亲和层析
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
亲和层析法
目
录
亲和层析的基本原理
制备方法
操作步骤
亲和层析的应用
亲和层析能有效地保持生物活性物质的高级结构的稳定性，其回收率也非
常高，对含量极少又不稳定的生物活性药物的分离极为有效，它是一种专门 用于分离纯化生物大分子的层析分离技术。 相应的配体 底物、抑制剂、辅酶（辅因 子） 所要分离的目的产物 酶
抗体
凝集素 激素
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大
分子结合的配体，如各种凝集素可以结合各种糖蛋白等。 通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合
适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、
偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得 到了广泛的应用。
抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白 脱氢酶和激酶 蛋白质 蛋白质 脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内 切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等
辅酶和磷酸酰苷
过渡金属离子（Cu2+等） 组氨酸 肝素
抗体 利用抗体为配基的亲和层析又称为免疫亲和层析（Immunoaffinity chromatography）。抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，结 合常数一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和层析法，特别是 以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 凝集素
5、洗脱
当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱目标产物时， 可用尿素或盐酸胍等变性剂溶液使目标产物变性，失 去与配基的结合能力。但应注意目标产物变性后能否 复性。 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗涤，直到无 亲和物存在为止，再用平衡缓冲液充分平衡亲和柱， 以备下次使用。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析是一种蛋白质分离技术，是将亲水性聚合物——聚丙烯酰胺按预先设计的程序加入到样品溶液中，以胶束为架桥剂。
当待测蛋白质在一定浓度梯度的聚合物溶液中通过胶束时，吸附在胶束上并随之进入疏水相中的待测蛋白质就会被高度保留在胶束周围，然后用洗脱缓冲液洗脱，最后将得到的疏水性高聚物的清液在超声波场作用下去除。
由于蛋白质和聚丙烯酰胺之间的特异性吸附，使蛋白质在层析液中移动形成特征的拖尾现象。
亲和层析是利用层析介质表面上所固有的吸附力，将物质分配到具有不同吸附能力的两相之间，形成彼此分离的各个分子层。
亲和层析的种类很多，常见的有：亲和柱层析、疏水膜层析、液膜层析等。
亲和层析技术由英国纽卡斯尔大学与美国加州大学伯克利分校
共同开发的一种新型的蛋白质分离技术，它可以直接分离纯化蛋白质。
亲和层析技术的原理基于吸附与解吸附的机理，当待分离物质从层析柱移动时，由于受到吸附介质的吸附，使得该物质的分子量下降，经分离后达到分子量高的蛋白质的峰展宽，而分子量低的蛋白质的峰缩窄甚至消失。
这样就把峰位展宽或展宽消失的蛋白质区分开来，分别采集收集它们的蛋白质样品。
这种方法对层析介质的选择十分重要。
常用的层析介质有以下几种。
1、固相支持物质； 2、疏水固体颗粒；
3、多孔介质。
亲和层析亲和层析技术是在疏水性载体上，借助于疏水性基团对蛋白质的选择性吸附而进行分离纯化的。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。
简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。
亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。
目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。
在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。
自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了飞速发展。
亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。
不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。
根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高说明与化合物的亲和性越强)：(1)较弱亲和，用氧化物吸附剂；(2)中等亲和，用水合物吸附剂；(3)较强亲和，用亲水性吸附剂；(4)极强亲和，用强水合物吸附剂。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析是研究样品中的各组分与某些对生物大分子有专一性吸附能力的特殊分子或离子相互作用，并利用这种相互作用选择和富集待测组分。
所谓亲和层析是根据生物大分子具有可解离或与配体结合成牢固的结合态，因而它们与蛋白质、核酸、糖类及脂质等生物大分子形成复杂的亲和力。
这些生物大分子不仅能与不同的蛋白质、核酸以及糖类等结合，而且还能与多种其他分子结合。
这种结合的专一性使它在吸附分离生物大分子时比一般选择性薄层色谱更加灵敏、迅速。
所以根据生物大分子的可解离性以及由此产生的不同的亲和力，在某些生物大分子上就能达到高度的分离，获得纯化的生物大分子。
这是亲和层析技术应用的理论基础。
8-nm亲和层析与氨基酸、核酸的亲和层析一样，属于离子交换层析法的一种。
它是用2。
