冰冻切片
冰冻切片的要求
冰冻切片的要求
冰冻切片的要求主要包括以下几个方面：
1. 温度控制：冰冻切片的温度控制十分重要，需要将温度设置在适当的范围，一般为-20℃至-30℃。
温度过高或过低都会影响切片的品质。
2. 刀具选择：切片刀需要锋利，以一次性刀片为佳，一般一个刀口切5-6个组织后即应更换，以免影响切片的平整度和光滑度。
3. 切片厚度：冰冻切片的厚度一般需要控制在2-3mm，过厚或过薄都会影响病理医生的诊断结果。
4. 切片技巧：切片时用力要均匀，避免转速不稳，防止组织产生卷曲或皱褶。
切片后应及时观察切片的质量，如有问题应及时调整。
5. 组织处理：进行冰冻切片前，需要对组织进行处理，如清洗、固定等。
处理后的组织应平整、无气泡、无杂质，以保证切片的准确性和可靠性。
6. 注意事项：在进行冰冻切片时，需要注意防止组织过硬或过软，避免损坏刀刃或影响切片质量。
如发现组织变脆，可将冷冻的组织取出，于室温中停留片刻，再行切片。
此外，切片时还需注意防卷板的位置和角度，以保证切片的平整度。
总之，冰冻切片是一项技术性较强的工作，需要严格控制温度、选择适当的刀具、掌握正确的切片技巧和注意事项，才能获得高质量的切片，为病理诊断提供可靠的依据。
冰冻切片步骤很全面
冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。
以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。
注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。
1.準备1.1获取你所需的样本。
这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。
1.2准备冷冻介质。
通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。
液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。
干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。
冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。
1.3准备工具和设备。
这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。
1.4调整工作环境。
确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。
2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。
例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。
2.2切下样本。
使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。
2.3快速固定样本。
使用适当的固定液将样本固定。
常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。
将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。
3.冷冻3.1冷冻样本。
将固定的样本迅速置于冷冻介质中。
如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。
如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。
3.2冷冻条件。
根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。
通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。
3.3冷冻时间。
样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。
通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。
一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。
4.切片4.1为切片做准备。
在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。
同时，将刀片插入切片机。
4.2取出样本。
第三节冰冻切片介绍
