蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化
酶工程与蛋白质工程
酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。
酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。
两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。
一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。
酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。
比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。
再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。
这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。
酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。
这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。
现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。
2. 酶的分子结构分析。
这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。
目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。
3. 酶的基因工程改造。
通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。
常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。
4. 酶的活性和特性检测。
通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。
5. 酶的产量提高。
通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。
二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。
主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
蛋白质与酶工程复习资料
酶工程复习提纲第一章绪论1.酶及酶工程的概念。
酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。
酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。
(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。
1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。
1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。
给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。
1902年，Henri提出中间产物学说。
1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。
1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。
人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。
Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。
现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。
3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。
医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。
（2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。
（3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。
食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。
酶工程期末重点总结
酶工程期末重点总结一、酶工程概述酶工程是将酶应用于工业领域的一门科学，通过对酶的研究和改良，可以提高酶的稳定性、催化活力、选择性和产量，以满足工业生产的需求。
酶工程的应用范围广泛，涉及生物技术、医药化学、食品工程等多个领域。
二、酶的产生和分离纯化1. 酶的产生：酶可以通过天然微生物、重组DNA技术等方法进行生产。
天然微生物通过发酵过程产生酶，而重组DNA技术可以将特定基因导入到宿主微生物中，使其产生目标酶。
2. 酶的分离纯化：酶的分离纯化通常包括细胞破碎、组织液处理、沉淀和层析等步骤。
其中，层析是一种常用的分离纯化方法，包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
三、酶的性质和特点1. 酶的性质：酶是一种特殊的蛋白质，具有催化作用。
酶的催化作用是高度选择性的，可以加速化学反应的速率并降低反应的能量活化值。
2. 酶的特点：酶具有高效、低成本、环境友好等特点。
由于酶具有高度选择性，因此可以在温和的条件下催化反应，减少能耗和废弃物产生。
四、酶的改良和优化酶的改良和优化是酶工程的核心内容之一，旨在提高酶的催化活力、选择性和稳定性，以满足工业生产的需求。
1. 酶的改造：通过理性设计和随机突变等手段，改变酶的氨基酸序列，以改善其性质。
常用的改造方法包括点突变、插入突变和删除突变等。
2. 酶的固定化：将酶固定在材料表面或载体上，增加酶的稳定性和重复使用性。
常用的固定化方法包括包埋法、凝胶包覆法和共价固定法等。
3. 酶的进化：通过模拟自然界的进化过程，通过多代选择和酶库筛选等方法，获得具有改良性质的酶。
进化方法包括DNA重组技术、DNA重组酶库和聚合酶链式反应等。
五、酶工程在工业中的应用酶工程在工业中的应用广泛，涉及到生物能源、纺织印染、制药等多个领域。
1. 生物能源：酶可以催化生物质转化为生物能源，如酶解纤维素制备生物乙醇。
2. 纺织印染：酶可以代替传统的化学处理方法，实现更加环保和高效的染色和整理。
3. 制药：酶可以用于合成药物和研发新药，如利用酶合成青霉素等抗生素。
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用
蛋白质与酶的工程改造技术及其应用蛋白质是构成生物体细胞的基本结构单元，对于生命活动的各种过程都具有重要的作用。
酶则是生物体内催化反应的重要媒介，通过发挥催化活性加速生命过程，维持了细胞的生存。
传统的酶工程技术主要将重点放在酶的分离和纯化上，但是这种方法成本高、效率低，对于大规模生产和应用场景并不适用。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质与酶的工程改造技术不断更新，为生物制药、酶催化反应等领域提供了新的解决方案。
本文将介绍蛋白质与酶的工程改造技术及其应用。
