抗氧化实验方法
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂(完整资料).doc
【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验方法
1还原力的测定之羊若含玉创作样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混杂液中.混杂物在50℃保温20min，然后在反响混杂物中参加2ml 10%的TCA，混杂后以3000rpm离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反响试管中反响，10min后测定其在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还原力越强.注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变更，例如2.5，5之类变更.但具体情况应依据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表.铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中.比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混杂，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）.清除率盘算公式为：空白为1.5 ml 95%的乙醇参加1.5 ml蒸馏水调零.式中：Ac——对比为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，但是具体情况应视清除率而定，最终成果应有清除率大于50%和小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操纵.并且DPPH试剂很昂贵，用时注意勤俭.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 在卵黄磷脂体系中抗氧化才能的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模子反响体系包含:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS 配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL.对比管除不加样液外其他试剂同前.将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温造就1h.取出后，参加20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对比管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分离参加质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却.空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率暗示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一参加样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应放置冰箱保管.酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调剂，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度进行调剂.硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保管.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再在50℃水浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶盛装.4 过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等先生主编的食品剖析实验课本一书.5 超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对比）：对比组和空白对比组参加4ml 蒸馏水（去离子水）和，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白对比管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对比.（V对比在0.05A/min~0.065A/min之间，不然应调剂邻苯三酚参加量）样品自氧化速率（V样品）：样品组和空白组均参加一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml，在25℃水浴20min后，样品组参加0.2ml （或0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空白组以相同体积蒸馏水（去离子水）代替.震匀后立时在320nm处测定吸光值.迅速混匀并开端计时，每隔30 s读取吸光值,4 min后停止，以空白管调零.作吸光度随时间变更的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式盘算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率(%)=(V对比-V样品)/V对比×100V对比－对比组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响，只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才干有效的清除体内产生的自由基，才干表示出一定的生物活性.由于体外抗氧化测定办法容易操纵，周期短，因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采取体外抗氧化体系.但体外抗氧化体系往往与人体内的生理情况相差太大，许多研究成果标明采取体外办法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表示不出应有的抗氧化效果，因此抗氧化剂的抗氧化效果在采取体外办法进行初步评价后应采取动物实验进行体内评价.人体在正常生理代谢进程中会产生少量的含氧自由基，如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除.