第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。
它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。
本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。
一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。
冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。
在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。
而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。
二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。
固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。
2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。
冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。
3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。
使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。
切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。
4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。
然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。
5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。
染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。
最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。
三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。
1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。
通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。
2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。
通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
冰冻切片的操作方法有哪些
冰冻切片的操作方法有哪些冰冻切片是一种常见的食物处理技术，它可以确保食材在冷冻过程中保持原始的形状和质地。
下面是关于冰冻切片的操作方法的详细说明。
1. 准备工作在进行冰冻切片之前，首先需要准备好一些必要的工具和材料。
这些包括切菜刀、切菜板、塑料袋或保鲜膜、冷冻盒或密封袋以及适量的冰块。
2. 选择适合冰冻切片的食材不是所有的食材都适合冰冻切片。
最适合冰冻切片的食材通常是那些有较高水分含量和较低油脂含量的食材，例如水果、蔬菜和肉类。
这些食材冰冻后容易切片且切片后质地会更加口感丰富。
3. 清洗和准备食材在切片前，需要彻底清洗食材以确保其卫生。
如果有必要，去掉果皮或蔬菜的外皮。
此外，根据需要将食材切成适当大小的块状，以方便在冷冻过程中进行切片。
4. 将食材放入塑料袋或密封袋中把要切片的食材放入塑料袋或密封袋中，然后将袋子密封。
确保将食材放在一层，并尽量避免重叠。
这有助于确保冷冻后食材可以更容易地进行切片。
5. 冷冻食材将装有食材的塑料袋或密封袋放入冷冻盒或冷冻室中。
在冷冻过程中，密封袋中的食材将逐渐凝固，并且保持原始的形状和质地。
通常情况下，将食材冷冻4-6小时即可。
6. 取出食材并切片冷冻时间到达后，从冰箱中取出袋子。
使用切菜刀和切菜板，将食材迅速切成薄片。
由于食材已经冷冻，这将更容易进行。
7. 存储和使用切片食材将切片食材放回密封袋中，并将其重新放入冷冻器中。
这样可以确保食材保持新鲜和安全。
在需要使用切片食材时，只需取出所需数量即可，而无需解冻整个食材。
冰冻切片是一种方便快捷的食材处理方法，可以让食材保持原始的形状和质地。