一、蛋白质工程改造技术1.点突变技术点突变技术是将蛋白质基因的某个碱基或氨基酸序列进行改变，从而使其具有不同的功能、活性或特定的理化性质。
这种技术在人类疾病治疗、新型药物研发、工业酵素等领域有着广泛的应用。
例如，通过点突变技术可以将普通抗体转化为更强力、更稳定的人源化抗体，提高其在治疗上的效果；也可以将酵素的催化速率、热稳定性等进行调整，以适应特定的工业需求。
2.融合蛋白技术融合蛋白技术是将两个或多个不同蛋白质结构域进行连接，形成一个新的分子，从而具有多种不同的功能。
融合蛋白技术不仅可以产生新的蛋白质，还可以对原有蛋白质的稳定性、性质等进行调整。
例如，通过将大肠杆菌外膜蛋白（OmpA）与绿色荧光蛋白（GFP）进行融合，可以得到具有膜定位与荧光表达功能的融合蛋白，用于生物成像和药物靶向测定等领域。
3.点突变与融合蛋白技术的结合将点突变和融合技术相结合可以使得蛋白质的活性和稳定性得到双重提升。
例如，通过将发酵产物氨基酸脱羧酶（ADC）与乙醇磷酸酸转移酶（EPAT）进行融合，并进行点突变，可以得到具有更高催化效率和稳定性的蛋白质。
二、酶工程改造技术酶催化反应是生物科学和化学领域中的重要研究内容，具有广泛的应用前景。
酶工程改造技术可以通过改变酶的氨基酸组成、酶的整体结构、酶的环境条件等，调节酶的催化效率和稳定性，达到增强酶活性、改进反应过程、提高酶的选择性等目的。
蛋白质与酶工程教学大纲
《蛋白质与酶工程》教学大纲课程名称：蛋白质与酶工程学分：2学时：32先修课程：生物化学适用专业：生物工程开课系部：生命科学学院一、课程性质、目的和培养目标课程性质：专业选修课课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。
并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。
课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。
二、课程内容和建议学时分配第一章绪论2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。
（二）教学内容第一节蛋白质工程概论第二节蛋白质工程的应用第三节蛋白质工程展望第四节酶工程简介一酶工程二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。
三分类：化学酶工程；生物酶工程。
第五节酶与酶工程的发展简史一酶学研究简史二酶工程研究简史（三）教学重点和难点重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的基本结构组成及功能（二）教学内容第一节蛋白质的基本结构与功能一蛋白质的组成二蛋白质的一级结构三蛋白质一级结构与功能的关系第二节蛋白质的空间结构与功能一蛋白质的二级结构二超二级结构和结构域三蛋白质的三级结构四蛋白质空间结构与功能的关系五蛋白质-蛋白质相互作用（三）教学重点和难点重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用；第三章蛋白质的修饰和表达 4课时（一）教学基本要求掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。
（二）教学内容第一节蛋白质修饰的化学途径一功能基团的特异性修饰1 多位点取代2 单一的或限制性取代3 次级取代二基于蛋白质片段的嵌合修饰第二节蛋白质改造的分子生物学途径一编码基因的专一性位点和区域性定向突变1 编码基因的专一性位点突变2 区域性定向突变二基因融合和基因剪接三 tRNA介导定点搀入非天然氨基酸第三节重组蛋白质的表达一目标蛋白质在大肠杆菌中的表达1 表达载体的一般特点2 与外源基因有效表达的相关因素3 改善表达水平及溶解性的方法二目标蛋白质在酵母细胞中的表达三重组蛋白质在哺乳动物细胞中的表达1161 选择哺乳动物细胞表达体系的优点2 两个主要的哺乳动物细胞表达系统四噬菌体显示（三）教学重点和难点重点：蛋白质的修饰和表达；难点：蛋白质间的修饰；第四章蛋白质的分离纯化及酶的分离工程8课时（一）教学基本要求了解蛋白质和酶分离的一般过程、生物材料的处理方法，掌握酶的分析方法和分离纯化的方法、技术。
酶工程电子教案酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化是指
酶工程电子教案第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎◆细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表3-1 细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法◆通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
◆常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
◆机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法◆通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
◆常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法◆通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
◆常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
◆有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
◆表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法◆通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
酶工程
细胞呼吸强度Qo2：是指单位细胞量在单位时间内的耗氧量。
细胞浓度Cc:指的是单位体积培养液中细胞的量。 Ko2=Qo2?Cc
溶氧速率Kd：是指单位体积的发酵液在单位时间内溶解氧的量。调节溶解氧的方法：1、调节通气量 2、调节氧的分压 3、调节气液接触时间 4、调节气液接触面积 5、改变培养基的性质
12、简述影响酶提取的主要因素？答：影响酶提取的主要因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。①温度：对酶的提取效果有明显影响。适当提高温度，可提高酶的溶解度，也可增大酶分子的扩散速度，但温度过高，易引起变性失活。0-10℃。②pH：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响，为提高酶的溶解度,提取时pH值应避开酶的等电点。③体积：增加提取液用量可提高酶的提取率。提取液的总量一般为原料体积的3-5倍。在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度。适当的搅拌，可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面浓度差，有利于提高扩散速率。适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。
名词解释
酶：具有生物催化功能的生物大分子。
酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。
酶比活：指在特定条件下，单位质量蛋白质或RNA所拥有的没活力单位数。常用来表示酶的纯度。