因此，在正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中，正常量的自由基对细胞的生长、决裂、解毒等具有有益的作用，在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义.然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下降，从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常，致使自由基与机的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等产生反响，生成大量氧化物或过氧化物，并进一步引起细胞死亡和组织损伤.业已证明，氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)沾染等均有亲密关系.D-半乳糖诱导的亚急性衰老模子是依照衰老的代谢学说树立的，其机制与糖代谢紊乱[6]、D-半乳糖醇中毒[7]和活性氧自由基多余有关；众多研究标明是生物体内含有半乳糖氧化酶，在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基(O2·-)和H2O2；如果长期人为地赐与过量D-半乳糖，使机体和细胞内自由基产生过量，除了造成组织细胞直接损伤外，还导致抗氧化酶活气下降和过氧化产品积聚，从而表示出与人类自然衰老相似的生化变更、免疫功效低下、基因表达与调控异常细胞滋生力下降及细胞退化性衰变等.有研究标明，D-半乳糖可下降人胚肺二倍体成纤维细胞(HBS)，从而使该细胞SOD活气下降和过氧化产品MDA增多，从而起到加快细胞老化的作用.本文在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性，但其在生物体内的作用效果尚不清楚.为此本章采取D-半乳糖诱导致衰老少鼠作为模子，分离以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性作为评价指标，探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用，为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响，明确其物质基本和相关机制提供证据.。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化实验方法
1还本力的测定之阳早格格创做样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐慢冲液（pH6.6）战2ml 1%的铁氰化钾溶液的混同液中.混同物正在50℃保温20min，而后正在反应混同物中加进2ml 10%的TCA，混同后以3000rpm离心10min，与上浑液2ml与2ml蒸馏火以及0.4ml 0.1%氯化铁正在反招考管中反应，10min后测定其正在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还本力越强.注意：修议蛋黑浓度以5mg/ml安排变更，比圆2.5，5之类变更.然而简曲情况应根据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐慢冲液的配制睹附表.铁氰化钾溶液应衰拆正在棕色瓶中.比色皿的用法：可睹光(>400nm)用玻璃比色皿（即不标字母大概者标G的比色皿），紫中光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基扫除活性的测定将1.5ml样品液增加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混同，振荡，正在室温下搁置30min，而后正在波少517nm处检测（Ai）.扫除率估计公式为：空黑为1.5 ml 95%的乙醇加进1.5 ml蒸馏火调整.式中：Ac——对于照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏火正在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇正在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液正在517nm处的吸光值；注意：修议酶解液蛋黑浓度以2mg/ml 安排变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，然而是简曲情况应视扫除率而定，最后截止应有扫除率大于50%战小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴心罩战脚套举止支配.而且DPPH试剂很高贵，用时注意俭朴.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称与0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 正在卵黄磷脂体系中抗氧化本领的测定以卵黄脂蛋黑为底物的LPO模型反应体系包罗:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS慢冲液补脚至2.0mL.对于照管除不加样液中其余试剂共前.将上述2种试管共时置37℃恒温火浴锅中保温培植1h.与出后，加进20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对于照管于3500r/min离心10min，与2.0mL上浑液，分别加进品量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0mL，加塞于100℃火浴15min，与出热却.空黑管以 2.0mLPBS溶液代替，正在532nm下测定吸光度，样品对于卵黄脂蛋黑LPO 的压制率表示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加进样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应搁置冰箱保存.酶解液蛋黑浓度以5mg/ml安排安排，然而简曲应视扫除率大小而定，对于酶解液蛋黑浓度举止安排.硫代巴比妥酸溶液需搁置于棕色瓶内保存.