通过以上的操作方法，您可以轻松地进行冰冻切片，并在需要时使用这些切片食材来制作各种美食。
请记住，在进行冰冻切片之前，请确保食材的新鲜和卫生，并按照适当的贮存方式保存切片食材，以确保其品质和食用安全。
冰冻切片技术原理
冰冻切片技术原理冰冻切片技术是生物学领域中常用的一种技术，用于获得活体组织的高分辨率、高质量的切片样品。
这种技术能够保留组织的细胞结构和功能状态，并且可以用于进一步的光学显微观察、免疫染色和分子生物学分析。
冰冻切片技术主要包括冰冻、固定和切割三个步骤。
首先，冰冻是冰冻切片技术的第一步。
样品通常是通过浸泡在液氮中或使用特殊冷冻剂使之迅速冷冻。
在快速冷冻的过程中，水分子会形成冰晶，冻结组织细胞内的各种分子和结构，并起到了一个固定的作用，以保留细胞结构的完整性。
其次，固定是冰冻切片技术的第二步。
固定可以用于进一步固定组织内的分子和结构，以增加样品的稳定性和可视性。
常用的固定剂有乙醛、戊醛和混合溶液等。
固定可以通过交联细胞中的蛋白质和核酸，以防止其在切割过程中的失去或变性。
最后，切割是冰冻切片技术的第三步。
切割一般使用切片机或显微镜下的微操纵器进行。
切割机通常可以根据需要调整切片的厚度，一般为几微米至几十微米。
在切割过程中，样品需要保持冷冻状态，以保持细胞结构的完整性。
切割的刀片也需要保持锋利和无尘，以避免样品受到污染或结构损坏。
冰冻切片技术的原理主要是基于快速冷冻和固定的原理。
在快速冷冻过程中，组织内的水分子迅速形成冰晶，使细胞和组织的分子结构被固定，以保持其形态和功能的完整性。
同时，固定剂的使用可以进一步固定组织内的分子和结构，增加样品的可视性和稳定性。
通过冰冻切片技术可以获得高分辨率、高质量的切片样品，并可在进一步的显微观察、免疫染色和分子生物学分析中使用。
冰冻切片技术的优点在于它能够保留细胞和组织的细微结构和功能状态。
相比于传统的石蜡包埋切片技术，冰冻切片技术更适用于需要保留细胞结构和功能的研究。
此外，冰冻切片技术还可以用于多种组织类型的切割，如生物样本、植物组织、动物组织等。
总之，冰冻切片技术通过快速冷冻和固定的原理，可以获得高分辨率、高质量的切片样品。
它保留了组织的细胞结构和功能状态，并可用于进一步的显微观察、免疫染色和分子生物学分析。
冰冻切片注意事项
冰冻切片注意事项冰冻切片是一种常用的实验技术，在科学研究、医学诊断和药物开发中起着关键作用。
这种技术可以将组织样本以无损坏的方式保存，并用于后续的显微镜观察和分析。
然而，要获得高质量的冰冻切片需要注意一些重要的事项。
以下是一些关键的注意事项。
1.选择合适的切片仪器和材料：要获得最佳的切片效果，应选择高质量的切片仪器和材料。
切片仪器应具备高速度和高精度的切割能力，并且能够保持适宜的温度和湿度。
切片材料应选择具有较好的冷冻保护性能和切割性能的材料。
2.适当的标本处理：在进行冰冻切片前，标本应进行适当的处理。
首先，标本应被固定以保持其形态和结构的稳定性。
常用的固定方法包括冷冻固定、化学固定和生理盐水固定等。
其次，在进行冷冻切片前，标本应进行充分的去水处理，以使切片的质量更好。
3.适宜的切片温度：切片温度是决定切片质量的重要因素。
一般情况下，切片温度应尽量低，以减小标本的结构变形和切割的损伤。
通常，切片温度应控制在-20℃至-30℃之间。
4.适当的切片速度：切片速度是决定切片厚度和切片质量的关键因素。
切片速度过快会导致切片厚度不均匀，切片速度过慢则容易引起标本的变形和损伤。
一般情况下，切片速度应适中，并且应根据不同的标本类型进行调整。
5.切片后的处理：切片后，切片应立即进行处理，以防止切片的结构变形和氧化。
处理方法包括立即放入冷冻保存或石蜡包埋等。
6.切片的储存和保存：冰冻切片在使用前需要进行储存和保存。
一般情况下，切片应保存在低温环境中，以保持其形态和结构的稳定性。
冷冻切片的保存时间一般较短，通常为几天至几周。
7.切片质量的评估：为了确保冰冻切片的质量，应对切片进行适当的评估。
评估的方法包括显微镜观察和组织学染色等。
通过评估，可以发现切片中存在的问题，并采取相应的措施进行改进。
总之，冰冻切片技术在科学研究和医学诊断中具有重要的应用价值。
遵循上述的注意事项，可以获得高质量的冰冻切片，从而提高实验和诊断的准确性和可靠性。
冰冻切片的保存方法
冰冻切片的保存方法
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊超级重要的冰冻切片的保存方法哟！
你想想，要是辛辛苦苦做好的冰冻切片，因为保存不当出了问题，那得多抓狂啊！就好比你精心做了一道美味佳肴，结果没保存好，变质了，那得多可惜呀！
先说温度，这可是关键哦！一定要把冰冻切片放在超低温的环境里，比如说零下八十度的冰箱。
