的DNA 片段插入到载体DNA中，然后导入宿主细胞中进行复制和表达。
这一技术在基因工程、蛋白质表达、基因功能研究等领域有着广泛的应用，对于推动生物学研究和生物技术的发展起着重要的作用。
分子克隆
3. 简并序列（degenerate ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ）又称“松弛”特异识别， 即识别位点中某些核苷酸可以被其他 核苷酸替换。 ↓
如：ＡｖａⅡ：5，—Ｇ ＧＡ／ＴＣＣ—3， 3，—ＣＣＴ／ＡＧ Ｇ—5， ↑ ４.非回文结构： ↓ 如：ＭｂｏⅡ：5，—ＧＡＡＧＡＮ８—3， 3，—ＣＴＴＣＴＮ７—5， ↑
Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++， ATP为辅助因子；切割位点靠近识别 序列但较难预测。一般在25~27bp范 围内切割。现已报道4种。
I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修 饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP， 切割DNA链的位置远离识别序列，因 此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都 不常用。
５.在酶反应缓冲体系中均添加有 二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，以稳 定酶活性防止氧化。 ６.在具体试验操作时应在低温或 冰浴条件下完成。
二、DNA聚合酶 DNA polymerase
分子克隆常用的DNA聚合酶： 依赖DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I。 Klenow片段。 T4噬菌体DNA聚合酶。 T7噬菌体DNA聚合酶。 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。（测序 酶） 耐热DNA聚合酶。 依赖RNA 的DNA聚合酶。（逆转录酶）
4.切割后产生平头或粘性末端。
5.Ⅱ型RE酶只需Mg2+， 不需ATP。
Ⅱ型酶切割双链DNA可产生两种不同的切口 1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的 对称轴上进行切割，例如Hae Ⅲ识别序列 为5’-GGCC-3’，其切点在G与C之间； 2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序 列的两个对称点切开DNA双链，产生末端 带有单链尾巴的切口。粘性末端又可分为 两种：从DNA分子5’端切割产生5’端突出 的粘性末端称为5’粘性末端．如EcoRI； 从3’端切割产生3’端突出的粘性末端称为3’ 粘性末端，如Pst I。
分子克隆技术及其应用
分子克隆技术及其应用分子克隆技术是指利用特定的分子生物学方法，在实验室中制备出与原细胞完全一致的生物体或物质的一种技术。
这种技术于1970年代被首次开发并应用，随着技术的不断完善，现今已广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
一、基本概念及原理分子克隆技术包括以下基本步骤：1.基因重组 2.转化 3.繁殖 4.筛选。
其中，基因重组指将被复制的DNA序列插入向量DNA中，形成重组质粒；转化是将重组质粒引入宿主细胞中，形成重组宿主细胞；繁殖是让重组宿主细胞自我复制，使其得到强大的繁殖能力；而筛选则是从繁殖出的重组宿主细胞中筛选出目的基因并放大。
具体而言，基因重组可以通过酶切、连接、转移等操作实现。
首先，将要克隆的DNA序列以及向量DNA进行酶切，用限制酶切分别切断它们的中间部分，得到“粘性末端”。
接着，将两者的“粘性末端”连接起来，形成插入向量，再将其转移到细胞中。
重组宿主细胞的选择一般依据所传递的向量类型选择合适的细胞系，如大肠杆菌、酵母等。
繁殖过程中，选定的细胞在合适的培养基中生长繁殖，细胞数目呈指数级增长，几天后细胞就可达到数百万个。
最后，通过特定的方法筛选出所需的克隆基因就完成了整个克隆过程。
二、分子克隆技术的应用分子克隆技术已成为现代生物技术的重要手段，被广泛应用于基因工程、生物医药、农业等领域。
1.基因工程分子克隆技术的应用最为广泛的领域，也是发展得最为成熟的领域之一。
利用分子克隆技术，科学家们可以构建基因工程菌株，来生产大量特定的蛋白质，如生长激素、乳糖酶等，以及进行人工基因的定点突变。
此外，还可利用分子克隆技术将外源基因植入植物、微生物等生物体中，来实现短期内大规模的基因导入，如通过基因工程技术开发新品种作物等。
2.生物医药分子克隆技术也为生物医药领域带来了新的变革和机遇。
利用它可以生产出各种高质量的同位素、抗体、药物、疫苗等生物标本，以及对病毒、细菌、疾病等进行精准治疗。
也可以用于研究基因的构造、调控和功能等信息，进一步提高人类对癌症、心脑血管疾病等重大疾病的认识和治疗水平。
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将外源（某载体上的水稻）DNA
片段亚克隆到另一载体上。
pU1301
CaMV 35S promoter
Hin dIII (13575)
Terminator
Bam HI Sma I Kpn I (13246)
TEV Leader
Eco RI (13066) Eco RI (12426) Nco I (12076) Nco I (1)
制蛋白质的合成（使用浓度：50µ g/ml)
RNaseA: C 或 U 的 3’ － P 与相邻的 5’ － OH 处切开 RNA 。
配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮 15分钟，分装成小份储存于－20℃。
质粒DNA质量检测
1. DNA 纯度：吸光值检测：检测 260nm 、 280nm 吸光值，紫外分光光度计 A260/A280=1.8 － 1.9 ；
pU1301+1.5KB外源
• 双酶切： BamHI+KpnI
ALPHA
pUC19
Eco RI (397 )
P(BLA)
Acc 65 I (409) Ava I (41 3) Xma I (41 3) Kpn I (41 3) Sma I (41 5 )
AP r
pUC19
2686 bp
Bam HI (41 8) Pst I (440) Hin dIII (448)
实验材料
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻 DNA 片段的 pU1301 载体的大肠杆菌 菌液。
操作步骤
1. 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应
抗生素的 LA 培养基上涂布或划线分离单菌落，
37℃过夜培养）；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗
生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜
混合后依次加入点样孔中；
5. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开 电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔
在电泳槽的负极一端）；
6. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µ g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15 min， 在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。
质粒电泳检测
一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）
试剂的作用（二）
Solution III 中和后，宿主 DNA 由于很大，碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与 SDS、蛋白 质、高分子量的 RNA 等缠绕在一起沉淀下来， 而质粒 DNA 由于很小且双链未分开，能够迅速 配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
试剂的作用（三）