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再正在50℃火浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶衰拆.4 过氧化值的测定参照本食品教院林华娟等教授主编的食品分解真验道义一书籍.5 超氧阳离子自由基扫除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对于照）：对于照组战空黑对于照组加进4ml 蒸馏火（去离子火）战，0.1 mol/LTris-HCl 慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm 处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑对于照管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对于照.（V对于照正在0.05A/min~0.065A/min之间，可则应安排邻苯三酚加进量）样品自氧化速率（V样品）：样品组战空黑组均加进一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式估计样品对于超氧阳离子的压制率：式中：压制率(%)=(V对于照-V样品)/V对于照×100V对于照－对于照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物真验资料：戴自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效验受到多种果素的效率，惟有正在死物体内具备抗氧化做用的物量才搞灵验的扫除体内爆收的自由基，才搞表示出一定的死物活性.由于体中抗氧化测定要领简单支配，周期短，果此评介一种物量的抗氧化效验往往最先采与体中抗氧化体系.然而体中抗氧化体系往往与人体内的死理环境出进太大，许多钻研截止标明采与体中要领评介灵验的抗氧化剂加进人体后却表示不出应有的抗氧化效验，果此抗氧化剂的抗氧化效验正在采与体中要领举止收端评介后应采与动物真验举止体内评介.人体正在仄常死理代开历程中会爆收少量的含氧自由基，如超氧阳离子、羟自由基、过氧化氢等，那些自由基通过自然存留于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维死素E组成的抗氧化系统去与消.果此，正在仄常状态下，体内自由基保护正在一定火仄并处于动向仄稳中，仄常量的自由基对于细胞的死少、团结、解毒等具备有益的效率，正在杀菌、免疫安排等圆里具备主动而要害的意思.然而，随着删龄大概正在某些病理状态下以及肌体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下落，进而引导肌体代开非常十分而骤然爆收洪量活性氧自由基；大概由于肌体抗氧化物量缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的仄稳得常，以致自由基与机的一些死物大分子，如蛋黑量、核酸、脂量等爆收反应，死成洪量氧化物大概过氧化物，并进一步引起细胞牺牲战构制益伤.业已道明，氧化益伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉软化、神经退止性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)熏染等均有稀切闭系.D-半乳糖诱导的亚慢性衰老模型是依照衰老的代开教道修坐的，其体制与糖代开混治[6]、D-半乳糖醇中毒[7]战活性氧自由基过剩有闭；稠稀钻研标明是死物体内含有半乳糖氧化酶，正在催化D-半乳糖时可爆收超氧阳离子自由基(O2·-)战H2O2；如果少久人为天赋予过量D-半乳糖，使肌体战细胞内自由基爆收过量，除了制成构制细胞曲交益伤中，还引导抗氧化酶活力下落战过氧化产品聚集，进而表示出与人类自然衰老相似的死化变更、免疫功能矮下、基果表黑与调控非常十分细胞繁殖力下落及细胞退化性衰变等.有钻研标明，D-半乳糖可落矮人胚肺两倍体成纤维细胞(HBS)，进而使该细胞SOD活力落矮战过氧化产品MDA删加，进而起到加速细胞老化的效率.本文正在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋黑酶解物具备体中抗氧化活性，然而其正在死物体内的效率效验尚不领会.为此本章采与D-半乳糖诱引导衰老小鼠动做模型，分别以小鼠的血浑、肝净战心净构制中的丙两醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苦肽过氧化物酶(GSH-Px)活性动做评介指标，探讨鹰嘴豆蛋黑酶解物正在死物体内的效率，为掀穿鹰嘴豆蛋黑酶解物对于体内过氧化状态的效率，明确其物量前提战相闭体制提供凭证.。
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一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂
3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化 方法
DPPH法是测定物质抗氧化性能的一种快速简便的方法。
DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基, 在特定波长(515nm下有最大吸收)下测定DPPH与抗氧化物质反应前后吸收值的变化可定量测定被测物质的抗氧化能力，若受试物能清除它,则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。
一、实验方法用微量移液器按表1的体积准确吸取C1、C2、S1、S2四组样液加入96孔板中，室温避光孵育30min后，用酶标仪测定在492nm（我们实验条件下）处的吸光度。
为消除无水乙醇与样品溶液引起的吸光度，分别设定对照空白与样品空白。
所用试剂与DPPH清除率计算公式如下：DPPH：0.25mM 无水乙醇配制，现配现用；DPPH清除率(%)={1 - (S1– S2) / (C1– C2)} × 100(S1、S2、C1、C2分别为样品、样品空白、对照、对照空白的OD492nm)。
表1 样品试剂用量表C1C2S1S2无水乙醇(μL) 样品(μL) DPPH(μL)合计(μL) 100100200200200100100200100100200即2,2‘-azino-di(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonic acid，该方法是以这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。
ABTS与过硫酸钾反应生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS·+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS·+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS·+这种自由基的最大吸光波长下(一般选择734nm) 检测吸光度的变化来反映物质的抗氧化能力。
