纳豆激酶的提取研究

收稿日期 ： ２００６－ ０３－ ０６ 作者简介 ： 肖美燕 （ １９７８－ ） ， 女 ， 助教 ， 硕士研究生 ， 研究方向 ： 微生 物细胞固定化技术。
１．２．３
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 柱 层Leabharlann Baidu析 法 纯 化 分 离 ［８，９］
称取
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ ５．０ｇ 于 烧 杯 中 ， 加 入 ２００ｍＬ ｐＨ７．４
１．２．２ １．２．２．１
纳豆激酶的提取方法 等电点法分离提取 分 别 将 ２０ｍＬ 发 酵 液
的 ｐＨ 调 至 ７．４ 、 ７．８ 、 ８．２ 、 ８．６ 、 ９．０ 、 ９．４， 使 酶 沉 淀 ， 离 心 分离 （ ３５００ｒ ／ｍｉｎ ， ３０ｍｉｎ ， 以下同 ） ， 用 ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓冲液溶解 ， 测酶活 ， 确定纳豆激酶的等电点。
不同饱和度 的 酶 活 见
图 &。
酶活 （##! = &(!’ ）
&
结论
纳豆激酶的等电点为 ./+19 ， 但采用等电点法对
纳豆激酶进行分离提取， 效果不好； 采用盐析法对纳
$% 2% 2(
饱和度 （< ）
(%
((
9%
9(
0%
豆激酶进行提取时， 先将发酵液调至 2(< 的饱和度， 离心取沉淀，然后再将上清液调至 (%< 饱和度的盐 析效果最好；在采用层析法对纳豆激酶粗酶液 进 行 进一步的纯化实验中发现，当控制洗脱流速在
３５％ 、 ４０％ 、 ４５％ 、 ５０％ 的饱和度 ， 静置过夜 ， 离心分离 ，
收 集 沉 淀 １ ， 用 ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓 冲 液 溶 解 ， 上 清 液 继续加入硫酸铵粉末至 ５０％ 的饱和度 ， 离心分离 ， 得 沉淀 ２ ， 用 ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓冲液溶解。合并 １ 、 ２号 沉淀溶解液得粗酶液 ， 测酶活 ， 酶活高的即为最佳的 盐析法。
./
上清酶活 （##! = &(!’） 沉淀酶活 （##! = &(!’）
012 &&% (%
01+ &%0 2+
+1! +( (&
+19 (9 (0
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,- 值
从表 & 可以看出， 沉淀酶活比上清酶活低， 因此 但是上清酶活呈现一定的变化规 调 ./ 法效果不好， 这说明经 律， 先下降后上升， 在 ./+19 时 达 到 最 低 ， 过调 ./ 后， ./+19 的 沉 淀 效 果 最 好 ， 因 此 等 电 点 为 这与有关报道 :!;相一致。 ./+19 ，
中图分类号 ： ＴＳ２０１．２＋５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： １００２－ ０３０６ （ ２００６ ） ０１－ ０１６７－ ０３
实验室提供。
１．２
１．２．１
实验方法
６］ 酶 活 的 测 定 ［４～
首先制作纤维蛋白平板， 然
后 用 微 量 移 液 器 取 １５μ Ｌ 发酵液或粗酶液点到制好 的 纤 维 平 板 上 ， 置 于 ３７℃下 培 养 数 小 时 ， 取 出 ， 测 溶 圈的垂直直径 ， 计算直径积 ， 单位为 ｍｍ２ ／１５μ Ｌ。
的酶活， 结果如表 & 。 表& 不同 ./ 的酶活
全进入凝胶内后， 加入缓冲液进行洗脱， 流出液用自 动部分收集器收集， 控制流速在 %1!#’ = #)*， $#’ = 管， 待 接 收 完 2% 管 后 ， 用 紫 外 分 光 光 度 计 在 波 长 为 结果见图 $ 。 !+%*# 下测 ,- 值，
图&
不同饱和度的酶活
从图 & 可以看出， 当饱和度在 (%< 以下时， 酶活 随着饱和度的增加而增加； 当饱和度高于 (%< 时， 酶 活又随着饱和度的增加而下降。因此， 饱和度为 (%< 时， 盐析效果最好。
%1!#’ = #)* 时， 纳 豆 激 酶 在 洗 脱 时 间 为 &>(?!((#)*
时达到分离。
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分步法与一步法的选择
确定最佳 饱 和 度 为
参考文献：