酶的生产：是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。酶的生产方法：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。
2.酶工程：从应用的目的出发研究酶，就是在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应的原料转化成有用的物质的技术，是生物工程的重要组成部分。
3.酶工程根据酶工程研究方法分为：1）化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成制造人工酶；2）生物酶工程：用基因重组技术生产酶，以及对酶基因进行修饰或设计新基因，从而生成能稳定，具有新的生物活性剂催化效率更高的酶。
4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
7.生物大分子运动性的功能及意义：1）打开一个瞬时的通道；2）识别和调节（通过运动识别底物）；3）催化；4）信息传递。
8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
9.盒式突变：又称片段取代法，利用目标基因序列中适当的限制酶切位点，插入各种的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定的DNA片段。
10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
关于酶工程实验报告
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
02【课堂笔记】《蛋白质与酶工程》-酶的分离与纯化02部分-蛋白质的结构解析与序列测定01部分
第一章酶的分离提取与纯化1.1离心分离和层析分离1.1.1酶的提取方法离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。
离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
1.1.1.1离心机的种类与用途常速离心机，高速离心机，超速离心机1)常速离心机：转速<8000r/min用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒2)高速离心机：转速：1~2.5*104r/min用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器3)超速离心机：转速：2.5~12*104r/min用途：用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化1.1.1.2离心方法差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗粒分不分离的方法。
用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
常用介质：蔗糖、甘油3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。
介质：铯盐1.1.1.3层析分离技术又称色谱技术，是一种物理的分离方法。
利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离根据分离原理分类吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等1)吸附层析原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。
2)分配层析原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
蛋白质与酶工程
蛋白质与酶工程重点1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。
2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。
3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程2）生物酶工程3）固定化酶与细胞4）酶反应器与传感器5）酶的非水相催化4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。
5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。
8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。
10.酶工程的研究范围：1）各类自然酶的开发和生产；2）酶的分离纯化和鉴定技术；3）固定化技术；4）利用其他的生物技术领域交叉渗透；5）多酶反应器的研制和应用。
11.酶的稳定性和稳定化：（一）引起酶失活的原因：1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）；2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合；3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）；4）多肽链的断裂（很强烈）；（二）酶的稳定化：1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）；2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）；3）添加底物辅酶等配体；4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）；5）结晶化。
12.微生物作为酶源的优越性：1）容易获得酶需要的酶类；2）容易获得高产菌株；3）生产周期短；4）生产成本低；5）生产易管理；6）提高微生物产酶的途径比较多。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
用于提取在稀碱溶液中溶解度大 且稳定性较好的酶
用于提取那些与脂质结合牢固或 含有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
主要影响因素
扩散的影响：
酶分子的扩散速度与温度、溶液黏度、扩散面积、扩散距离以及两相 界面的浓度差有密切关系。提高温度、降低溶液黏度、增加扩散面积、缩 短扩散距离, 增大浓度差等都有利于提高酶分子扩散速度, 从而增大提取效 果。 含酶原料的颗粒体积越小,则扩散面积越大,有利于提高扩散速度;适当的搅 拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面,从而增大两相界面的浓 度差,有利于提高扩散速率;适当延长提取时间,可以使更多的酶溶解出来,直 至达到平衡。
2. 酸溶液提取
3. 碱溶液提取 4. 有机溶剂提取
表4-2 酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解 度较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶
酸溶液提取
碱溶液提取
pH值为2～6的水溶液
pH值为8～12的水溶液
指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
饱和度＝
溶液中饱和硫酸铵的体积
溶液的总体积
3) 调整盐浓度的方式
a.
饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）
适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又 不太高时。
配制饱和硫酸铵溶液
在水中加入过量的固体硫酸铵, 加热至50～60℃, 保 温数分钟 , 趁热滤去过量未溶解的硫酸铵 , 滤液在0℃ 或 25℃平衡1～2 天, 有固体析出, 此溶液即为饱和硫酸铵溶 液, 其饱和度为1。
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同, 通过添加 一定量的某种有机溶剂, 使酶或杂质沉淀析出, 从而使酶 与杂质分离 在酶液中加入某些物质, 使它与酶形成复合物而沉淀下来, 从而使酶与杂质分离
酶工程04酶的分离纯化资料
第三节
酶分离纯化的基本过程
一、酶分离纯化方法的选择
菌体内含有核酸，当菌体破裂后释放核酸，这样使菌 体抽提液粘度增加，影响菌体残渣与酶液的分离，干扰酶 蛋白的纯化，有必要除去。 除去核酸可以用核酸酶将其降解成核苷酸，使粘度下 降，便于离心分离。也可用沉淀剂使核酸中带负电荷的磷 酸基与沉淀剂中带正电荷的基团反应生成沉淀，然后离心 除去。另外还有用活性碳吸附除去核酸和核苷酸的，但是 在大量核酸存在时，用活性碳是不行的。
第四节
根据分子大小轻重建立的 分离纯化方法
根据此法建立的方法有：离心、凝胶过滤、透析和超滤等
一、透析和超滤
1.透析（dialysis):是利用蛋白不能透过半透膜而小分子的物 质如无机盐，单糖等可以透过半透膜将蛋白质与小分子杂质 分开的技术。 过程：
2.超滤
上世纪70年代以后，在实验室精制酶的过程中人们开始广 泛采用超滤技术，进行大溶质分子的浓缩、分级分离、纯 化等。其优点是操作简单、快速温和，操作中不产生相的 变化，离子状态的变化以及温度变化。 此法主要是利用压力或离心力迫使溶质按分子量、性状大 小的差异，所需溶质分子留在膜的一侧，小分子物质随溶 剂透过膜被压到另一侧，使大小溶质分子得到分开。其主 要特征是利用有选择透过的微孔膜，在液压作用下，分离 大溶质分子。
酶法；用其他纯酶将产物直接或间接转变为一个可用分 光光度法测定的化合物。例子见P64
化学法：利用化学反应使产物转变为一个可用某种物理方 法或化学方法测出的化合物，再算出酶活性。 放射性化学法：用产物或底物具有放射性的性质，通过测 定放射量的大小，算出酶活性。 （二）连续反应法 指在反应过程中用光学仪器连续检测反应进行情况，分为 非偶联的和偶联的连续反应法 酶 反应 测定方法
生物酶的分离纯化及工程应用
生物酶的分离纯化及工程应用生物酶是一种催化剂，能够在生物体内促进化学反应，加速化学反应速度，具有极高的特异性和活性。
在生物技术领域中，生物酶的分离纯化及工程应用已成为非常热门的话题。
本文将介绍生物酶的分离纯化技术和在工程上的应用。
一、生物酶分离纯化技术分离纯化是将混合物中的目标物分离出来，使其在成品中的含量占到最大比例的过程。
而生物酶的分离纯化是指将复杂的生物体内提取液中的酶，通过不同的分离纯化技术，使其得到高效、高纯度的提取液。
酶提取液中含有大量的蛋白质，因此酶的分离纯化技术需要去除其他与酶无关的蛋白质。
1. 胶体电泳法胶体电泳法是利用电场作用，使混合物中的蛋白质在胶体电泳胶上发生定向运动，从而实现将蛋白质分离纯化的方法。
胶体电泳法可用于对大分子生物酶的纯化。
该方法的优点是操作简单，分离效果好。
2. 离子交换分离法离子交换分离法是利用离子交换树脂的静电吸附特性，将酶与其他蛋白质分离的方法。
该方法常用于生物酶提取液中蛋白质数量相对较少的情况下，作为其后纯化的前置步骤。
3. 柱层析法柱层析法是将生物酶溶液通过配有分层柱的柱子，通过各种柱的层析方法，使混合物中的蛋白质得到分离和纯化的方法。
该方法可用于分离小分子生物酶和蛋白质。
柱层析法分为亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析等各种类型。
4. 聚集法聚集法是利用生物酶分子之间的非共价主键或离子键等相互作用，将酶分子和其他蛋白质分离的方法。
聚集法可用于环境中的酶的大规模分离纯化。
该方法的分离效果好，但对分子量和pH值的要求较高，操作过程较为复杂。
二、生物酶在工程上的应用生物酶在工程上的应用非常广泛，可用于农业、食品、医药等领域，例如：优化销售样品制备、发酵、纤维分解、抗菌和生物浸出等。
1. 纤维分解纤维素是植物细胞壁中的主要成分之一。
纤维素的降解具有重要的工业价值。
因此，寻找提高纤维素降解酶的活性的方法具有重要的价值。
行业中，广泛采用的做法是通过纤维素酶工程菌的生产策略，利用该菌及其降解产物制备出的酶，提高纤维分解过程的效果，降低了生产成本，同时又充分利用了生物资源。
《酶工程》课件-酶的提取与分离纯化
01
02
03
04
