实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
大二下--微生物学实验总结
⼤⼆下--微⽣物学实验总结实验⼀、常⽤培养基配制⼀、器⽫清洗1、试管、培养⽫、三⾓瓶、烧杯等玻璃器⽫的清洗⽤瓶刷或海绵沾上洗⾐粉等洗涤剂刷洗，然后⽤⾃来⽔充分冲洗⼲净。
热的肥皂⽔去污能⼒更强，可有效地洗去器⽫上的油污,去离⼦⽔润洗，倒置晾⼲或烘⼲。
2、全⾃动实验室玻璃器⽫清洗机预清洗洗涤剂清洗⾃来⽔冲洗纯⽔冲洗 135℃⾼温⼲燥消毒3、装有固体培养基的器⽫应先将其刮去，然后洗涤。
带菌的器⽫在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭（苯扎溴铵）消毒液内24⼩时或煮沸半⼩时，再⽤上法洗涤。
带病原菌的培养物最好先⾏⾼压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进⾏洗涤。
⼆、载玻⽚与盖玻⽚的清洗⽤过的载玻⽚与盖玻⽚如滴有⾹柏油，要先⽤皱纹纸擦去或浸在⼆甲苯内摇晃⼏次，使油垢溶解，再在肥皂⽔中煮沸5～10分钟，⽤软布或脱脂棉花擦试，⽴即⽤⾃来⽔冲洗，最后⽤蒸馏⽔润洗数次，待⼲后浸于95％酒精中保存备⽤。
使⽤时在⽕焰上烧去酒精。
三、器⽫包扎1、培养⽫的包扎培养⽫常⽤⽜⽪纸密密包紧，⼀般以5～8套培养⽫作⼀包，包好后进⾏灭菌。
2、试管和三⾓烧瓶等的包扎试管和三⾓瓶盖上铝帽或者塑料帽后⽤⽜⽪纸包扎，进⾏灭菌。
包纸的⽬的在于保存期避免灰尘侵⼊。
四、器⽫清洗和包扎⼩结微⽣物学实验室所⽤的玻璃器⽫的质量要求硬质玻璃，能承受⾼温和短暂烧灼⽽不致破损；器⽫的游离碱含量要少，否则会影响培养基的酸碱度；对玻璃器⽫的形状和包扎⽅法的要求，以能防⽌污染杂菌为准；洗涤⽅法不恰当也会影响实验结果。
因此，在实验准备的时候要严格按照要求洗涤实验器⽫。
包扎并灭菌后备⽤。
五、培养基配制⽜⾁膏蛋⽩胨培养基（培养⼀般细菌⽤）⽜⾁膏 3g 蛋⽩胨 10g NaCl 5g 琼脂 15～20g ⽔ 1000ml实验原理：在配制固体培养基时要加⼊⼀定量琼脂作凝固剂。
琼脂在常⽤浓度下96℃时溶化，在40℃时凝固，通常不被微⽣物分解利⽤。
固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和⽓温的不同⽽有所不同。
细菌革兰氏染色实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌革兰氏染色的原理和方法。
2. 学会使用油镜观察细菌的形态。
3. 了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理革兰氏染色是细菌学中一种重要的染色方法，主要用于区分细菌的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞壁结构上存在显著差异，导致它们在革兰氏染色过程中表现出不同的染色特性。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，交联度大，乙醇脱色处理后，细胞壁收缩，但结晶紫-碘复合物仍然被留在细胞内，使细菌呈紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖层薄且交联度差，乙醇脱色处理后，细胞壁溶解，结晶紫-碘复合物被脱出，再经碱性品红染液复染，使细菌呈红色。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏染色液（草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、碱性品红染液）、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、酒精灯等。
2. 仪器：显微镜、油镜、移液器、移液吸头等。
四、实验步骤1. 涂片：取一环蒸馏水于载玻片中央，用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与玻片上的水滴均匀混合，并涂成约1cm²的薄菌膜。
2. 固定：将涂片在空气中干燥，手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上快速通过3次，以让菌膜更加牢固地贴在玻片上，待冷却后滴加染料。
3. 初染：手持玻片一端，滴加草酸铵结晶紫染液染色2min后，倾去染液。
4. 媒染：向涂片滴加碘液，媒染1min后，倾去碘液。
5. 脱色：向涂片滴加95%乙醇，脱色30s，观察菌体颜色变化，直至出现红色。
6. 复染：向涂片滴加碱性品红染液，复染1min后，倾去染液。
7. 洗涤：用蒸馏水冲洗涂片。
8. 染色观察：用油镜观察菌体形态和染色特性。
五、实验结果与分析1. 枯草芽孢杆菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
2. 金黄色葡萄球菌：呈革兰氏阳性菌，细胞壁厚，呈紫色。
六、实验讨论革兰氏染色是一种简单、快速、有效的细菌分类方法。
革兰氏染色试验步骤
三、实验器材
1 、菌种：大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。
2 、试剂：革兰氏染液:草酸铵结晶紫染液、卢戈氏典液、 95%乙醇、番红复染液； 芽孢染液:5%孔雀绿染色液、 0.5%番红水溶 液。
染色结果：阴性细菌（G-）： 染成红色
2 、芽孢染色原理
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。 芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后 又难以脱色这一特点，用着色力强的染色剂孔雀绿 或石炭酸，在加热条件下，延长染色时间，使染料 不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当 用对比度大的复染剂番红复染后，芽孢仍保留初染 剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色。
内 （扦在接种线上） 培养：倒置平板，28℃培养5-7天。
镜检：拔出盖玻片，擦去背面培养物，将有菌的一 面放在载玻片上，直接镜检或将有菌的一面 朝下，放在滴有0.1%美蓝染色液载玻片中 镜检。
1 盖玻片 2 培养基
酵母菌形态观察方法（美蓝浸片法）