1、ABTS工作液的配制准确称量ABTS粉末溶于过硫酸钾(终浓度为2.45mM)配制为7mMABTS溶液，室温放置12-16h以备用。
实验前用无水乙醇稀释至其OD630nm=0.70(±0.02),标准曲线如下:表2不同浓度的ABTS自由基在630nm处光吸收值(OD)由表2知，实验应选择0.3mM的ABTS。
抗氧化实验——精选推荐
1材料和方法
1.1材料
精炼棕榈油、枸杞多肽粉末；
1.2实验处理
Ⅰ组：空白对照组，棕榈油中不添加任何抗氧化剂；
Ⅱ组：试验组，棕榈油中添加0.02%枸杞多肽；
1.3实验方法
1.3.1油脂加速实验(主要针对油脂的生产及贮存)将经过实验处理的棕榈油一并放置于(63±1)℃恒温培养箱中，每隔一定时间(
2.5、5、7.5、10、12.5、15、20和35天)测定棕榈油的过氧化值。
1.3.2过氧化值的测定按中华人民共和国国家标准《GB5009.37食品卫生检验方法理化部分》规定进行。
1.4统计方法
采用SPSS统计软件包中配伍组设计F检验。
2结果
2.1油脂加速实验
图1为几种抗氧化剂对棕榈油稳定性的影响。
棕榈油在(63±1)℃中随着时间延长而过氧化值升高。
添加抗氧化剂后，可以显著推迟过氧化值的升高，即可提高棕榈油的稳定性。
图1抗氧化剂对(63±1)℃下储存棕榈油的过氧化值的影响
图2抗氧化剂对高温(165±5)℃处理棕榈油的过氧化值的影响。
抗氧化实验
抗氧化实验：,1，熊果酸对超氧阴离子自由基（O-2·）的清除实验本实验采用邻苯三酚自氧化法，即采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。
但是加入抗氧化性物质后会对其产生清除作用，从而对其进行抗氧化性能的评价。
取试管，加入不同浓度的熊果酸溶液（5mg/10mL）各50、100、200uL以及200uL Vc 进行阳性对照，同时分别取相同体积的甲醇做对照。
在试管中分别加入50mmol/L，pH8.3K2HPO4-KH2PO4缓冲液4.5mL.在25℃水浴锅保温10min，加入预热至25℃的50mmol/L邻苯三酚的盐酸溶液10uL迅速摇匀，倾入1cm的比色杯中，以缓冲液调零，在325nm处，每隔30s测吸光度1次，连续测定15min。
2熊果酸对羟自由基（·OH）的清除实验(1) 本实验采用Feton体系法产生羟自由基，即:H2O2+Fe2+ OH +H2O+Fe3+。
然后在体系中加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收，可以利用该吸光度值来表示羟自由基的含量。
取不同的试管分别加入0.5mg/mL熊果酸标准品各50、100、200uL以及200uL甘露醇作为阳性对照。
再分别加入1mL9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1mL9mmol/L FeSO4，1mL8.8mmol/L H2O2, 用双蒸水补齐至5mL，充分摇匀，迅速倒入1cm的比色杯中，于510nm处测定其吸光度值，以甲醇调零。
可以根据吸光度值判断样品对羟自由基的清除作用。
（2）羟基自由基清除能力的测定。
量取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml样品溶液于试管中，用蒸馏水补齐至1ml，依次加入0.15mol/L FeSO41ml、2mmol/L水杨酸1ml，最后加6mmol/L H2O2 1ml启动反应，37℃反应1h，测510nm的吸光度。
抗氧化实验方法
2.2.3 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化性[9]
2.2.
3.1 邻苯三酚的自氧化速率的测定
取4.5ml50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）、4.2ml蒸馏水倒入试管中，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入50μL同样在25℃水浴中预热过的30mmol/L邻苯三酚溶液，迅速摇匀后倒入比色皿，在325nm下每隔30s测定一次吸光度，将其自氧化速率控制在0.060～0.065A/min，然后计算线性范围内每分钟内吸光度的增加即回归直线的斜率，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白对照，并记录结果。
2.2.
3.2 加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定
严格按照上述步骤，在加入邻苯三酚前先分别加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml 的样品液，同时蒸馏水的加入量要分别减去相对应加入的样品液的体积，以pH8.2 Tris-HCl缓冲液为空白对照，测定各组分溶液吸光度值。
为了验证所提取的蛋白质以及黄酮类物质的抗氧化活性大小，本次实验选用0.05mg/ml的维生素C作为检测的对照。
2.2.
3.3计算清除率
抑制率（%）=（△A1／△t－△A2／△t）／（△A1／△t）×100% 式中：△A1／△t为邻苯三酚自氧化时反应速率[10]
△A2／△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。
抗氧化测定方法（三种）
实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。
二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。
邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。
三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。
10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。
（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。
（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。
（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。
抗氧化能力的测定（精选4篇）
抗氧化能力的测定（精选4篇）以下是网友分享的关于抗氧化能力的测定的资料4篇，希望对您有所帮助，就爱阅读感谢您的支持。