就像小企鹅生活在南极的冰天雪地中一样，那可是它们最舒适的家呀。
你可别把它放在温度不合适的地方，不然就像把小企鹅扔到热带，那还不得热坏啦！
然后呢，密封也超级重要！要把它好好地包起来，不能让外界的杂质呀、水分呀跑进去。
这就好比给它穿上了一层厚厚的铠甲，保护着它呢！你说要是没密封好，让一些坏东西钻进去了，那不就糟糕啦！
还有哦，标记可不能忘！给每一个冰冻切片都写上清楚的标记，就像给它们都起个名字一样，这样找起来才方便呢。
不然一堆切片放在那，你都不知道哪个是哪个，那不就抓瞎啦！
“哎呀，我之前的冰冻切片就是因为没保存好，结果全白费了！”这是我曾经听到过的一位实验小伙伴的惨痛经历。
所以呀，大家一定要重视这个问题，不能马虎哦！
我觉得呀，只要按照正确的方法来保存冰冻切片，就像是给它们打造了一个温暖又安全的家，它们就能好好地“住”下去，为我们的实验提供可靠的支持呢！大家可千万要记住这些方法呀，别不当回事儿哦！。
《冰冻切片法》课件
近年来，冰冻切片技术不断改进，如冷冻保护剂的选择、制冷剂的种类和切片刀 的材质等方面都有所突破，提高了制片质量和效率。同时，冰冻切片法与其他技 术如免疫荧光、原位杂交等结合使用，为科学研究提供了更多手段。
02
冰冻切片法的技术原理
冰冻切片的制作过程
01
02
03
样本准备
将待检测组织固定在冷冻 台上，用冷丙酮或包埋剂 进行冷冻。
细胞结构和超微结构。
冰冻切片法的缺点
技术要求高
冰冻切片技术要求高，需要熟练的操 作技巧和经验，才能获得高质量的切 片。
设备昂贵
冰冻切片机等设备较为昂贵，增加了 制片成本。
容易产生冰晶
在冷冻过程中，组织内部容易形成冰 晶，影响切片的清晰度。
制片质量不稳定
由于制片过程中涉及多个步骤，且每 个步骤都可能影响制片质量，因此制 片质量有时不太稳定。
切片制作
使用冷冻切片机将冷冻的 组织切成5-10微米厚的切 片。
贴片与固定
将切片贴在载玻片上，并 用丙酮固定。
冰冻切片的质量控制
切片厚度
确保切片厚度均匀，一般 在5-10微米之间。
组织完整性
确保组织结构完整，无破 碎或裂痕。
染色效果
染色效果应均匀，无沉淀 或悬浮物。
冰冻切片的染色方法
苏木精-伊红染色法
基因表达研究
03
通过冰冻切片技术，可以对组织中的基因表达进行快速检测和
分析，有助于研究基因功能和疾病机制。
在其他领域的应用
食品安全检测
冰冻切片技术可用于快速检测食品中的有害物质和微生物， 保障食品安全。
环
05
冰冻切片法的优缺点及展望
冰冻切片法的优点
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用环境要求：冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学研究、组织学以及免疫组织化学等领域中广泛应用。
它的作用是在保持组织的形态和结构的同时，为后续的研究提供高质量的样品。
下面是冰冻切片的步骤要求和作用的详细介绍。
步骤要求：1.样本选择：选择适合冰冻切片的样本，例如组织的大小适中且不易破裂的组织。
2.固定样本：使用适当的固定剂对样本进行固定，以保持组织的形态和结构。
3.处理样本：用缓冲液对样本进行洗涤处理，去除细胞液和外源性污染物。
4.冻结样本：将样本在低温条件下冻结，最常用的方法是使用液氮或酒精浴。
5.切片样本：使用切片机将冻结的样本切成薄片，通常为10-50微米的厚度。
6.挂片或贴片：将切片移至载玻片或切片笼中，并在玻片上做相应的标记。
作用：1.保持组织形态和结构：冰冻切片可以保持组织的天然形态和结构，避免固定和染色等过程对组织产生的变性和变形。
2.提供高质量的样品：因冰冻切片的快速切割过程，可以获得高质量、无伤害的组织样品，适合各种形态和形状的组织切片。
3.便于固定和染色：冰冻切片可以便于进一步固定和染色处理，以进行组织学、免疫组织化学等研究。
4.保存组织信息：冰冻切片可以有效保存组织的蛋白质、核酸和其他生物大分子的信息，保留了研究的全面性和综合性。
5.实时观察组织结构：冰冻切片可以随时进行观察和实时分析，不需要特殊的染色处理，有利于实验结果的快速获取。
总结：冰冻切片是一种常用且重要的实验技术，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它的步骤要求和作用都与保持组织形态和结构、提供高质量样品、便于进一步处理和观察等方面密切相关。
通过冰冻切片技术，我们可以更好地理解和研究生物体内部的结构和功能，为生物学研究的进展提供有力支持。
冰冻切片注意事项课件
THANK YOU
冷冻温度与时间控制
总结词
详细描述
切片厚度与刀片选择
总结词
切片厚度和刀片选择直接影响到冰冻切片的观察效果和制片质量。