载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色液。 挑取酵母菌苔少许，置美蓝染色液中混合均匀。 用镊子取盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢 将盖玻片放下，以免产生气泡影响观察。 用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况。
氏阳性菌。 典型放线菌的菌丝体分化产生各种形 态特征：
基内丝菌（较细、透明）
菌丝体 气生菌丝（较粗颜色较深）有无气生菌丝
孢子丝（直、波曲、各种螺旋或轮生）等，是分类鉴定的重要依据 孢子：分生孢子（球形，椭圆，杆状或柱状）、孢囊孢子、游动孢子
细菌形态观察实验报告
一、实验目的1. 掌握显微镜油镜的使用方法。
2. 观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
3. 了解细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢等。
4. 培养对细菌形态结构的识别能力。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有多种形态结构。
通过显微镜观察，可以了解细菌的基本形态和特殊结构，为细菌的分类、鉴定和致病性研究提供依据。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：细菌样本、革兰氏染色液、芽孢染色液、水浸片、盖玻片、载玻片等。
2. 仪器：光学显微镜、酒精灯、载物台、切片刀、镊子等。
四、实验步骤1. 观察细菌样本（1）将细菌样本滴在载玻片上，用盖玻片封口。
（2）在显微镜下观察细菌的基本形态结构，如细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等。
2. 革兰氏染色（1）将革兰氏染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其革兰氏分类。
3. 芽孢染色（1）将芽孢染色液滴在细菌样本上，用酒精灯加热。
（2）观察染色后的细菌，判断其芽孢存在与否。
4. 观察细菌特殊结构（1）观察细菌是否有鞭毛、荚膜等特殊结构。
（2）通过水浸片观察细菌的运动。
五、实验结果与分析1. 细菌样本的基本形态结构（1）观察到的细菌具有细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等基本结构。
（2）部分细菌具有鞭毛、荚膜等特殊结构。
2. 革兰氏染色结果（1）部分细菌呈现革兰氏阳性，细胞壁较厚，不易着色。
（2）部分细菌呈现革兰氏阴性，细胞壁较薄，易着色。
3. 芽孢染色结果（1）部分细菌存在芽孢，呈圆形或椭圆形。
（2）部分细菌无芽孢。
4. 细菌特殊结构观察结果（1）部分细菌具有鞭毛，呈螺旋状。
（2）部分细菌具有荚膜，呈透明状。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了显微镜油镜的使用方法。
2. 观察了细菌的基本形态结构和特殊结构，了解了细菌的生物学特性。
3. 培养了对细菌形态结构的识别能力，为今后的学习和研究奠定了基础。
七、注意事项1. 使用显微镜时，注意调节光圈和焦距，确保观察清晰。
实验四革兰氏染色技术(精)
染液因素
注意试剂的有效期，是否变质，异常时不使用 结晶紫易沉淀 卢戈氏碘液易变质 酒精易挥发
细菌因素
衰老变性的细菌会出现染色性改变
视频：革兰氏染色
（2）斜面培养物涂片： 用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将 接种环沾取生理盐水 1~2 环臵于载玻片中央， 然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取 葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水 中，轻轻研匀，涂成直径 lcm 左右的均匀薄膜。
2．干燥
涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将
涂面向上，小心地放臵离火焰 20 ㎝处，远 离火焰 上方微加温略烘促使干燥（ 切勿加热过度，以 防 将标本烧枯）。
3．固定
标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分
让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约 2~3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体 牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染 料的通透性。
5.结果
染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫
色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。 葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以 G+表示；大 肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以 G-表示。
菌悬液
涂片
干燥
固定 滴加无 菌水 取菌苔
涂片
四、注意事项
操作因素
脱色：关键步骤 涂片：太厚影响染色，太薄细菌分散不匀 干燥：过热使细菌菌体变形，排列失常
碘 1g；碘化钾 2g ；蒸馏水 300ml
先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至 300ml 即成。供革兰染色媒染用。
芽孢染色常用方法
芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。
以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。
2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。
3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。
4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。
以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。
微生物学实验3 细菌革兰氏染色和芽孢染色
2022/9/12
Hale Waihona Puke 32022/9/12