DPPH抗氧化能力测定篇一DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力2.1 待测液的制备将绿原酸(纯度56%)、维生素C和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL的无水乙醇溶液。
2.1.1 绿原酸母液的配制称取9.0 mg绿原酸，定容到50ml，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml;mg/ml。
2.1.2 Vc母液的配制称取mg VC，定容到100ml，即可得到VC的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml。
2.1.3 没食子酸母液的配制称取mg 没食子酸，定容到100ml，即可得到没食子酸的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。
分别为mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml。
2.1.4 DPPH母液的配制称取mg DPPH，用无水乙醇定容到100ml，即可得到DPPH的母液。
然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。
CDPPH= mg/ml。
（建议用0.025mg/mL）2.2 DPPH.溶液的可见光谱以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm下扫描。
Amax= nm2.3 抗氧化活性测定DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为nm。
当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。
因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强具体实验步骤及方法：精确吸取的DPPH.溶液2mL与2ml无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在nm处的吸光度值(A0)。
常见体外抗氧化实验方法-抗氧化试验-抗氧化活性实验方法-抗氧化测定法-李熙灿Xican Li
常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。
当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。
实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。
该DPPH溶液避光保存，4h内用完。
（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。
1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
体外抗氧化实验方案
体外抗氧化实验方案一、DPPH自由基清除法[原理] DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。
分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。
ON2NONN2NO2当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。
DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。
[实验步骤]1.1 DPPH测试液的配制 6.25,10ˉ5M取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。
取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A,1.2-1.3之间最佳。
该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。
1.2 样品液的配制 Vc溶液(0.25mg/ml)称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液1.3 预试取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。
此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。
【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。
其用量梯度宜设为40、80、 120 、160、200μL。
浓度梯度mg/ml为0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400μg/ml 2.5、5、 10、20、401.4 测量A0值的测量:取DPPH溶液2 mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加95甲醇1mL，充分混合，测A值(517nm)，此A值为A(A0多在0.7-0.9之间)。
0 A值的测量:取DPPH溶液2mL加入到小试管(或玻璃瓶)中，加样品液xμL (x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量)，再加(1000 -x)μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值(517nm)。
TMB法测抗氧化性实验步骤
TMB法测抗氧化性实验步骤
TMB法是一种通过测量抗氧化性来评估建筑材料耐久性的方法。
它包括tetrabromomethane（TMB）氧化剂和新鲜体系形成的协同过程，可以测量材料的抗氧化活性。
具体的TMB法测抗氧化性实验步骤如下：
1、将测试样本（建筑材料）放入离心机，用藻糖水或无锡自制离子强度调节
溶液稀释至稀释倍数；
2、取出1.0ml稀释液，加入1.0mlTMB溶液，然后在恒温箱里储存2小时；
3、保持TMB和样本恒定的浓度、温度和pH，用分光光度计测量TMB流失的量；
4、将结果处理成关联指数，用公式将关联指数转换为R值，R值越高抗氧化
性越强。
这种方法比较简单，在短时间内可以评估建筑材料的抗氧化活性。
抗氧化活性
表明材料的耐久性，抗氧化性强的材料，更容易抵抗外界环境对其寿命造成的影响。
因为建筑材料抗氧化性直接影响建筑物的使用年限，所以TMB法实验已被认为是建筑物质量检验的有效方法，在建筑水泥、建筑涂料等材料的耐久性测试中都有所应用。
TMB法检测的实验需要一定的仪器，如分光光度计和恒温箱等，以及专业的技
术人员，在完成实验步骤过程中需要确保实验条件的恒定。
在建筑设计中，需要考虑使用耐久性更强的材料，这些材料不仅具有良好的耐久性，而且还能确保在受害者行为或极端环境条件下不受影响。