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进行分步法或一步法的选择， 测沉淀 & 、 沉淀 (%< 后， 总酶活为酶活 & 、 结果如图 ! 。 ! 的酶活， ! 之和， 从图 ! 可以看出，沉淀 & 的酶活随着 饱 和 度 的 增加而增加； 而沉淀 ! 的活性在 !(< 时达到最高， 而 后随着饱和度的增加而降低；酶活的总和在 2(< 时 达到最高。因此， 将发酵液的饱和度先调至 2(< ， 离 心取沉淀，然后再将上清液调至 (%< 饱和度的盐析
& %1> %1+ %10 %19 %1( %12 %1$ %1! %1& % &(
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洗脱时间 （#)* ）
图$
不同管数的 ,- 值
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盐析法
硫酸铵饱和度的确定
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从图 $ 可以看出， 经层析后， 粗酶液已 经 分 开 成 将 $ 个峰进行点样观察， 发现只有第二个峰 $ 个峰， 具有活性， 因此， 可以鉴定， 第二组分就是纳豆激酶， 也 就 是 纳 豆 激 酶 在 洗 脱 时 间 为 &>(?!((#)* 时 被 分 离出。从图谱也可以看出， 这三种组分基本分开， 因 此， 经过层析， 纳豆激酶也基本得到纯化。
层析法对发酵液中的纳豆激酶的提取进行了初 步 研 究 ， 为将纳豆菌的固定化技术应用于工业化生 产 提 供依据。
１
１．１
材料与方法
实验材料
纳 豆 菌 ＣＤＭ－ ２ （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ ＣＤＭ－ ２ ） 由本
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐ ａ ｐ ｅ ｒ， ｔｈｅ ｓ ｅ ｐ ａ ｒａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｎａ ｔｔｏｋｉｎａ ｓ ｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅ ｒｍｅ ｎｔａ ｔｉｏｎ ｌｉｑ ｕｉｄ ｉｓ ｓ ｔｕｄ ｉｅ ｄ ｂ ｙ ｓ ａ ｌｔｉｎｇ ｏｕｔ， ｉｓ ｏｅ ｌｅ ｃ ｔｒｉｃ ｐ ｒｅ ｃ ｉｐ ｉｔａ ｔｉｏｎ ａ ｎｄ ｃ ｈｒｏｍａ ｔｏｇ ｒａ ｐ ｈｙ． Ｉｔ ｉｓ ｄ ｉｓ ｃ ｏｖｅ ｒｅ ｄ ｔｈａ ｔ ｔｈｅ ＰＩ ｏｆ ＮＫ ｉｓ ８．６． Ｗｈｅ ｎ ｆｅ ｒｍｅ ｎｔａ ｔｉｏｎ ｌｉｑ ｕｉｄ ｉｓ ｆｉｒｓ ｔ ｓ ａ ｔｕｒａ ｔｅ ｄ ｗｉｔｈ ４５％ ｓ ａ ｌｔ ｔｈｅ ｎ ｗｉｔｈ ５０％， ｔｈｅ ｓ ａ ｌｔｉｎｇ ｏｕｔ ｒｅ ｓ ｕｌｔ ｉｓ ｔｈｅ ｂ ｅ ｓ ｔ． ２５５ｍｉｎ ｂ ｙ Ｔｈｅ ｎａ ｔｔｏｋｉｎａ ｓ ｅ ｉｓ ｐ ｕｒｉｆｉｅ ｄ ａ ｔ １９５ ～ ｃ ｈｒｏｍａ ｔｏｇ ｒａ ｐ ｈｙ ｗｈｅ ｎ ｔｈｅ ｗａ ｓ ｈｉｎｇ ｖｅ ｌｏｃ ｉｔｙ ｉｓ ０．２ ｍｉｌｌｉｌｉｔｅ ｒ ｐ ｅ ｒ ｍｉｎｕｔｅ ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ ： ｎａ ｔｔｏ ｋｉｎａ ｓ ｅ Q ｓ ａ ｌｔ ｏｕｔQ ｃ ｈｒｏｍａ ｔｏｇ ｒａ ｐ ｈｙQ ｓ ａ ｔｕｒａ ｔｉｏｎ
饱和度 （< ）
图! 效果最好。
不同饱和度的酶活
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结果与分析
等电点法
将 调 好 不 同 ./ 的 发 酵 液 离 心 ， 收 集 沉 淀 ， 用
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层析法
向装好的凝胶柱中加入 &#’ 的粗酶液， 待酶液完
./012 的 34)56/78 缓 冲 液 溶 解 ， 分 别 测 上 清 和 沉 淀
工艺技术
食品工业科技
Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０１，２００７
纳豆激酶的提取研究
肖美燕 １， ２， 徐尔尼 ２ （ １． 遵义医学院珠海校区免疫学与病原生物学教研室 ， 广东珠海 ５１９０４１； ２． 南昌大学食品 科学教育部重点实验室 ， 江西南昌 ３３００４７）
摘
