鬼臼毒素生物合成研究进展_陆炜强

实现药用植物规范化栽培和植物细胞或器官培养生产 鬼臼毒素的前提之一是必须充分阐明鬼臼毒素的生物合成 途径及其调控机制。因此，自 20 世纪 80 年代末以来，学者 们以足叶草 Podophyllum spp. 、亚麻 Linum spp. 等植物的组 织或细胞培养体系为研究系统，探讨了鬼臼毒素的生物合成 途径，取得了长足进展。前人综述了不同时期鬼臼毒素生物 合成不同方面的研究进展 ，揭 ［6，12，15-19］ 示了合成途径的大体 框架，为后续的研究提供了良好的基础和背景。但是前人的 综述大多是对鬼臼毒素的资源、化学、药理、生物合成、细胞 或器官培养等内容的全面评述，或者是对整个木脂素类生物 合成的综述，对于鬼臼毒素生物合成的论述不够全面、详细， 比如对鬼臼毒素下游的代谢往往没有讨论，而且对近几年已 有新进展的相关酶编码基因的分离、扩增、表达也较少涉及。 因此，本文专门针对鬼臼毒素的生物合成，对相关文献尤其 是近 10 年的文献进行综述，重点介绍其合成途径关键环节 的过程、主要产物、酶的特点与功能、鬼臼毒素下游代谢、已 报道的酶编码基因等内容，以期继续推动该领域的研究，实 现优质种源筛选、株系改良、栽培和培养条件优化、生产体系 调控，为鬼臼 类 植 物 规 范 化 栽 培 和 代 谢 工 程 的 产 业 化 奠 定 基础。
Anterola 等［21］从转录水平对火炬松 P. taeda 中苯丙氨 酸氨基裂合酶（ PAL） 、香豆酯-4-CoA 连接酶（ 4CL） 、咖啡酰 辅酶 A 甲基转移酶（ CCOM） 、肉桂醇脱氢酶（ CAD） 等关键酶 的表达进行检测。但是，目前关于苯丙素合成途径中相关酶 的构 效 关 系 （ structure-function） 的 研 究 还 鲜 有 报 道。Ferre 等［23］对近 10 年来涉及此过程的酶的结构、功能的相关研究 进行了专题综述，并指出苯丙氨酸氨基裂合酶（ PAL） 是目前 此过程中唯一构效关系研究较为透彻的酶。此外，最新关于 鬼臼毒素 调 控 的 研 究 表 明，水 杨 酸 可 以 显 著 提 高 白 亚 麻 L. album悬浮细胞中苯丙氨酸氨基裂合酶、肉桂酰辅酶 A 还 原酶、肉桂醇脱氢酶 3 种酶编码基因的表达量，进而提高鬼 臼毒素的产率，但 是 对 松 脂 酚-落 叶 松 脂 醇 还 原 酶 编 码 基 因 的表达量无显著影响［24］。 1. 2 从松柏醇到松脂酚 松脂酚是鬼臼毒素生物合成的重 要上游木脂素之一，在植物体内，从松柏醇到松脂酚的转化 涉及到一个特殊的立体选择结合过程，dirigent 蛋白（ dirigent protein，DIR） 在此过程中起着重要的作用。Davin 等［25］以连 翘 F. suspense 为材料，在细胞内通过特殊分子标记的方法， 最早揭示了木质素和木脂素生物合成过程中的这一重要反 应。催化该转化过程的是松脂酚合酶 （ pinoresinol synthase， PS） ，该酶具有 2 种蛋白，一种蛋白催化松柏醇产生松柏醇自 由基（ coniferyl alcohol radical） ，另一种蛋白（ DIR） 自身没有 催化活性 中 心，但 能 立 体 选 择 2 分 子 的 松 柏 醇 带 电 基 团 （ E-coniferyl alcohol） 特 异 性 结 合 生 成 （ + ） -松 脂 酚［25-26］ （ 图 2） 。
［稿件编号］ 20101116002 ［基金项目］ 国家科技支撑计划项目（ 2006BAI21B07） ； 浙江省科技 厅中药现代化专项（ 2006C13077） ［通 信 作 者］ * 赵 云 鹏，Tel： （ 0571 ） 88206463，E-mail： ypzhao @ zju. edu. cn ［作 者 简 介］ 陆 炜 强，Tel： （ 0571 ） 88206463，E-mail： lwq-711 @ 163. com
复杂的合成过程、极低 的 合 成 效 率 （ 约 为 5 % ） ，使 人 工 全 合成鬼臼毒素目前 仍 难 以 实 现 商 业 化［3，11］。近 年 来 基 于 生物技术的植 物 代 谢 工 程 快 速 发 展，为 鬼 臼 毒 素 替 代 资 源的开发提供了更多途径，如 植 物 细 胞 或 器 官 培 养、生 物 转化等，但仍存 在 效 率 低、成 本 高 的 共 性 问 题，目 前 尚 未 产业化［5，12-14］。因此，要 彻 底 解 决 鬼 臼 毒 素 的 来 源 问 题 ， 仍需要 对 上 述 3 种 途 径 的 关 键 科 学 和 技 术 问 题 深 入 研究。
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第 36 卷第 9 期 2011 年 5 月
Vol. 36，Issue 9 May，2011
1 鬼臼毒素生物合成 鬼臼毒素属于芳基四氢萘木脂素，其基本构成单元为苯