建筑工程师通过TMB法实验测试抗氧化性，从而发现和改善对可能导致失效或毁坏的环境因素。
总而言之，TMB法可以用于测量建筑材料的抗氧化活性，以检测建筑物的长期
耐久性。
耐久材料不仅可以确保建筑物的安全和稳定，还可以延长建筑物的使用寿命，从而使建筑物更能抵御外界环境因素。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性【1】实验方法（体外实验）1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH溶液。
分别取2mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃反应20min。
取出后加入2.5mL 10%三氯乙酸终止反应，5000r/min离心10min。
取上清液2.5mL，加入2.5mL 蒸馏水和0.5mL FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL不同浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe2+()121100%A AA-=-⨯螯合率A0—1mL蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值；A1—样品溶液反应后的吸光值；A2—0.1mL的蒸馏水代替反应体系中FeCl2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O2-）清除率的测定采用邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5mL，置25℃水浴中保温20min，分别加入1mL样品溶液和0.4mL 25mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入1mL 8mmol/L HCl终止反应，于299nm处测定吸光度（A x），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
体外抗氧化实验操作步骤
体外抗氧化实验操作步骤实验前准备：1.准备所需试剂和设备，包括各种化学试剂、实验室常规设备和仪器。
2.清洗实验器具，保持实验环境干净。
3.为各个试验条件设置对照组，以进行对比分析。
实验步骤：1.提取样品：根据实验要求，选择需要评估抗氧化作用的样品。
将样品加入适当的溶剂（如甲醇、乙醇等），用摇床搅拌混合，待溶解半小时左右，然后离心离心管，离心后取上层液体。
2.总抗氧化能力的评估（TAC）：2.1. 准备1.0mol/L的硫酸和5mmol/L的FeSO4溶液。
2.2. 将150μl的提取液加入试管中，加入1ml的硫酸和1ml的FeSO4溶液。
2.3.在37℃恒温水浴中孵育30分钟，形成有色沉淀。
2.4.将试管放入离心机中，离心5分钟，弃去上清液。
2.5. 加入5ml去离子水彻底洗涤沉淀，重复离心和弃去上清液。
2.6. 加入2ml去离子水悬浮沉淀，加入2ml的硫酸和0.2ml的蒸馏水。
2.7.读取吸光度，计算出抗氧化能力。
3.单电子转移能力的评估（SET）：3.1. 准备0.1mol/L的DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）溶液。
3.2. 向试管中加入100μl的提取液和2ml的DPPH溶液。
3.3.避光孵育30分钟，观察颜色变化。
3.4.分光光度计读取吸收值，计算样品的单电子转移能力。
4.过氧化氢清除能力的评估（CAT）：4.1. 准备0.1mol/L过氧化氢溶液。
4.2. 加入100μl的提取液和2ml的过氧化氢溶液。
4.3.在室温下孵育10分钟，读取吸光度。
4.4.通过对照组计算样品的过氧化氢清除能力。
5.还原力的评估（FRAP）：5.1. 准备FRAP试剂：将3mmol/L的2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪酸和10mmol/L的FeCl3混合，配制成10mmol/L的FRAP试剂。
5.2.加入提取液和FRAP试剂，置于37℃恒温水浴中孵育。
5.3.在室温下读取吸光度，计算出还原力。
abts抗氧化实验步骤
abts抗氧化实验步骤ABTS抗氧化实验步骤引言：抗氧化实验是研究食物、药物或其他化合物抵抗氧化应激的能力的重要方法之一。
ABTS（2,2'-联氨基二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)）是一种常用的抗氧化实验试剂，通过测定其与自由基的反应来评估物质的抗氧化能力。
本文将介绍ABTS抗氧化实验的步骤。
一、实验前准备1. 准备所需试剂和仪器：ABTS、过氧化氢、乙酸乙酯、磷酸盐缓冲液、离心管、离心机、分光光度计等。
2. 预热分光光度计：将分光光度计设定在所需的波长（通常为734 nm），并预热至稳定状态。
二、制备ABTS溶液1. 称取适量ABTS粉末，并加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后稀释至所需浓度（通常为7 mM）。
2. 加入相同体积的过氧化氢溶液（通常为 2.45 mM），混匀后静置室温下30分钟，使ABTS与过氧化氢反应生成自由基。
三、样品预处理1. 根据需要，将待测样品（食物、药物或其他化合物）制备成适当的浓度溶液。
2. 对样品进行必要的预处理，如过滤、离心等，以去除杂质。
四、测定抗氧化能力1. 取适量ABTS溶液，并加入等体积的样品溶液，混匀后静置室温下反应一段时间（通常为6分钟）。
2. 将反应液倒入离心管中，离心5分钟使样品沉淀。
3. 取上清液，用离心机离心5分钟，以去除残留的样品颗粒。
4. 用预热好的分光光度计测定上清液的吸光度（OD值）。
5. 测定空白对照组，即只加入样品溶液的ABTS溶液的吸光度。
6. 根据所测得的吸光度计算样品的抗氧化能力。
一般来说，吸光度越低，抗氧化能力越强。
五、数据分析1. 计算样品的抗氧化能力指数（TEAC值），通常使用标准曲线法或对照差法。
2. 根据所使用的方法，将样品的TEAC值转化为抗氧化能力指数单位，如mmol TE/100 g。
六、结果与讨论1. 根据实验结果，评估样品的抗氧化能力。
2. 结果的解释应结合样品的特性和实验条件，进行合理的讨论。
结论：ABTS抗氧化实验是一种常用的评估物质抗氧化能力的方法，通过测定样品与ABTS自由基的反应来评估其抗氧化活性。
抗氧化性测定方法
抗氧化性测定方法抗氧化性是指抗氧化物质对有害氧自由基的清除能力。
现代研究表明，氧自由基与许多疾病的发生和发展密切相关，如心血管疾病、癌症、阿尔茨海默病等。
因此，研究抗氧化性成为了一个重要的领域。