低温保存
将酶保存在低温条件下，如冰 箱或冰柜中，以降低酶的活性
损失。
添加稳定剂
在酶溶液中添加稳定剂，如糖 、甘油等，以增加酶的稳定性
。
真空干燥
将酶进行真空干燥处理，制成 干粉或结晶，以便长期保存。
调节pH值
通过调节酶溶液的pH值，可 以稳定酶的构象，降低酶的失
活速率。
实验操作中的安全防护措施
速率，从而计算酶活性。
荧光法
利用荧光物质作为底物，经酶 催化后产生荧光，通过测量荧 光强度变化来检测酶活性。
化学发光法
利用化学发光物质作为底物， 经酶催化后产生发光，通过测 量发光强度变化来检测酶活性 。
放射性同位素标记法
利用放射性同位素标记的底物 ，经酶催化后测量放射性强度
变化来检测酶活性。
酶的保存方法
回收率评估
计算分离纯化过程中酶的回收率，评估实验效率 和经济性。
活性评估
通过测定酶的活性，比较分离纯化前后的变化， 评估分离纯化的效果。
稳定性评估
比较分离纯化前后的酶在不同条件下的稳定性， 评估分离纯化的效果。
03
酶的活性检测与保存
酶活性检测的方法
比色法
通过酶催化特定底物反应产生 有色产物，通过比色测定反应
确保实验操作场所的清 洁和卫生，避免污染。
在操作过程中要轻柔， 避免剧烈搅拌或晃动， 以免酶失活。
注意控制实验温度和 pH值等参数，确保酶 的稳定性和活性。
在分离纯化过程中，要 密切关注实验进程，及 时处理通过电泳、质谱等技术手段检测酶的纯度，确保 达到实验要求。
佩戴防护眼镜和实验服
在进行实验操作时，务必佩戴防护眼 镜和实验服，以防止试剂溅出伤人和 避免污染衣物。
酶工程3 第三章：酶的分离纯化
3.3.1 细胞破碎的方法
机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73
3.3.2酶提取的方法
根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。
盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 p76
3.3.3影响酶提取的主要因素
1 提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－
1 分离过程中新设备、新技术的应用会取得 事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。 采用膜分离技术等。
2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失 活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。
3.4 沉淀分离
沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀
收集沉淀
10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提 取。
2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH 不宜过高或过低，防止酶失活。
3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离 成本提高。一般为原液的3-5倍
4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶 或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损 失。
提取时的注意事项
N－末端分析 只适用于一条肽链
免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
3.3分离与纯化
分离（提取）：在一定条件下，用适当的
溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。
纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法
（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶， 再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一 性，将酶纯化。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
3.5 离心分离
借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小密度的物质分离的技术。
大学酶工程与蛋白质工程教案
大学酶工程与蛋白质工程教案引言酶工程和蛋白质工程是生物技术领域中最重要的研究方向之一。