5-5。
0尼龙的电极，以连续可变的电压通过被洗脱组分，从而将它带出来的。
亲和层析也可以用阴离子型缓冲溶液（如Ca(2+)， Mg(2+)等）进行，然后再用等电点沉淀或分子筛效应进行分离。
在亲和层析时，要使用电极活性较低的阴离子，并要用与样品等电点接近的缓冲溶液洗脱，避免电解质引起的组分沉淀。
9。
11。
12。
13。
16。
大多数氨基酸、核酸等生物大分子都有亲和性。
氨基酸中的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等的羧基部分都有强亲和性，例如氨基酸的D-COOH-COO NH2与亲和层析的AgNO3等阴离子或阳离子生成稳定的Ag，而氨基则保持游离状态。
相反，许多游离胺基酸如丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等都具有亲和性。
氨基酸中的尿素、天冬酰胺、谷酰胺等碱性氨基酸都不具有亲和性，它们的亲和性与相应的羧酸有关。
游离的蛋白质多数也具有亲和性。
在亲和层析时，电极活性越低，对生物大分子的亲和性越小，则洗脱时的迁移率越快，即层析的分辨率越高。
蛋白质的氨基虽然能以N-NH2基形式存在，但多数只有N-NH2的形式才具有亲和性，所以通常称为弱亲和蛋白质。
通常用于分离蛋白质的有氨基苯甲酸盐、咪唑啉酮、大豆苷、天冬酰胺等。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
亲和层析的用途与分类
亲和层析的用途与分类亲和层析（Affinity Chromatography）是一种广泛应用于生物分离与纯化的层析技术。
该技术利用生物分子之间的特异结合作用，将目标分子从混合物中高效地提取出来。
亲和层析在生物制药、蛋白质纯化、基因工程等领域发挥着重要作用。
本文将从亲和层析的基本原理、用途和分类三个方面进行介绍。
一、亲和层析的基本原理亲和层析的基本原理是利用配体与目标分子之间的特异性结合作用。
配体是一种具有高亲和力的分子，可以选择性地结合目标分子，而与其他非目标分子无关。
常见的配体包括抗体、金属离子、蛋白质结合域等。
亲和层析通常分为两个步骤：吸附和洗脱。
在吸附步骤中，将含有目标分子的混合物通过与配体固定在固定相上的填料床，目标分子与配体结合，而非目标分子则被洗脱。
在洗脱步骤中，通过改变条件，如pH、温度或离子浓度，使目标分子与配体解离，从而得到纯净的目标分子。
二、亲和层析的用途亲和层析在生物分离与纯化中有广泛的应用。
以下是亲和层析的几个主要用途：1. 蛋白质纯化：亲和层析是蛋白质纯化中最常用的技术之一。
通过针对特定蛋白质设计合适的配体，可以高效地纯化目标蛋白质。
例如，利用亲和层析技术可以从复杂的细胞提取物中纯化出特定的酶、抗体或膜蛋白。
2. 生物制药：在生物制药过程中，亲和层析可用于纯化目标药物。
例如，利用特定的配体可以从发酵液中选择性地富集重组蛋白，如重组人胰岛素、重组人干扰素等。
这对于生物制药产品的高效制备和纯化至关重要。
3. 基因工程：亲和层析在基因工程中也具有重要应用。
通过设计合适的配体，可以选择性地富集携带特定标签（如His标签、GST标签）的重组蛋白。
这为基因工程中的蛋白质表达、酶标记和功能研究提供了有效的手段。
4. 药物筛选：亲和层析可以用于药物筛选和药物分子鉴定。
通过将目标蛋白固定在亲和层析填料上，可以筛选出与目标蛋白结合的化合物，进而进行药物分子的鉴定和优化。
三、亲和层析的分类根据配体与目标分子的结合方式和特性，亲和层析可以分为多种不同的分类。
亲和层析
活化凝胶
以偶联时所用的缓冲液洗涤，立即将凝胶放入含 有偶联化合物(配基)的缓冲液中，在4 ℃慢慢搅拌
12小时
偶联的亲和层析吸附剂
活化过程要注意的问题： (1)溴化氰有毒，操作时应注意通风； (2)活化过程会产生大量的热，除加溴化 氰活化载体的过程需在30 ℃反应外，其 他过程均需在冰浴中进行 ； (3)偶联反应后应尽量除净载体上的活化 基团 。 除去载体上的活化基团可用乙醇胺或1－ 氨基－丙烷－2，3－二醇搅拌10小时左右。 然后用水、2mol/L氯化钾依次洗涤后，用 水将氯化钾洗净。
琼脂糖的酰肼衍生物 溴化氰活化琼脂糖在偶联胺类化合物 时形成N－取代的异脲键，仍保留有 氨基的碱性。当介质的pH低于氨基的 pK时，氨基上带有正电荷，使琼脂糖 凝胶衍生物具有了离子交换层析的性 质，增加了非特异性吸附。这一现象 可用制备成酰肼的衍生物而加以解决。
第二步：
处理后的凝胶
2L水室温洗涤。加入0.1mol/L氢氧化钠24 ℃保温
30～40分钟
凝胶
2L水及1L无水二氧六环洗涤脱水后，悬浮在200ml 二氧六环中，加入0.1mol/L的固体N－羟基琥珀酸亚 胺及0.1mol碳二亚胺，室温振摇90分钟，用二氧六 环洗，
亲和吸附剂
偶氮键的偶联：琼脂糖凝胶或其 他载体的偶氮衍生物可以与含有 酚或咪唑基的配基偶联。
每毫升凝胶加80～100μmol叠氮(对位硝基苯甲酰叠氮溶解在二甲 基甲酰胺中，配成0.1mol/L)， 5℃搅拌1小时，室温继续反应3～4 小时。 50％二甲基甲酰胺洗涤后用水洗。悬于0.2mol/L的连二亚硫酸钠 溶液中(用0.5mol/L碳酸氢钠pH8.5配制),混合物在40℃保持1～2小 时，过滤后水洗
2013年8月4日星期日 11
亲和层析
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
操作流程
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响； 4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。
即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质 ( 如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
亲和层析
亲和层析技术 Affinity Chromatography
什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。
竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。 选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上 固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。