目前，常用于测定抗氧化性的方法有多种，包括化学方法、体外细胞试验、动物模型试验以及临床试验等。
以下将介绍其中一些常用的抗氧化性测定方法。
1.单位面积清除DPPH自由基法该方法利用DPPH自由基（2,2-二苯基-1-苦基肼）的紫色消退来测定样品的抗氧化能力。
实验中，将待测样品与DPPH自由基溶液混合，反应一段时间后，通过测量反应液的吸光度来评估样品的抗氧化能力。
抗氧化能力越强，吸光度下降越大。
该方法简单快速，常用于蔬菜、水果、茶叶等样品的抗氧化性测定。
2.生化物质抗氧化方法该方法通过测定待测样品对生化物质抗氧化能力的影响来评估其抗氧化性。
常用的生化物质包括DNA、脂质、蛋白质等。
例如，可以通过测定DNA的损伤程度来评估样品对DNA的保护能力。
DNA损伤越小，样品的抗氧化能力越强。
3.氧化还原能力测定方法该方法通过测定待测样品的氧化还原能力来评估其抗氧化性。
常用的氧化还原指标包括总抗氧化能力（TAC）、还原力（FRAP）以及氧化标志物（如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等）。
根据测得的氧化还原能力数值，可以评估样品的抗氧化性能。
4.活细胞抗氧化能力测定方法该方法通过使用活细胞进行体外试验，评估待测样品对细胞的保护能力。
常用的细胞包括人类乳腺癌细胞（MCF-7）、人类肝癌细胞（HepG2）等。
实验中，将细胞暴露在氧化应激条件下，并添加不同浓度的待测样品，通过测定细胞的存活率、DNA损伤程度、抗氧化酶活性等指标，来评估样品的抗氧化能力。
综上所述，抗氧化性测定方法具有一定的操作性、精确性、重现性以及规范性，在研究和评价抗氧化性方面发挥了重要的作用。
然而，不同的测定方法适用于不同的样品和需要，需根据具体情况选择合适的方法。
范围广泛的研究表明，物质的抗氧化能力与其健康益处或营养效应之间有着密切的关联，抗氧化性测定方法的研究也将进一步推动抗氧化物质的开发和应用。
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2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测
2.2.
3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定
（1）实验试剂的配制
DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。
样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。
（2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定
向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。
振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。
%100)(0
210⨯--=A A A A 清除率 式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度
A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度
公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.2.
3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定
（1）实验试剂的配制
Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。
邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。
样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。
（2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定
邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。
将记录的数据以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V 0。
挥发油清除超氧阴离子速率V 1的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入1.8ml 蒸馏水，0.2ml 不同浓度的挥发油于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。
将记录的数据以
时间为横坐标，吸光值为纵坐标，做直线回归得到的斜率表示挥发油清除速率超氧阴离子的速率V 1。
清除率计算公式为：
清除率=%1000
01⨯-V V V 2.2.2.3 羟自由基·OH 清除能力测定
（1）实验试剂的配制
pH=7.4的磷酸盐缓冲液：称取13.609g KH 2PO 4，加蒸馏水溶解定容至250ml ，为A 液；称取45.644gK 2HPO 4，加水定容至500ml ，为B 液。
以体积比A 液：B 液=19：81的比例配置，得到pH=7.4，0.2mol/L 的磷酸缓冲溶液。
5mmol/L 邻菲罗啉水溶液：称取邻菲罗啉0.2478g ，用蒸馏水溶解定容至250ml ，得到浓度为2.5mmol/L 的溶液。
7.5mmol/L FeSO 4溶液：称取1.0428g FeSO 4·7H 2O ，用蒸馏水溶解定容至500ml ，得到浓度为7.5mmol/L 的溶液。
1%H 2O 2溶液：用30%的过氧化氢溶液稀释30倍即得1%过氧化氢溶液。
样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。
（2）清除羟自由基·OH 能力测定
在试管中分别加入2ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液，0.3ml 5mmol/L 邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入0.2ml 7.5mmol/L FeS04溶液，每加一管后立即混匀。
然后向其中加入提取溶液，混匀，再加入1%的H 2O 2 1ml ，最后补充体积至8ml 。
另再做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1%的H 2O 2 1ml ，未损伤管不加H 2O 2，最后补充各管体积至8ml 。
于37℃下保温1h ，测在536nm 下的吸光值，计算清除率，其计算公式为：
%1000
102⨯--=A A A A 清除率 A 0--未损伤管的吸光值；
A 1--损伤管的吸光值；
A 2--加样品液的吸光值。