抗氧化实验方法

2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测
2.2.
3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定
（1）实验试剂的配制
DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。

样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。

（2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定
向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。

振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。

%100)(0
210⨯--=A A A A 清除率 式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度
A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。

2.2.
3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定
（1）实验试剂的配制
Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。

邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。

样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。

（2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定
邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。

将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V 0。

挥发油清除超氧阴离子速率V 1的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入1.8ml 蒸馏水，0.2ml 不同浓度的挥发油于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。

将记录的数据以
时间为横坐标，吸光值为纵坐标，做直线回归得到的斜率表示挥发油清除速率超氧阴离子的速率V 1。

清除率计算公式为：
清除率=%1000
01⨯-V V V 2.2.2.3 羟自由基·OH 清除能力测定
（1）实验试剂的配制
pH=7.4的磷酸盐缓冲液：称取13.609g KH 2PO 4，加蒸馏水溶解定容至250ml ，为A 液；称取45.644gK 2HPO 4，加水定容至500ml ，为B 液。

以体积比A 液：B 液=19：81的比例配置，得到pH=7.4，0.2mol/L 的磷酸缓冲溶液。

5mmol/L 邻菲罗啉水溶液：称取邻菲罗啉0.2478g ，用蒸馏水溶解定容至250ml ，得到浓度为2.5mmol/L 的溶液。

7.5mmol/L FeSO 4溶液：称取1.0428g FeSO 4·7H 2O ，用蒸馏水溶解定容至500ml ，得到浓度为7.5mmol/L 的溶液。

1%H 2O 2溶液：用30%的过氧化氢溶液稀释30倍即得1%过氧化氢溶液。

样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。

（2）清除羟自由基·OH 能力测定
在试管中分别加入2ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液，0.3ml 5mmol/L 邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入0.2ml 7.5mmol/L FeS04溶液，每加一管后立即混匀。

然后向其中加入提取溶液，混匀，再加入1%的H 2O 2 1ml ，最后补充体积至8ml 。

另再做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1%的H 2O 2 1ml ，未损伤管不加H 2O 2，最后补充各管体积至8ml 。

于37℃下保温1h ，测在536nm 下的吸光值，计算清除率，其计算公式为：
%1000
102⨯--=A A A A 清除率 A 0--未损伤管的吸光值；
A 1--损伤管的吸光值；
A 2--加样品液的吸光值。