详细描述
应根据检查目的和组织特性选择合适的切片厚度和刀片类型。对于较软的组织，应使用较薄的切片和锐利的刀片， 而对于较硬的组织，则应使用较厚的切片和钝刀片。此外，在制作过程中要保持刀片的清洁和锋利，并及时更换 刀片。
细胞固定与透化方法的应用
总结词
详细描述
05
冰冻切片制作实例分析
实验一：冰冻切片制作过程解析
冰冻切片制作的基本原理 实验步骤详解 常见问题及解决方案
实验 二
01
不同组织样本的特点
02
制作技巧与要点
03
实例分析
实验三：染色与观察方法优化研究
染色方法的选择
观察方法的优化
实例展示
实验四：细胞结构保护与固定方法研究
度或更换刀片。
切片易碎或断裂
01
总结词
02
详细描述
03
解决方案
染色不均匀或颜色不鲜艳
总结词 详细描述 解决方案
细胞结构不清晰或模糊
总结词 详细描述 解决方案
04
冰冻切片制作技巧与经验分享
冷冻时间与温度的掌握
总结词
合适的冷冻时间和温度是冰冻切片的关 键因素，可以影响切片的品质和染色效果。
VS
详细描述
冰冻切片的冷冻时间应该根据组织的类型 和厚度来确定，一般来说，较厚的组织需 要更长的冷冻时间。同时，冷冻温度应该 控制在-20℃以下，以确保切片的质量。
切片厚度与刀片角度的调整
冰冻切片
其他信息
其他信息
冰冻干燥 原理 为冰冻组织保持高度真空，直到去除组织中的水分。 过程 小块组织骤冷→立即在真空干燥脱水（－30～－40℃）冰升华，水气去除，不会发生酶的弥散→材料干后， 升到室温浸于石蜡或碳蜡包埋。 特点 能出色地保存组织的酶活性，还有助于保持组织的结构。但仪器贵，需时长。 冰冻替代法 原理 低温下用液体脱水剂取代组织中的水分。
应用
应用
（1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 （2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其 它的治疗措施。 （3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 （4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 （5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 （ 6 ） 某 些 酶 的 显 示 如 AT P 酶 ， 琥 珀 酸 脱 氢 酶 等 。 （7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏 法等。 （8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。
冰冻切片
在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法
01 定义
03 使用原因
目录
02 应用 04 制作方法
05 优缺点
07 其他信息
目录
06 注意事项
基本信息
在手术台上取下的组织放到冷冻机里面-20度左右冻成硬块，制成切片用于快速诊断,该诊断仅作参考，应以 石蜡诊断为主。
定义
定义
冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其 制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻 切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年 前被认为是非常重要的技术，也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到重视。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常用于生物学研究的技术，用于制备组织切片以供光学显微镜观察。
冰冻切片的步骤要求和作用如下：一、步骤要求：1.标本固定：首先，需要选择适合的标本进行固定。
常见的标本包括动植物组织、器官、细胞等。
固定常采用的方法有乙醛定型法、福尔马林定型法等，目的是保持组织的形态和结构。
2.干燥：将固定好的标本进行干燥处理，常用的方法有空气干燥、醋酸解脂等。
干燥的目的是使细胞固定在组织中，减小切片过程中的移位和变形。
3.冰冻：将固定好且干燥的标本进行冰冻处理，通常使用低温冷冻机或液氮进行冰冻。
冰冻的目的是使细胞和组织速冻，保持其原有的结构和形态。
4.切片：使用显微切片机或冰冻微浪切片机将冰冻标本切割成薄片。
切片的要求是薄且均匀，通常在10-50微米之间。
5.捕获：用切片夹将切片移入载玻片上，并注入缓冲液或显微镜密封液，以保持切片的湿润和结构稳定。