变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性 如： 凝集素 糖蛋白 Protein G IgG 抗体 Dye-stuffs（染料） 酶
低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白 结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl 注意: 为了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
亲和层析
亲和层析亲和层析原理生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。
亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。
将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。
通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
亲和层析的应用点击次数：692 发表于：2008-08-28 21:05转载请注明来自丁香园来源：互联网亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。
下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
1.抗原和抗体利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。
例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。
在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。
将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。
抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 8-10? 12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。
可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。
另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。
2.生物素和亲和素生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。
亲和层析分析
酶的名称
醇脱氢酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶
己糖激酶 甘油激酶
来源
结合强度* 吸附剂1 吸附剂2
酵母
400
0
兔肌肉
0 >1 mol/L#
酵母
0
0
122
0
*以KCl浓度（mol/L）表示。 #需加5×10-3 mol/L还原辅酶I才能洗脱。
一种专一性的亲和吸附剂只能分离一种酶，虽然效 率高，但使用范围窄，如果能以一类酶的通用配基 制成亲和吸附剂，再仔细选择洗脱条件，将其逐个 分别洗脱下来，可以在短时间内分离纯化几个酶。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：0.5-1.0 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-6(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右。
多孔玻璃载体亲和吸附剂的制备
载体先在5％硝酸溶液中煮沸45 min，用水洗涤，在 115℃下烘干，1g干的清洁载体加入75 mL 10%的γ丙氨基三乙氧硅烷，后者溶解在甲苯中，回流12-24 小时，用甲苯、丙酮清洗，空气干燥。
活化载体“接臂”
“接臂”的前提：小分子作为配基，被分离物质是大 分子，空间位阻影响亲和吸附。
具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 酶与它的底物或竞争性抑制剂 激素（或药物）与它们的受体 维生素和它的特异结合蛋白 糖蛋白与它相应的植物凝集素等
亲和层析的优点
♦ 待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，一次操作即可得到较高 纯度的分离物质。
♦ 具有浓缩作用，纯化倍数高达几千倍。 ♦ 分离条件温和，有利于保持物质原有的
例如：SAH（S-腺苷酰-高半胱氨酸）可以作为 RNA、DNA和蛋白质转甲基化酶的通用配基。
转甲基化酶
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理想的基质应满足以下要求： ① 高度的亲水性。 ② 极低的非特异性吸附性（惰性）。 ③ 具有足够的化学基团。 ④ 适当的多孔性。 ⑤ 较好的理化稳定性。
配体的选择
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的 一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶 等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
8.1 生物亲和作用
8.1.2 影响亲和作用的因素 离子强度 pH值 抑制氢键形成的物质 温度 离液离子 螯合剂
8.1 生物亲和作用
8.1.3 亲和作用体系
8.2 亲和色谱原理
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的 专一分子可逆结合的特性，如蛋白酶与辅酶、抗原 和抗体、激素与其受体、核糖核酸与其互补的脱氧 核糖核酸等体系，都具有这种特性，生物分子间的 这种专一结合能力称为亲和力。 依据生物高分子物质能与相应专一配基分子可 逆结合的原理，采用一定技术，把与目的产物具有 特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则含 有目的产物的混合物（流动相）流经此固定相后， 可把目的产物从混合物中分离出来，此中分离技术 称为亲和层析。
