琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤
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100μ l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）
⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的 琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中， 加1×TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1-2mm，小心垂 直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μ l于封口膜上，再加 入 2μ l 的 6X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
2.0
3.0 4.0 6.0
0.1~3
0.1~3
0.05~1 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7、电泳缓冲液
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用.
TAE和TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液，二者相比：
1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的 阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%；
6×凝胶载样缓冲液
类型 I 6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 4℃ 贮存温度
40% (m/V)蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝 II 0.25%二甲苯氰 15% 聚蔗糖(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 III 0.25%二甲苯氰 30%甘油水溶液 IV 4℃ 室温
0.25%溴酚蓝
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分 子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率 要好于TBE。
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样 品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。
⑸ 打开电源开关，调节电压至 3-5V/cm ，可见到溴酚蓝 条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
⑹ 将凝胶放入 EB 染液中染色 5-10min, 用清水稍微 漂洗。
⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
1
定和纯化DNA或RNA片段
琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒 等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。
刚性和长度增加。 5、所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6、琼脂糖种类
常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
标准琼脂糖 高强度琼脂糖 修饰的低熔点/ 凝 点琼脂糖 超低熔点 低黏性低熔点琼脂 糖
凝结温度/℃
35~38 40~42 34~43 25~35 35 8~15 25~30 38 30
三、实验材料、器具及药品 质粒DNA样品。
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫 外透射检测仪等。
琼脂糖， 1XTBE 电泳缓冲液，溴化乙锭（ EB ）， 6X 载样缓 冲液 四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入 100ml 1×TAE 电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入
熔化温度/ ℃
90~95 85~90 85~95 63~65 65 40~45 70 85 75 不同厂家生 产的不同商 品其凝结温 度和熔化温 度有一定差 异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%） 0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 标 准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶 点(kb)
5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，
但 EB 会导致线形 DNA 迁移率下降，这在酶切质粒与空白 对照质粒一起电泳时应值得注意。 6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与 DNA 泳动的方向 相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙 锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处 理方法是：将凝胶在 0.5ug/ml 的 EB 溶液中染色 30 － 45 分
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子 筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把分子量标准参照物和样品 一起进行电泳而得到检测。
溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）为扁平状 分子，在紫外光照射下发射荧光。 EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其荧光强度与 DNA 的 含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电 泳，电泳结束后再用EB染色。
凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像， 图像可以直接输出到计算机观察。
关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法\几点注意事项 1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整 齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空 中的气泡。 2）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目 及样品孔形状与容量。 3）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品 流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极 槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转 移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个 枪头加样，避免样品交叉污染。）
2
3
M
DNA的迁移速率决定因素
1、DNA分子的大小
双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对 数近似成反比； 2、琼脂糖浓度
浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3、DNA的构象
同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状
4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
溴化乙锭（ EB ）插入双链 DNA 造成其负电荷减少、
琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
• 天 然 琼 脂 （ agar ） : 又 名 琼 胶 、 菜 燕 、 冻 粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线 状高聚物。 琼脂糖（agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷
D-半乳糖
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴
缺点
1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须 立即固定染色。 4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
来自百度文库
二、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
钟。
7 ）判断正负极的另一方法是负极气泡（ H2 ）比正极气泡 （O2）多一倍。
40% (m/V)蔗糖水溶液
4℃
琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, 染色法。
EB）
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质
（2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶 或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。
⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的 琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中， 加1×TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1-2mm，小心垂 直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μ l于封口膜上，再加 入 2μ l 的 6X 载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
2.0
3.0 4.0 6.0
0.1~3
0.1~3
0.05~1 0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7、电泳缓冲液
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用.
TAE和TBE电泳缓冲液比较
都是常用电泳缓冲液，二者相比：
1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的 阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%；
6×凝胶载样缓冲液
类型 I 6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 4℃ 贮存温度
40% (m/V)蔗糖水溶液
0.25%溴酚蓝 II 0.25%二甲苯氰 15% 聚蔗糖(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 III 0.25%二甲苯氰 30%甘油水溶液 IV 4℃ 室温
0.25%溴酚蓝
4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分 子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率 要好于TBE。
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样 品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳 极迁移。
⑸ 打开电源开关，调节电压至 3-5V/cm ，可见到溴酚蓝 条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
⑹ 将凝胶放入 EB 染液中染色 5-10min, 用清水稍微 漂洗。
⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
1
定和纯化DNA或RNA片段
琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。
3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒 等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。
刚性和长度增加。 5、所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6、琼脂糖种类
常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
标准琼脂糖 高强度琼脂糖 修饰的低熔点/ 凝 点琼脂糖 超低熔点 低黏性低熔点琼脂 糖
凝结温度/℃
35~38 40~42 34~43 25~35 35 8~15 25~30 38 30
三、实验材料、器具及药品 质粒DNA样品。
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫 外透射检测仪等。
琼脂糖， 1XTBE 电泳缓冲液，溴化乙锭（ EB ）， 6X 载样缓 冲液 四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入 100ml 1×TAE 电泳缓冲液中，摇匀。 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入
熔化温度/ ℃
90~95 85~90 85~95 63~65 65 40~45 70 85 75 不同厂家生 产的不同商 品其凝结温 度和熔化温 度有一定差 异
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%） 0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 标 准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶 点(kb)
5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，
但 EB 会导致线形 DNA 迁移率下降，这在酶切质粒与空白 对照质粒一起电泳时应值得注意。 6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与 DNA 泳动的方向 相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙 锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处 理方法是：将凝胶在 0.5ug/ml 的 EB 溶液中染色 30 － 45 分
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子 筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把分子量标准参照物和样品 一起进行电泳而得到检测。
溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）为扁平状 分子，在紫外光照射下发射荧光。 EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其荧光强度与 DNA 的 含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电 泳，电泳结束后再用EB染色。
凝胶中DNA的成像
可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像， 图像可以直接输出到计算机观察。
关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法\几点注意事项 1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整 齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空 中的气泡。 2）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目 及样品孔形状与容量。 3）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品 流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极 槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转 移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个 枪头加样，避免样品交叉污染。）
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M
DNA的迁移速率决定因素
1、DNA分子的大小
双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对 数近似成反比； 2、琼脂糖浓度
浓度越低，相同核酸分子迁移越快；
3、DNA的构象
同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状
4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭
溴化乙锭（ EB ）插入双链 DNA 造成其负电荷减少、
琼脂糖凝胶电泳
Agarose gel electrophoresis
• 天 然 琼 脂 （ agar ） : 又 名 琼 胶 、 菜 燕 、 冻 粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线 状高聚物。 琼脂糖（agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷
D-半乳糖
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴
缺点
1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。
2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须 立即固定染色。 4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
来自百度文库
二、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
钟。
7 ）判断正负极的另一方法是负极气泡（ H2 ）比正极气泡 （O2）多一倍。
40% (m/V)蔗糖水溶液
4℃
琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, 染色法。
EB）
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质
（2）EB可用来检测单链或双链核酸
（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶 或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。