6.染色：根据需要可以对切片进行染色，常用的染色方法有苏木精-伊红染色、姜黄染色等，目的是突出组织结构和细胞器。
二、作用：1.结构观察：冰冻切片制备的组织切片可以提供高分辨率、立体感强的结构信息，可以观察细胞和组织的形态、结构和排列方式。
2.免疫组化：冰冻切片可以被用于免疫组织化学染色和免疫荧光染色等技术。
这些技术可以用来检测特定的蛋白质和其他分子在组织中的分布和表达程度。
3.分子定位：通过使用特定的探针或荧光标记物，冰冻切片可以用于分子定位实验，可实现对特定分子在组织中的定位和可视化。
4.病理学研究：冰冻切片可以提供病理学诊断的信息。
医学领域常用冰冻切片技术进行快速病理诊断，如冷冻切片法可以在手术中实时检测并确定肿瘤的范围和边界。
5.遗传学研究：冰冻切片被广泛用于研究组织和细胞的遗传变异、突变和表达差异等。
如原位杂交和原位PCR技术可以用于检测特定基因在组织中的分布和表达。
6.药物筛选：冰冻切片可以用于药物的筛选和效果评估。
通过给予切片不同的药物处理，可以观察药物在组织中的作用和效果。
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。
下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。
固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。
常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。
冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。
切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检查和更换刀片。
5. 切割组织样品将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。
切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。
切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。
确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。
干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。
可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。
可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
快速冰冻切片注意事项
快速冰冻切片注意事项快速冰冻切片是一种常用的实验技术，用于固定和保留生物样本的形态结构。
在进行快速冰冻切片时，需要注意以下几点，以确保实验的准确性和可靠性。
1. 选择适当的冷冻介质：在进行快速冰冻切片之前，需要选择适合的冷冻介质。
常用的冷冻介质包括液氮、液氮和乙醇混合物以及液氮和乙醇和干冰混合物。
选择合适的冷冻介质可以确保样本迅速冷冻并保持其形态结构。
2. 控制冷冻速度：快速冰冻切片的关键是控制冷冻速度。
较快的冷冻速度可以减少冰晶的形成，从而减少对样本结构的破坏。
为了实现快速冷冻，可以使用预冷的切片台、冷冻夹具或冷冻盒等设备。
3. 适当的样本固定：在进行快速冰冻切片之前，需要对样本进行适当的固定。
常用的固定方法包括化学固定和冷冻固定。
化学固定可以使用缓冲液、乙醛或戊二醛等，而冷冻固定则是将样本迅速冷冻在冷冻介质中。
4. 切片前的样本处理：在进行快速冰冻切片之前，需要对样本进行适当的处理。
这包括去除多余的组织、清洁样本表面以及调整样本的大小和形状等。
样本处理的目的是为了获得清晰的切片和减少切片过程中的伤害。
5. 使用适当的切片工具：选择适当的切片工具对于获得高质量的切片非常重要。
常用的切片工具包括冷冻切片机、超薄切片机和冷冻微扫描电镜等。
根据实验需求选择合适的切片工具，可以提高切片的准确性和可重复性。
6. 控制切片厚度：切片厚度的选择取决于实验的要求和样本的性质。
通常，快速冰冻切片的厚度在几微米到几十微米之间。
选择适当的切片厚度可以确保样本的结构和细节得到清晰显示。
7. 切片过程中的温度控制：在进行快速冰冻切片时，需要控制切片过程中的温度。
通常情况下，切片过程中的温度应低于样本的冰点，以避免样本的融化和变形。
可以使用冷冻夹具或冷冻盒等设备来控制切片过程中的温度。
8. 切片后的保存和处理：在完成快速冰冻切片后，需要对切片进行适当的保存和处理。