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革兰氏染色视频（单击播放）
2022/9/12
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实验三 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一． 实验目的
1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 学习细菌芽孢染色的原理和方法。
二． 实验材料
1. 菌种：大肠杆菌
Escherichia coli、
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
2. 染色液：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、 95%乙醇脱色液、番红染液、孔雀绿染液
➢ 芽孢染色：加1~2滴无菌水于小离心管中→ 用接种环挑 取2~3环菌苔于小离心管中，混匀，制成浓的菌悬液→ 加2~3滴孔雀绿小于离心管中，混匀→置于沸水浴中加 热染色15~20min→取底部菌液数环涂片→干燥→固定 →水洗脱色至流出的水无绿色为止→用蕃红染液染色 2~3min →水洗→干燥
➢ 镜检：
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、 无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
2022/9/12
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三． 实验原理：革兰氏染色的原理？芽孢染色原理？
四． 实验步骤
➢ 革兰氏染色：涂片→干燥→固定→结晶紫染液初染 1min →水洗→碘-碘化钾溶液媒染1min →水洗→ 95% 乙醇溶液脱色至流下的乙醇溶液无明显的紫色→立即 水洗→藩红染液复染1～2min →水洗→干燥
➢ 油镜维护：
2022/9/12
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五. 实验内容
1. 对所给的两种菌进行混合涂片进行革兰氏染色和油镜 观察（上交一张自己满意的染色片）；
2. 对已进行芽孢染色的枯草芽孢杆菌进行涂片、脱色和 复染，并镜检。
2.细菌的革兰染色法、芽孢染色法
革兰氏染色的机理：
主要由于两类细菌的细胞壁成分{肽聚糖 （不溶于乙醇）和脂类（溶于乙醇）}和结 构{肽聚糖层的交联程度及厚度}不同而造 成的。 革兰氏阳性菌肽聚糖含量高（90％）交联 程度高，肽聚糖层厚（用乙醇不易脱色） 革兰氏阴性菌肽聚糖含量低（10％）交联 程度低，肽聚糖层薄（用乙醇易脱色）。
三、实验器材
1、菌种： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（1
号—培养12h，用于革兰氏染色；2号—培养18h， 用 于 芽 孢 染 色 ） ， 培 养 24 小 时 的 大 肠 杆 菌 （Escherichia coli）用于革兰氏染色。
2、染色液和试剂： 草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘
→水洗→复染（番红2-3min）→水洗→干燥
→镜检
芽孢染色结果
（芽孢呈绿色，营养体呈红色）
注意事项
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使 大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 2、染色加热过程要及时补充染液，切勿 让涂片干涸。
五、实验作业
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌 的革兰氏染色的反应性。
液、95%酒精、番红染液、5％孔雀绿水溶液、生理 盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。
3、器材： 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、
擦镜纸、显微镜等。
四、实验方法
革兰氏染色
制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染
（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）
→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→ 观察
革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法因为通过此法染色可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌g主要由于两类细菌的细胞壁成分肽聚糖不溶于乙醇和脂类溶于乙醇和结构肽聚糖层的交联程度及厚度不同而造革兰氏阳性菌肽聚糖含量高90交联程度高肽聚糖层厚用乙醇不易脱色革兰氏阴性菌肽聚糖含量低10交联程度低肽聚糖层薄用乙醇易脱色
微生物革兰氏染色法和芽孢染色法ppt课件
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实验结果
阳性菌（蓝紫色） 阴性菌（红色）
精品
6
细菌芽孢染色法
实验目的
学习并掌握芽孢染色方法；初步了解芽孢杆 菌的形态特征。
实验原理
芽孢：某些细菌在一定的环境条件下，能在 菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体，是细菌的 休眠形式。产生芽孢的都是革兰氏阳性菌。
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革兰氏染色原理
第一步：初染:结晶紫使菌体着上蓝紫色； 第二步：媒染:碘和结晶紫形成大分子复 合物，能被细胞壁阻留在细胞内；第三 步：酒精脱色:细胞壁成分和构造不同， 出现不同的反应——G+菌：细胞不能被 酒精脱色，仍呈紫蓝色；G-菌：酒精将 细胞脱色，细胞无色；第四步:番红复染， G-菌呈红色， G+菌呈紫蓝色。
精品
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细菌芽孢染色法
实验步骤
1）改良的Schaeffer-Fulton氏染色法 制备菌悬液 孔雀绿染液(2滴)水浴加热染色15-20 min 取1小滴，涂片，固定 水洗 番红染液复染23min，倾去染液，水洗 镜检 2）Schaeffer-Fulton氏染色法 涂片固定 孔雀绿染液在微火上加热染色5min 水洗 番红染液复染2min 水洗 镜检
