全血胆碱酯酶活性的测定

全血胆碱酯酶活性的测定

――羟胺三氯化铁法

实验目的

1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步骤及酶测定的临床意义。

2. 了解常见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。

3. 学会末梢血的采集。 实验原理

血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。 未被胆碱酯酶水解而剩余的乙 酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量 成正比。在波长520nm 比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。 试剂和材料

采样、运输和保存 用血色素吸管，取指血20卩L ,注入比色管中（事先加入0.98mL 磷酸盐缓冲液）, 立即进行测定。 实验步骤

A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL 全血 ------- 却37C 水浴 5min ——> +1.0mL 乙酰胆碱应用液 —— 37C 水浴30min

B 对照管0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL 全血 +1.0mL 水 ----- > 37

C 水浴 30min

C 标准管1.0mL 磷酸盐缓冲液------ -> 37C 水浴5min ----------- > + 1.0mL 乙酰胆碱 应用液 ----- > 37C 水浴30min

D 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 ------- 37C 水浴 30min

蒸馏水

盐酸溶液（1 + 2） 碱性羟胺溶液 磷酸盐缓冲液（PH= 7.20）

三氯化铁溶液

分光光度计 10mL 比色管 漏斗

恒温水浴箱，控温土 05C 采血针头 血色素吸管

37C 水浴5min ——>

37 C 水浴 5min 手+1.0mL 水

水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操作:

1. 加入4.0mL碱性羟胺溶液，充分振摇2min；

2. 加入2.0mL盐酸溶液，充分振摇2min ；

3. 加入2.0mL三氯化铁溶液，充分振摇；

4. 滤纸过滤，520nm比色。

实验结果

表1-1 520nm波长下样品的吸光度

样品编号A B C D

吸光度0.2990.0030.5380.000

结果计算

①计算酶活性的绝对值

3.149

Y= 100=197

1.60

Y—酶活性的相对值，%;

Xs—被测血样中酶活性的绝对值，卩mol(0.02mL • 37C・30min);

Xc —正常人血中酶活性绝对值，卩mol(0.02mL • 37 C • 30min)。Xc=1.60卩mol(0.02mL • 37C ・30min)

讨论

1. 由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考标准，遂以课件上浙江地区健康人

胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女： 3.19 ± 0.398卩mol ;因3.149卩mol在3.19 ±

0.398卩mol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。

2. 各组所测数值偏差较大，可能与操作差异如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导

致胆碱酯酶活性变化有关。

带入得:

Xs=0.538 0.003 0.299 7=3.149^ mol

Xs：水解乙酰胆碱的浓度，卩

A: 试剂空白为参比的在波长

以

0.538

mol(0.02mL • 37 30min); 处

样品管的吸光度值;

520nm

B:以试剂空白为参比的在波长

C:以试剂空白为参比的在波长

②计算酶活性的相对值

520nm

520nm

处对照管的吸光度值;

处标准管的吸光度值。

3. 采血要迅速，防止凝固及氧化；振摇要充分，同时防止液体溅出；比色时有以D管

调零。

注意事项

1•采血前应准备好试管，提前加入磷酸盐缓冲液；

2•采血时严格消毒，用过的采血针放入利器筒中，棉签放入垃圾桶中，不可混放；

3•准确控制水浴的温度和时间，否则会影响实验结果；

4•加入三氯化铁显色后，20 min内比色。