这两个领域是紧密联系的，它们的研究旨在开发制造更加高效、可持续和环保的生产方法。
本教案将介绍酶工程和蛋白质工程的基本知识和实践技术。
一、酶工程介绍1. 酶的定义和种类：酶是一种生物催化剂，可加速特定化学反应的速率。
酶的种类包括氧化酶、酯酶、纤维素酶、葡萄糖酶等。
2. 酶的制备和分离：酶的制备和分离过程主要包括培养酶产生菌株、酶提取、酶纯化等步骤。
常用的酶提取方法包括超声波法、高压破碎法等。
3. 酶的催化机理：酶的催化方式与机理因酶而异，通常情况下，酶作用的方式可分为四种基本类型：酸碱催化、亲和催化、共价催化和金属离子催化等。
二、蛋白质工程介绍1. 蛋白质工程的概念：蛋白质工程是指通过有创新性的技术手段，改变蛋白质的某些性质和结构，使其具有特定的功能和应用价值。
2. 蛋白质工程的基本技术：蛋白质工程的基本技术包括蛋白质表达及纯化、变异、修饰、折叠、精细调节、重组等。
3. 蛋白质工程的应用领域：蛋白质工程的应用领域非常广泛，如药物、生物材料、生物传感器、工业酶等。
三、酶工程和蛋白质工程的联系与应用1. 酶工程和蛋白质工程的联系：酶工程和蛋白质工程紧密相连，两者都是通过改变酶或蛋白质的结构和特性来实现更高效的生产。
2. 酶工程和蛋白质工程的应用：酶工程和蛋白质工程的应用领域非常广泛，涉及到药物、食品、能源、生物传感器等领域。
此外，酶工程和蛋白质工程技术也可以用于污水处理、环保等领域。
四、实验与教学内容1. 酶的制备和分离实验：通过培养酶产生菌株，提取和纯化酶，学生们可以掌握酶制备和分离的技术方法。
2. 蛋白质折叠和纯化实验：通过对蛋白质的表达、修饰和折叠过程进行实验，增强学生对蛋白质折叠和纯化的理解。
3. 酶与底物反应动力学实验：通过对酶的催化速率和底物反应动力学的测定，学生们可以学习酶的催化原理和催化机理。
结论总之，酶工程和蛋白质工程是重要的研究领域，在工业生产和医药发展中具有广泛的应用前景。
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2-5 主要的提取方法
1、盐溶液提取 该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取
常用的盐浓度：0.02-0.05mol/L，大多数P酶用该 法提取
R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。
*盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高 而增加的现象 *盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐 浓度升高而降低的现象
（2）离心机的常用分类
❖ 常速/低速离心机：主要用于细胞、细胞碎片和培 养基残渣等有形物质分离，也可分离较大颗粒的酶 结晶分离；
❖ 高速离心机：最大转速1~2.5x104rpm。在酶的分离 中，主要用于沉淀及细胞碎片和细胞器的分离；为 防止离心过程中温度升高而致酶失活，一般用高速 冷冻离心机；
❖ 超速离心机：最大转速达2.5~12x104rpm。主要用 于DNA、RNA（酶）、蛋白质(酶）等生物大分子以 及细胞器、病毒等的分离纯化等。
交换容量更大2.5-4.5mg/克干胶）
离子交换层析的基本步骤
解吸方法--洗脱原理
蛋白质是通过静电引力可逆结合在相应的离子 交换剂上，洗脱蛋白质（即打开蛋白质与离子交 换剂之间的离子键）的常用方法：
①加大反离子的浓度，常用的反离子是NaCl ②改变溶液的pH （改变结合基团的电荷） ③同时改变pH与离子强度
P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱 氢酶等用丁醇萃取，有较好效果
R酶：可用酸苯酚溶液提取
主要的提取方法小结
地
5、影响酶提取的其它重要因素 温度：适当提高，可以提高酶的溶解度和酶分子
的扩散速度；过高则引起酶失活 pH: 在等电点条件下，酶的溶解度最小；为提高
溶解度，要避开酶的等电点;但是，也不宜偏离pI 太远（过高或过低），以免引起酶变性失活
定义：
Ion Exchange Chromatography：以离子交 换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据 各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不 同进行分离纯化的层析方式。
使用规模可大可小；纯化倍数为10左右
离子交换剂分类
①按其活性基团的不同来分
*阳离子交换剂：其活性基团为酸性基团（如磺酸 基，磷酸基，羧基等），在一定条件下，可以解 离出氢离子（H+)与其它阳离子进行交换，故称（ 如：
环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚 合酶、RNA聚合酶等