实验二
革兰氏染色法和芽孢染色法
精品
1
革兰氏染色法
实验目的
学习并掌握革兰氏染色方法；了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验原理
革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由 丹麦病理学家Hans Christian Gram 于1884年 创立。该法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
精品
革兰氏染色实验总结[整理版]
![革兰氏染色实验总结[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/6006795aff4733687e21af45b307e87101f6f87e.png)
革兰氏染色法革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师、细菌学家Christain Gram创立。
细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。
为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。
阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。
有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。
革兰氏阳性菌对青霉素敏感，革兰氏阴性菌对链霉素敏感。
可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。
现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH 条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。
此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。
所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。
G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：１）涂片固定。
在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。
微生物实验预习报告 细菌革兰氏染色法及芽孢染色法实验
细菌革兰氏染色法及芽孢染色法实验一、实验目的1. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤；2. 掌握细菌芽孢染色的方法。
二、实验内容1. 制作细菌染色装片。
2. 进行革兰氏染色法操作。
三、实验材料和用具大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。
革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和5％孔雀绿水溶液。
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。
四、操作步骤(一) 革兰氏染色1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
2. 干燥于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法．即将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。
此制片可用于染色。
4. 初染于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。
5. 媒染滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。
6. 脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min水洗。
7. 复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。
8．用滤纸吸干,油镜镜检。
(二)芽孢染色法1．方法1(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。
(2) 于载片上滴人3—5滴5％孔雀绿水溶液。
(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约4-5min。
加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5) 用0.5％沙黄水溶液(或o．05％碱性复红)复染1min，水洗。
细菌的革兰氏染色实验报告
细菌的革兰氏染色实验报告实验名称：细菌的革兰氏染色实验
实验目的：通过细胞壁结构的不同，观察细菌的革兰氏反应，了解细菌的形态特征及分类情况。
实验原理：细菌细胞壁的结构不同，根据革兰氏染色方法可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，革兰氏阴性菌在染色后呈红色，通过观察染色后的细菌颜色能够大致了解细菌的分类情况。
实验材料：
1. 革兰氏染色试剂（含靛派液、碘酒、脱色剂、碱性洗涤液）
2. 外部消毒液、无菌采样棒、无菌平板
3. 革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）
4. 革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）
实验步骤：
1. 将需要实验的细菌分别接种于无菌平板上。
2. 用外部消毒液将无菌采样棒消毒并晾干。
3 .取一个无菌采样棒分别在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的菌落上轻轻刮取，避免沾到无关菌种。
4. 将采样棒沾有菌落的一端放入一滴靛派液中浸润，再在菌液上加2-3滴碘酒，静置1分钟，使靛派液和碘酒渗透到其内部。
5. 倒掉靛派液和碘酒，用脱色剂加水洗涤液一一洗去染色剂，每次洗涤2-3秒，规定洗4次，每次可以轻轻甩去液体。
