基因定位常用的方法

染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等 技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体 的具体区带。
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一、基因定位的方法
1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细 胞。 1）体细胞杂交的概念： 也称细胞融合（cell infusion），是 将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。 新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell）， 含双亲不同的染色体。
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将筛选出来的杂种细胞转移到正常培 养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同 的生化和免疫学特性，Miller等运用体细 胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种 细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含 有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性 而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定 位于17号染色体上，这是首例应用体细胞 杂交法进行的基因定位。
A B C
1 + + +
2 + + -
3 + +
4 + -
5 6 7 8 - - - + + - + - + 12
2.原位杂交和荧光原位杂交
1）原位杂交（in situ hybridization）：是最 直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在 基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于 11p15。
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TKHPRT+
TK+
鼠
X
人
HPRT-
鼠

鼠 人 HAT
人
TK+
鼠人 17 3 TK+
TK+
HPRT+ 17 3 3
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TK11

②克隆嵌板法(clone panel method) 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有 时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因 定位方法。 克隆嵌板
杂种克隆 保留的人染色体
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明确几个基本概念 基 因：DNA的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因 外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。
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遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两 个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离， 它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组 率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。
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单色FISH
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多色FISH
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3.连锁分析（Linkage analysis）
1）概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染 色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。
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2）重组值（recombination fraction） 是基因定位时两个基因间遗传图距的量 度，即基因间的遗传距离。如果两个基因 间有1%的重组值，其遗传图的距离为1厘摩。 （centimorgan，cM） 3）遗传标记（genetic marker） 用连锁分析发法进行基因定位需要已知 的记忆内作为遗传标记，这些标记按孟德 尔方式遗传，标记位点应是多态的。
2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链 或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放 射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互 补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部 分。
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3）原位杂交的特点：
杂交在载玻片上的中期染色体上进行， 而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指 在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放 射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探 针杂交，通过放射自显影来检测染色体上 特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条 染色体的区带出现的最高频率或荧光的强 度来确定探针的位置，从而准确地进行基 因定位。
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4）原位杂交的步骤
制备中期染色体
DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上）
洗膜
检测 放射性标记：放射自显影 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 结合染色体形态进行基因定位
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记录杂交信号
5）荧光原位杂交
（florescence in situ hybridization ，FISH）

用 特 殊 荧 光 素 （ dig 或 Biotin ） 标 记 探 针 DNA（Nick translation 标记法），变性成单 链后与变性后的染色体或细胞核靶 DNA 杂交。 在荧光显微镜下观察并记录结果。
FISH
优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。

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2）对象： 人的细胞
鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠
3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先 丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色 体，而啮齿类的染色体被保留下来。
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4）原理：
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。
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因此在HAT培养基上

人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受 阻 。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄 嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
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鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通 道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成 腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合 成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟 嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌 呤和嘧啶都可以正常合成）
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HAT选择系统：
人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中
HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸，为DNA合成提供原料
第四节

基因定位常用的方法

Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X 染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968 年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因 定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进 行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组 DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因 定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明 显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促 进了基因定位的进程。 基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的 认识有重要意义。