④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶 ⑤溶酶体：各种水解酶等 ⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶
类、与暗反应有关的酶系
线粒体主要酶的分布（约有120种酶）
部
位
酶的名称
单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-细胞色素C还原酶、
1-2 提取纯化之目的 1)酶催化功能的应用 2)酶学研究
酶的结构、功能、催化机制、催化动力学 酶的生物合成及其调控规律等
1-3 纯化的必要性 1)生物细胞中同时存在多种多样的酶 2)多酶可能作用于同一个底物 3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的
二、酶的提取（extracห้องสมุดไป่ตู้ion)
2-1 了解所分离酶在细胞中的分布 1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用
4、基于特异性结合位置/亲和力的差异 亲和色谱（层析）
5、其它方法（略） （1）基于分配系数的差异：双水相系统萃取法 （2）基于疏水作用的差异：疏水层析 （3）在磷酸钙凝胶柱上分级吸附 （4）羟基磷灰石色谱 （5）冷冻干燥（浓缩）
3-2 常用的分离纯化方法
1、沉淀分离
例 盐析纯化血清免疫球蛋白
A.差速-区带(R-Z)：是根据分离的颗粒在梯度 液中沉降速度的不同，在离心力作用下处于不同 密度梯度层，从而形成一系列区带，达到彼此分 离的目的。
方法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质 （如蔗糖、甘油、CsCl等），待分离的样品以很 薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于 不同组份在梯度液中沉降速率的差别，而在离心 的某一时刻形成了数个分别含不同组份颗粒的区 带。
（3）离心方法的选择
① 差速离心（differential centrifugation) ：即采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉 降速度的颗粒分批分离。
主要用于分离那些差异大的颗粒；操作简单、 方便，但是分离效果较差，一般用于粗分。
差速离心举例
已经破碎的细胞
500g,10min
沉淀：细 胞核
取正常人血清5ml加等量生理盐水混匀 搅拌下逐滴加入饱和硫酸铵使饱和度为20％
↓4℃，10min 离心(3000rpm), 10min，弃沉淀 上清继续滴加饱和硫酸铵使饱和度为50％ 。
↓置4℃，3小时以上 离心(3000rpm), 10min，弃上清 所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml
，使酶充分溶于其中的过程。
2、提取液的选择 根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液
*极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶 *酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。
2-4 酶的提取
3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水 作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐 溶液进行抽提
4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则 可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂 肪或磷脂膜分离； 高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解 析下来。
（4）注意离心温度和介质pH的影响，以免目的 酶凝集、变性和失活，甚至引起转子和离心机其 它部件的腐蚀。
*一般4℃左右，耐热酶除外 *必须是酶稳定的范围内，必要时采用缓冲液
3、过滤与膜分离
（1）透析
透析膜是带有微孔的筛 子，其孔径在一定范围内 是可选的；可用动物膜、 羊皮纸、火棉胶等制成。
的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到 2、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，