1. 苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的 蛋白质等杂质； 2. 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 3. TE 或H2O：溶解质粒DNA
典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：
氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 β－巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）、
牛血清白蛋白（BSA）
注意
1. 注意阅读商家提供的产品说明书，了解所使用工具酶 的浓度和最适作用条件，不要用错了Buffer和作用的
温度等；
2. 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作；
1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有
RNA。 2. 质 量 检 测 ： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 一 般 有 三 条 带 （超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附 近无DNA带（无染色体DNA污染）。
3. DNA的定量
（1）荧光检测仪 Hoechst33258: 可 与 纳 克 级 的 DNA 结 合 ， 而 几 乎 没 有
Gus first exon Catalase intron Gus second exon Histidine tag
Bst EII
Mazie Ubiquitin promotor
Kpn I (11754) Sal I Hin dIII (11015) Bst XI
Nos poly-A
CaMV35S promoter
Xho I (9995)
PU1301
T-Border (right)
14336 bp
pVS1 sta
hygromycin (R)
Xho I (8901)
CaMV35S polyA T-Border (left)
Sac II
pVS1 rep
kanamycin (R)
pBR322 bom pBR322 ori
碱裂解法用到的试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 µ g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1% Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） EDTA （pH 8.0） 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇 10 mM 1 mM
试剂的作用（一）
Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞 内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打 开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的 质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;
3. 使用移液器吸取酶时，tip头只能刚刚插入液面吸取；
4. 如果有多个反应，酶、buffer、水等应配制成mixture
再分装；
5. 各种成分加完后应混匀，然后在离心机上短暂离心。
BamH I：
G▼GATT C C CTAA▲G
Kpn I:
G GTAC▼C C▲CATG G
含外源DNA片段的载体(M812) 的限制性内切酶消化 目的载体（pUC19)
P(LAC) ORI
分子克隆的主要步骤
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接 6. 感受态细胞的制备 7. 连接子转化感受态细胞 8. 重组子筛选及鉴定
质粒载体的提取
载体必备条件
质粒的提取
碱裂解法，主要包括4个步骤： 1. 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的 培养基中，培养至对数生长后期；
2. 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理
裂解细胞； 3. 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的 KAC 缓冲液处理后离心； 4. 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。
开环
线型 超螺旋
不同末端克隆的要求及特点
外源DNA 克隆的要求
线状质粒DNA常 需用磷酸酶 （CIP）处理
特点
一般酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向插入 重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝 一般酶切位点可保留, 非重组克隆背景低 不需CIP处理 外源DNA只以一个方向插入重组质粒中 不同酶切的平头可连接 非重组克隆的背景高 质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失 （不同平端酶） 重组质粒可能带有外源DNA的串联拷贝
培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体， 倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽 量将菌液倒干净； 4. 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞， 震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至 清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
（50 l反应体系，用1.5 ml tube，冰上操作） 质粒 DNA 30 l
BamH I (10u/µ l)
Kpn I (10u/µ l) 10×buffer ddH2O Total
1 l
x 9 = 9ul
1 l x 9 = 9ul
5 l 13 l 50 l x 9 = 45ul x 9 = 117ul
分别取5 l 酶切产物用0.8％－1.2%凝胶检测酶切效果
电泳检测
点样顺序： 1. Marker 2. pUC19质粒对照 3. pUC19质粒酶切产物
4. M812 质粒对照
5. M812 质粒酶切产物
2011本科生酶切图片
• • • • • lane1-4, pUC19酶切产物 Lane5 , pUC19质粒 Lane6， M812质粒 Lane7-10, M812 酶切产物 Lane11, DL-2000 marker,
RNA or SS－DNA
琼脂糖凝胶电泳检测
1. 将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放
置在工作台上；
2. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微
波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时
倒胶；
3. 凝胶凝固后，小心拔去梳子；
4. 将5µ l DNA样品与1µ l上样缓冲液和4µl H2O
7.
12000 g离心10分钟；
8.
吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂 质）至另一个 1.5ml 离心管中，加入 2/3 体积的 异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 g 常温离心15分钟；
9.
10. 倒尽上清，加500 l 75％乙醇浸洗除盐，（放 置片刻后离心5分钟，弃上清） 11. 彻底干燥后加40l 灭菌超纯水溶解； 12. 质粒的质量检测，-20℃保存。
试验中用到的抗生素和酶
氨苄青霉素（ Ampicillin ）： 其主要是通过抑制细胞
壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。