对绿色荧光蛋白(GFP)的了解及应用

对绿色荧光蛋白的了解及应用

学院：生命科学学院

姓名：马宗英

年级：2011

学号：2011012923

前言

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是一种具有奇妙特性的“光学蛋白质”。这种蛋白质从成分和结构上来说，没有丝毫的特殊性，它的组成单元是20种常见的氨基酸，二级结构也是普通的α螺旋和β片层。但是，这种蛋白质却具有一个非常特别的性质——发出绿色荧光。

【关键词】绿色荧光蛋白生命科学应用

一、绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现的。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。

野生型水母GFP的一级序列已由其cDNA序列推导出来[1]，它至少存在4种同源GFP，但这些突变并不影响GFP的基本功能，只是使突变的GFP具有了新的性质。

生色团是GFP发出荧光的物质基础，也是GFP结构中的一个重要组成部分。GFP的生色团位于氨基酸序列64~69位的六肽内,65~67位的丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸通过共价键形成的对羟基苯甲基咪唑环酮是一个独特的、相当稳定的环状三肽结构,构成了GFP生色团的核心[2],见图1。图2为生色团的形成机制。

图1 多管水母中GFP生色团的化学结构和附近序列

图2生色团的形成机制

目前人们对GFP的荧光发光机制并不十分清楚，大家只是认为，GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机

制也有很大差异。

二、GFP在生命科学中的应用

1、作为蛋白质标签（protein tagging）

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染到合适的细胞中进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内的活体观察。由于GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其它蛋白质融合后并不影响自身的发光功能。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更为详尽的观察的新方法。如细胞分裂、染色体复制和分裂、发育和信号转导等过程的研究均是借助绿色荧光蛋白进行标记。

GFP作为蛋白质标签除用于特定蛋白质的标记定位外，还大量用于各种细胞成分的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。曾经有人将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境监测以及探测信号转导过程等等，以上都可以为传统生物学研究提供新思路和新方法。

2、药物筛选

利用细胞表面标记,通过流体细胞分光光度计或荧光活化细胞筛选仪,可以分离与纯化特殊类型的细胞;同时还可利用不同颜色GFP衍生物标记相关蛋白质,来观察在单细胞内相互作用的靶细胞,再借助于荧光激活细胞分离器、等聚焦显微镜分离出目的细胞,从而可方便地用于大规模筛选新的药物。

另一方面，利用GFP来进行药物筛选由于必须与迁移的信号分子相偶联的限制，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。

3、用于免疫学

可采用基因工程的方法生产GFP标记抗体，以取代传统的免疫学标记方法，建立一种简便、快速的免疫诊断新技术。相比于一般的标记物，GFP对光稳定、对抗体的标记率可达100%，而且因为GFP是直接与抗体结合，所以无需添加任何底物，可以避免非抗原抗体结合的背景干扰等。

线粒体中表达的GFP是研究比较成功的一种小分子抗体，因为它可以在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构架抗体融合蛋白。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

在制备抗体时，为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His 序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题，由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体，若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

除了以上应用之外，绿色荧光蛋白还普遍应用于跟踪观察微生物、发育机理研究、细胞筛选以及生物传感器等许多生命科学研究中。

三、GFP的突变及其应用

GFP作为一种新型标记物，正受到科学界的广泛关注，而且野生型的GFP也不断地在被改造，著名的生物学家钱永健所完成的单点突变(S65T) 显著提高了GFP的光谱性质,其荧

光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm,而发射峰仍保持在509 nm,这和常用的FITC滤光片匹配,提高了GFP的应用潜力[3]。

此外，GFP还存在其他的突变,如颜色突变。目前已经发现了蓝色荧光蛋白质(EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama1)、青色荧光蛋白质(ECFP, Cerulean,CyPet)和黄色荧光蛋白质(YFP,Citrine,Venus,Ypet)等,它们可以使我们跟踪不同蛋白质的反应[4]。

【结语】

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作为一个具有独特光学性质的可编码基因的生物分子，成为了寻找药物作用靶标和筛选新药的重要工具，被广泛运用于生物学和医学研究等领域，为人类探究生命过程提供了十分宝贵的信息[5]。

参考文献

[1] Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends Biochem Sci,1995, 20 (11):448 -455

[2]薛启汉.江苏农业科学学报,1999,15 (1):52 -58

[3] Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends BiochemSci,

1995, 20 (11):448 -455

[4] 生物通.绿色荧光蛋白的前世今生.http: //www.ebiotrade.

com/newsf/2008 -10 /2008109172643.htm.2008 -10 -12

[5] 汪恒英,周守标,常志州等.生物技术,2004,14(3):70 -73