要 ： 采用等电点法、 盐析法、 层析法对利用固定化技术生产纳 豆激酶的发酵液中酶的提取进行了研究。研究发现 ， 纳豆 激 酶 的 等 电 点 为 ８．６， 但 是 等 电 点 法 效 果 不 好 ； 在 盐 析 法 中 发 现 ， 当 先 将 发 酵 液 调 至 ４５％的 饱 和 度 ， 离 心 取 沉 淀 ， 然后再将上清液调至 ５０％饱和度时 ， 盐析效果 最 好 ； 当 控 制洗脱流速在 ０．２ｍＬ ／ｍｉｎ 进行层析时 ， 纳豆激酶在洗脱 时间为 １９５～ ２５５ｍｉｎ 时达到分离。 关键词 ： 纳豆激酶 ， 盐析 ， 层析 ， 饱和度
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郭 勇 S 林 剑 1 一 种 潜 在 的 溶 血 栓 药 物—纳 豆 激 酶 :P;1 :!; 谢 秋 玲 ， 药物生物技术， （& ） ： !%%& ， + (&?($1
３０％ 、 ４０％ 、 ５０％ 、 ５５％ 、 ６０％ 、 ６５％ 、 ７０％ 的饱和度 ， 静置
过夜 ， 离心收集沉淀 ， 用 ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓冲液溶 解 ， 得粗酶液 ， 测酶活。酶活高则为最佳饱和度。 一级或多级盐析的选择 将发酵液分装 ２０ｍＬ／ 瓶， 缓 慢 加 入 硫 酸 铵 粉 末 分 别 至 １０％ 、 ２０％ 、 ２５％ 、 ３０％ 、
/ ’ ( * ’ ( * ’ ( * ’"*!# ’"((% ’"*’# /’ %"’)# 0d/d. ’"!)# ’"!)* ’"+,* /’ %"%+) 0d/d.
工艺技术
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沉淀 & 沉淀 ! 总和
析柱中， 待凝胶沉至离柱口约 !"# 的时候， 停止加凝 胶。用缓冲液平衡数小时， 再在胶柱上加入一张与内 径相近的滤膜片， 加入缓冲液平衡。吸干柱中多余的 缓冲液，用移液管加入 &#’ 用饱和硫酸铵提取的粗 酶液，待酶液完全渗入凝胶中时加入缓冲液进行洗 每管 $#’。收完 脱， 用自动收集器收集， &(#)* 一管， 后， 用紫外分光光度计测波长为 !+%*# 下的 ,- 值。 将各峰用纤维平板进行检测， 确定活性部分。
ｎａｔｔｏ） 发 酵 大 豆 后 所 产 的 酶 。 由 于 ＮＫ 具 有 作 用 迅
速， 维持时间长； 来源于食品， 安全性能好； 分子量 小， 是一个单链蛋白质， 更易被人体消化吸收； 可由 消化道吸收 ； 对纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶 等现用于临床的药物 ， 它同纤溶酶一样直接作用于 纤维蛋白 ， 同时可以激活体内的组织血纤溶酶原激 活 剂 （ ｔＰＡ） ； 可 以 用 细 菌 进 行 液 体 发 酵 生 产 ， 造 价 低 廉等特点 ［２］， 因此可以预见 ， ＮＫ 作为治疗血栓的药品 的前景是十分广阔的。本实验采用固定化技术将纳 豆 菌 进 行 固 定 ［３］， 发 酵 ， 然 后 采 用 等 电 点 法 、 盐析法、
!下转第 "## 页 $
!"# !""# 年第 "$ 期
食品添加剂
表! 实验号 因素
食品工业科技
!"#$%&’("$)*’%))+
!%& 后实验结果
评价
. ’ ( * ) + ! # @ ,
（碘值） c ’ （碘值） c ( （碘值） c * 优水平 （碘值） （碘值） 主次顺序 （碘值） ： c（游离酸） ’ （游离酸） c ( （游离酸） c * 优水平 （游离酸） （游离酸） 主次顺序 （游离酸） ：
的 Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 缓 冲 液 ， 于 水 浴 锅 中 煮 沸 ２ｈ ， 倾 去 细 颗
２００７ 年第 ０１ 期
１６７
食品工业科技
!"#$%"$ &%’ ($")%*+*,- *. /**’ 0 %’1234长 为 $%"# 的 层 粒， 装 入 预 先 固 定 好 的 内 径 为 !"#、
酶活 （##! = &(!’ ）
纳豆激酶 （ ＮＫ） 是日本学者须见洋行从日本食品 纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓功能的丝氨酸 蛋白酶， 它 是 由 一 种 枯 草 杆 菌—— —纳 豆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
［１］
１．２．２．２
饱和硫酸铵分离提取［６， ７］ 将固定化细 胞 发 酵 液 用 小 缓慢加入硫酸铵粉末分别至
最佳饱和度的确定 烧 杯 分 装 ２０ｍＬ ／ 瓶 ，