丙素基团。松脂酚（ pinoresinol，PINO） 、落叶松脂醇（ lariciresinol，LARI） 、开环异落叶松脂醇（ secoisolariciresinol，SECO） 、 罗汉松脂酚 （ matairesinol，MATAI） 、去氧鬼臼毒素 （ deoxypodophyllotoxin，DOP） 等木脂素（ 特别是前 4 种） 是包括鬼臼毒 素在内众多木脂素的共同合成前体［20］。在这些物质的生物 转化过程中，肉桂醇脱氢酶（ cinnamyl alcohol dehydrogenase， CAD） 、松脂酚-落叶松脂醇还原酶（ pinoresinol-lariciresinol reductase，PLR） 、开环异落叶松脂醇脱羟酶（ secoisolariciresinol dehydroxgenase，SIRD） 、去 氧 鬼 臼 毒 素-6-羟 化 酶 （ deoxypodophyllotoxin 6-hydroxylase，DOP6H） 、去 氧 鬼 臼 毒 素-7-羟 化 酶 （ deoxypodophyllotoxin 7-hydroxylase，DOP7H） 等相关酶对于控 制鬼臼毒素生物合 成 具 有 重 要 的 作 用［21-22］ 。 作 者 以 控 制 这 些物质生物合成的相关酶为线索，在探讨鬼臼毒素生物合成 关键环节的基础上，最后综合提出目前较完整的鬼臼毒素可 能的生物合成途径。 1. 1 从苯丙氨酸（ phenylalanine） 到松柏醇（ coniferyl alcohol， CA） 苯丙素合成途径是植物体内木脂素类化合物、木质素 类化合物、黄酮 类 化 合 物 等 上 游 的 共 同 起 始 通 路［20］。 鬼 臼 毒素生物合成 的 基 本 物 质———松 柏 醇 就 是 通 过 苯 丙 素 合 成 途径实现的。苯丙氨酸在苯丙氨酸氨基裂合酶 （ phenylalanine ammonialyase，PAL） 作用下脱氨基转化为肉桂酸 （ cinnamic acid） ，肉桂酸则依次在肉桂酸-4-羟化酶（ cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H） 、香豆酯-4-CoA 连接酶（ 4-coumarate CoA ligase，4CL ） 、咖 啡 酰 辅 酶 A 甲 基 转 移 酶 （ caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCOM ） 、肉 桂 酰 辅 酶 A 还 原 酶 （ cinnamoyl- CoA reductase，CCR） 等 酶 的 作 用 下 转 化 为 松 柏 醛 （ coniferaldehyde） ，最后经肉桂醇脱氢酶（ cinnamyl alcohol-dehydrogenase，CAD） 催化，产生松柏醇。这一过程已经在松属 Pinus、连翘属 Forsythia 多种植物中得到了证实（ 图 1） 。 ［12，21］
［关键词］ 鬼臼毒素； 生物合成； 规范化栽培； 代谢工程
鬼臼毒素（ podophyllotoxin，PTOX） 是植物来源天然产物 成功商品化的经典案例。从其发现至今已有近 1 个世纪的 历史，其具 有 良 好 的 抗 肿 瘤、抗 尖 锐 湿 疣、抗 艾 滋 病 毒 活 性［1-3］，虽然自身毒副作用较大，但其半合成衍生物在保证治 疗效果的同时，大大降低了毒性，在临床治疗淋巴癌、肺癌等 多种癌症中得到广泛应用，如依托泊苷（ etoposide，VP-16） ， 替尼泊苷（ teniposide，VM-26） ，依托泊苷磷酸酯（ etopophos） ， azatoxin，tafluposide 等［4］。鬼臼毒素的传统和主要来源是植 物提取，来源植物主要分布于小檗科足叶草属 Podophyllum、 桃儿 七 属 Sinopodophyllum、八 角 莲 属 Dysosma、山 荷 叶 属 Diphylleia、Jeffersonia 属，其他还有亚麻科亚麻属 Linum，柏科 刺柏属 Juniperus、崖 柏 属 Thuja、Callitris 属，唇 形 科 山 香 属 Hyptis、百里香属 Thymus、香科科属 Teucrium、荆芥属 Nepeta、 Eriope 属等［5-7］。由于过度采挖、生境 破 坏 和 植 物 自 身 生 长 缓慢等原因，鬼 臼 类 野 生 植 物 资 源 逐 渐 枯 竭、物 种 濒 危， 已难以满足鬼 臼 毒 素 生 产 的 需 求，人 工 规 范 化 栽 培 势 在 必行，但目前桃儿七 S. hexandrum（ 异名： Podophyllum hexandrum，P. emodi） 、八 角 莲 D. versipellis 的 栽 培 刚 刚 起 步，其他 来 源 植 物 的 新 资 源 开 发 程 度 也 有 待 进 一 步 深 入［8-10］。此外，虽然化学 全 合 成 技 术 已 经 有 所 突 破，但 是
图 1 火炬松细胞内的苯丙素合成途径［21］
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图 2 松脂酚合酶（ PS） 催化的反应［25-26］
相关研究表明，DIR 蛋白在不同的植物材料 中 各 不 相 同，其编码 基 因 也 有 所 区 别，但 催 化 的 反 应 却 十 分 相 似。 Gang 等［25］首次从金钟连翘 F. intermedia 中分离得到了编码 dirigent 蛋白的 CDNA 片段之后，人们又从连翘属、松属、崖 柏属、足叶草属等不同种属植物中分离得到了同源 dirigent