亲和色谱（Affinity chromatography）
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基
2）引入连接臂（space arm）
又称手臂（spacer ）
“接臂” 的目的：
克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。
“接臂”的途径：
常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如： AH-Sepharose 4B
生物和酶的侵蚀；⑥最好为粒径均一的球形粒子。常用的载
体有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年来多孔硅胶和合成高分子 化合物载体正在被开发应用于亲和层析。
基质的选择 可被应用的基质（载体）：
（按性能优劣排序） 琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝 胶、纤维素。
最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
图7-14 间隔臂的作用
8.3 亲和色谱介质
8.3.2 亲和吸附剂及其制备方法
偶联（亲和吸附剂的制备）
配体一定，改造载体（基质）
1）基质活化：
不同的载体活化需要不同的活化剂。
常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、 1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。
溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。
亲和配基可选择酶的抑制 剂、抗体、蛋白质A、凝集素、 辅酶和磷酸腺苷、三嗪类色 素、、组氨酸和肝素等。当配 基的分子量较小时，将其直接 固定在载体上，会由于载体的 空间位阻，配基与生物大分子 不能发生有效的亲和吸附作用， 如图7-14a所示。如果在配基与 载体之间连接间隔臂，可以增 大配基与载体之间的距离，使 其与生物大分子发生有效的亲 和结合，如图7-14b所示。
8.1 生物亲和作用
8.1.1 亲和作用的本质 相互作用：
静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键
钥匙和锁孔的关系
8.1 生物亲和作用
8.1 生物亲和作用
生物体内相互作用的分子对： (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 (2) 抗原—抗体。 (3) 激素—受体。 (4) 糖蛋白与凝集素, (5) 生物素—生物素结合蛋白等
Often need spacer armSpace Nhomakorabea arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
图8.2 亲和色谱操作示意图
8.2 亲和色谱原理
图8.2 所示为亲和层析分离示意图。把具有特异亲和力 的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能的 情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入层析柱中 （如图8.2中a），然后把含有目的物质的混合液作为流动 相，在有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条件下 进入层析柱。这时，混合液中只有能与配基发生结合反应 形成络合物的目的物质（图8.2中· 分子）被吸附（如图8.2 中b ），不能发生结合反应的杂质分子（图8.2中△分子） 直接流出。经清洗后，选择适当的洗脱液或改变洗脱条件 进行洗脱（图8.2中c），使被分离物质与固定相配基解离， 即可将目标产物分离纯化。
8.2 亲和色谱原理
8.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适的亲和配基来修饰 固体粒子，以制备所需的亲和吸附介质（固定相）。固体粒 子称为配基的载体。作为载体的物质应具有：①不溶性的多 孔网状结构，渗透性好；②物理和化学稳定性高，有较高的 机械强度，使用寿命长；③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固定化；⑤抗微
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。 配基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为 载体或担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝照、聚丙烯酞胺凝胶和纤维素等。 当用小分子化合为作为配基时，由于空间位 阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常 在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。
要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶 联，必须先使母体活化。即通过某种方法(如溴化 氰法、叠氮法等)，使母体引入某一活泼的基团， 才能以共价键与配基偶联。活化后的不溶性母体已 有商品出售。商品名为偶联凝胶。
手臂
作用 ：减少亲和作用空间位阻 连接：通过化学反应与活化基团连接 手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH 环氧氯丙烷 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
8.3 亲和色谱介质
8.3.1 亲和配基 酶的抑制剂 抗体 A蛋白 凝集素 辅酶和磷酸腺苷
色素配基
过渡金属离子 组氨酸
肝素
8.3 亲和色谱介质