6. 最后观察染色后的细菌颜色，革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。
实验结果：本次实验观察到革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）染后呈紫色，革兰氏阴性菌（大肠杆菌）染后呈红色。
实验结论：通过细菌的革兰氏染色实验，发现革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，革兰氏阴性菌在染色后呈红色，这种染色方法为快速鉴别大肠杆菌等革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌提供了简单、快捷的方法。
实验 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法
（三）实验器材
1.活材料：
2.染色液和试剂：
革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢染色：培养36 小时 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）
（7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇 脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染2min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者 用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
2.芽孢染色法原理：
Байду номын сангаас
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着 色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据 芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一 特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个 原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热， 以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色， 然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会 脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌 体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬 托出芽孢，便于观察。
（五）实验报告
1.给出Bacillus thuringiensis和 Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革 兰氏染色的反应性。 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样 能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 3.绘图说明你所观察的枯草芽孢杆菌菌体形态， 芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。 4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看 到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？
实验四 细菌的芽孢染色
实验四细菌的芽孢染色生物112 周泓兆1102040226一、目的学习并掌握细菌芽孢染色的原理及方法。
二、原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染色剂亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而加以区别。
芽孢具有厚而致密的壁，因此想要将芽孢染色需要在较高的温度（煮沸）的条件下，用强染色剂（孔雀绿）将菌体和芽孢同时染色。
而同时，实验利用了孔雀绿可经水洗脱色的特点，通过水洗将菌体的着色洗脱，而芽孢因具有致密的壁而不会被水将染色洗脱。
接下来用番红染色，将菌体染为红色，而在常温下品红无法将芽孢着色，因此在显微镜下形成了芽孢为绿色而菌体为红色的现象。
而实验中如果要观察芽孢在菌体中的着生位置，一定要根据各菌的特点来确定培养时间。
三、材料1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），26℃-28℃，培养2-3天。
2.染色剂：孔雀绿染液，番红染液。
3.其它：载玻片，无菌水，洗瓶，酒精棉球，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，接种环，酒精灯，镊子。
四、实验步骤1.制片：将枯草芽孢杆菌涂片并干燥固定。
2.染色：撕取一块比载玻片略窄的吸水纸，覆盖在涂片出，在吸水纸上滴加孔雀绿直至饱和。
用酒精灯加热是染液保持微沸，其间不断添加适量孔雀绿染液，保持吸水纸湿润，染色5min。
3.水洗：待玻片冷却后，用镊子出去吸水纸，再用水瓶轻轻冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
4.复染：用番红染液染色1-2分钟，水洗。
5.镜检：涂片干燥后，滴加香柏油置于油镜下观察。
6.清理：用二甲苯与干净擦镜纸擦净镜头，将涂片放入废片缸，将固体垃圾放入垃圾桶，液体垃圾倒入废液缸，无腐蚀性毒性液体可倒入下水道，用酒精棉球擦洗器材将溅出的染料擦除。
五、结果与讨论：这个实验成功率很高，主要原因是步骤简单，染色效果明显而且影响因素少，洗脱时间对结果影响要比革兰氏染色中酒精脱色时间的影响小很多。
最后结果的小遗憾是孔雀绿绿色的着色较浅，我觉得可以通过适当增加涂片的菌体密度和增加染液煮沸时间，可能会获得更好地效果。
微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色(分析“染色”)共7张
1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；
5将烘、染干水好 菌的液洗涂〔：片注放：倒空不去气能中直染晾接液干在或火，者焰用用上吸烘洗水烤瓶纸，吸以自干免载。菌体玻变片形〕的。一端轻轻冲洗〔切勿将菌膜冲掉〕，