而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与 细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的 反应具有一定顺序性
❖ 真核细胞内酶的分布
①细胞膜：ATP酶、腺苷酸环化酶等 ②细胞核：DNA聚合酶、连接酶和RNA聚合酶等 ③线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循
外
膜 脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A合成酶、脂肪酸激酶等）
特征酶：单胺氧化酶
膜间隙
腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亚硫酸氧化酶
特征酶：腺苷酸激酶
细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、肉碱酰基
内
膜
转移酶、-羟丁酸和 -羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、 ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体
特征酶：细胞色素（c）氧化酶
↓ 装入透析袋中对PBS充分透析（换液3次）
↓萘氏试剂测透析外液无黄色 取少许透析袋液适当倍数稀释后，测蛋白含量。
2、离心（centrifugation)
（1）定义：利用离心机旋转产生的离心力，使不 同大小、不同密度的颗粒分离的技术过程。 *优点：处理量大，可达几升 *离心条件的选择：以靶酶与杂质的颗粒大小、 密度和特性的差异为依据，选择适当的离心机、 离心方法和离心条件
好，操作简单 ❖ 可以进行多种工艺的处理，如：细胞、菌体收集
、破碎后的澄清过滤、分离、浓缩、缓冲液更换 等 ❖ 投资小，通用性强
超滤技术应用：
❖ 浓缩和透析 ❖ 除热源 ❖ 脱盐和缓冲液交换 ❖ 小分子处理 ❖ 细胞收集/澄清 ❖ 病毒收集/澄清
4、色谱法（层析法）
（1） 离子交换色谱（层析）
上清液
10,000g,10min
沉淀：线粒体 溶酶 体 细胞膜碎片
上清液
100,000g,3h
沉淀： 核糖核蛋白体
上清液： 可溶性成分
② 密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形 成连续或不连续的密度梯度，通过重力或离心力 场的作用，使样品中的组份依据其沉降速率和密 度的不同而分层、分离
这类分离又分为： 差速-区带（Rate—Zonal，R-Z） 等密度（Isopycnic）/平衡密度梯度离心
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受 到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采 用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂
2-3 细胞膜和细胞壁的破碎
1、主要方法：
1）
2）
超声波破碎法
3）
4）
2、选择原则
如酶法+超声
2-4 酶的提取
1、定义 在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料
透析（dialysis)：利 用小分子物质的扩散作 用，使小分子不断透过 半透膜而扩散到膜外， 而大分子则被截留于膜 内，从而实现分离。
用途：去除酶液中无机盐、有 机溶剂或低分子量的抑制剂
缺点：耗时；透析结束后，样 品体积大，浓度低，难于工 业化生产
（2）超 滤（ultrafiltration)
定义：以膜两边的流体静压差为推动力的膜分离技 术。在静压差作用下，小于孔径的颗粒穿过膜孔， 而大于孔径者被截留。
1、基于分子大小或质量
(1)离心 (2)透析 (3)凝胶过滤 (4)超过滤 2、基于电荷 (1) 离子交换色谱 (2) 电泳 (3) 等电聚焦
3、基于溶解度 改变pH、离子强度、介电常数等实现的
沉淀分离： (1) 盐析法 (2) 复合沉淀法 (3) 有机溶剂沉淀法 (4) 等电点沉淀法 (5) 选择性变性沉淀法
提取液体积 *适当增加其体积，可以提高酶的产率 *过量，则降低[酶]，增加后续分离纯化的难度 一般为原始材料的3-5倍，且分3次使用
加入保护剂，以提高酶的稳定性 如酶的底物、辅酶和某些抗氧化剂
三、酶的分离纯化
（isolation,separation) ( purification) 3-1 分离纯化方法分类
柠檬酸合成酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶
、延胡索酸酶、谷氨酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶复合体、天冬
基