使菌体固直定至于载流玻下片的上。水为无色为止。
6、枯燥：将玻片置于玻片架上，自然枯燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。
脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，G-菌转呈革兰氏阳性结果；
3微、生固物学定实：验细用菌夹的简子单夹染色住和载革兰玻氏片染色一端，迅速通过火焰2～3次， 涂载片玻使不 片菌易、过接体厚种固，杯否、定那木于么夹造子载成、玻局酒片部精菌灯上体、。脱擦色镜不纸完、全显，微而镜使。G-菌呈现革兰氏阳性结果。
将菌载玻片龄倾斜对使少革量菌液兰延伸氏至玻染片中央色。 结果的影响：选取处于活泼生长期— —指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌体尚未成熟或 菌体过老，可能使染色结果呈现相反的结果。
四、实验步骤
〔一〕简单染色的步骤 〔见P11〕
1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上；
在载玻片中央滴一小滴生理盐水，
混匀用并涂接成种薄环膜〔以注无：菌涂片操不作易取过厚少〕许。菌体于水滴中〔注：不要挑破培养基〕，
直至混流下匀的水并为涂无色成为薄止。膜〔注：涂片不易过厚〕。
3、固定：用夹子夹住载玻片一端，迅速通过火焰2～3次， ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带
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实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一、目的要求
1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料
1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）
2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液
3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。
革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤
1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。
2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。
4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载
玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。
酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。
脱色是革兰氏染色中最关键的一步。
6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。
7.用滤纸吸干，油镜镜检。
五、注意事项
为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。
另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。
六、实验内容
1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色
2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。
七、实验报告
1.图示所观察到的菌体细胞的形态与革兰氏染色结果；
2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能超过24小时？
3.在下表中依次填入革兰氏染色所用染料的名称，并填上革兰氏阳性和革兰氏阴性菌在每
步染色后菌体所呈的颜色。
在不影响革兰氏反应的前提下，哪一步可被省略？
4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样才能确保你的操作正确、结果可靠？
附录：细菌的芽孢染色
一、目的要求
学习芽孢染色的原理和方法
二、实验材料
1.菌种：枯草芽孢杆菌，肉汁斜面培养24h；
2.染料：5%孔雀绿水溶液、0.5%蕃红水溶液
3.其他：显微镜、载玻片、接种环、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理
芽孢又叫内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、位置，芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的依据。
由于芽孢壁厚、透性差、不易着色。
当用结晶紫单染色时，菌体呈紫色，芽孢是无色透明。
芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚，透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再用番红复染，则菌体呈红色而芽孢呈绿色。
四、操作步骤
1.制备菌悬液加1~2滴水于小试管中，用接种环挑取2~3环菌苔于试管中，搅拌均匀，
制成浓的菌悬液。
2.染色加2~3滴孔雀绿于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的
烧杯中，加热染色15~20min。
3.涂片固定用接种环取试管底部菌液数环于干净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过
火焰3次温热固定。
4.脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。
5.复染用蕃红染液染色2~3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。
6.镜检干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊和营养细胞为红色。
注意：所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢为宜；取菌不宜太少。