切片可以保存在冷冻盒中，或者进行染色、免疫标记等后续处理。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用冰冻切片是一种常见的组织切割技术，它使用低温冷冻样品，然后使用切片机将样品切成非常薄的切片。
冰冻切片技术是生物学研究和医学诊断中不可或缺的重要工具。
它可用于观察许多样品的内部结构，如细胞、组织和器官等，进一步了解它们的功能和形态。
下面将详细介绍冰冻切片的步骤要求及其作用：1.样品固定：在进行冰冻切片前，样品需要进行固定以保持其形态、结构和细胞凝胶状态。
常见的固定方法包括乙醛固定和冷凝固定。
选择适当的固定方法取决于待测样品的特性和研究目的。
2.固定样品冷冻：在进行冰冻切片前，固定的样品需要在低温下冷冻。
冷冻操作的关键是控制冷冻速度和温度，以防止样品在冷冻过程中发生损伤。
常见的冷冻方法包括液氮冷冻和冷冻板冷冻。
液氮冷冻可以实现更快的冷冻速度，而冷冻板冷冻则可以更好地控制冷冻温度和速度。
3.制备切片：冷冻后的样品需要进行切片。
切片机通常用于切割样品。
在切片机工作之前，需要将切片刀冷却到适当的温度，以防止冻结的样品在切割过程中解冻。
然后，将冷冻样品放在切片机上，并调整合适的切片参数，包括切片厚度和速度等。
4.收集切片：完成切割后，收集切片并放置在适当的载玻片或载片上。
注意不要损坏或弄丢切片，同时避免切片之间的交叉污染。
将切片放置在载片上后，可以进行染色、免疫染色或其他实验处理。
5.形态学检查：切片制备完成后，可以使用显微镜对切片进行形态学检查。
通过观察切片，研究者可以进一步了解样品的内部结构，如细胞、组织或器官的形态、形状、大小、有丝分裂状态、细胞排列、器官的血供和微观解剖结构等。
6.免疫组化处理：冰冻切片的一个重要应用是免疫组化染色。
可以使用适当的抗体来标记感兴趣的分子，从而确定其在样品中的存在和定位。
这种技术可以帮助研究者确定一些蛋白质的表达情况、定位和数量，并进一步揭示其在生物学过程中的功能。
7.其他实验处理：除了免疫组化处理外，冰冻切片还可以在其它实验中应用。
例如，可以在切片上进行蛋白质或核酸的杂交实验，研究蛋白质表达的变化或基因表达的调控。
冰冻切片制备的主要步骤
冰冻切片制备的主要步骤冰冻切片制备是一种常用的生物学和医学实验技术，用于在冷冻状态下快速切割组织样本，并进行随后的病理学诊断或研究。
以下是冰冻切片制备的主要步骤：一、准备样本在进行冰冻切片制备之前，需要准备好待检测的组织样本。
这些样本可以来自各种来源，如手术切除、活检、尸检等。
样本应该尽快放入适当的冷冻介质中，如OCT包埋剂，以保持其冷冻状态。
二、冷冻将准备好的样本放入冷冻切片机中，通常是一个恒温的金属块。
这个金属块被冷却到低于-20℃的低温，确保样本快速冷冻。
在这个过程中，需要特别注意不要让冷冻过度或不足，因为这会影响切片的品质。
三、切片使用冷冻切片机将冷冻好的样本切成薄片。
切片的厚度通常在5-10微米之间，以确保切片能够清楚地显示组织的结构和特征。
这个过程需要熟练的技术员操作，以保证切片的完整性和均匀性。
四、固定刚切好的切片非常容易受到热和湿气的影响，因此需要迅速固定。
通常使用甲醇或乙醇作为固定剂，将切片固定在载玻片上。
这一步可以防止切片在接下来的步骤中滑落或移动。
五、染色固定好的切片需要进行染色以更好地显示其结构和特征。
最常用的染色方法是hematoxylin and eosin (H&E)染色。
这一步可以在染色机中完成，也可以手工操作。
染色完成后，切片会被冲洗干净并彻底干燥。
六、观察和诊断最后一步是将制备好的切片放在显微镜下观察，并进行病理学诊断。
此时，病理学家可以根据切片的特征对疾病进行分类和分级，或者对手术切缘进行评估。
以上就是冰冻切片制备的主要步骤。
需要注意的是，每个步骤都需要严格的操作规程和技术要求，以保证制备出的切片能够准确地反映组织的结构和特征。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤冰冻切片是一种常用的实验技术，用于研究生物样品的结构和功能。
在冰冻切片实验中，样品必须被快速冻结并制成非常薄的切片，以保持样品的原始结构和形态。
以下是一个冰冻切片实验的一般步骤，供参考。
1.准备工作：-准备所需的实验材料和设备，包括动物或细胞样品、细胞培养基、PBS缓冲液、冷冻剂（如液氮或干冰）、冷冻切片机、切片刀片、切片贴片和载玻片等。
-充分冷却冷冻切片机，并确保切片刀片处于锋利和清洁状态。
-确保实验环境卫生干净，并且操作台面上没有其他杂物和细菌。
2.过度冷冻：-在离心管或培养皿中收集样品，如组织块或细胞团。
-将样品迅速置于冷冻剂中，以快速冷冻样品。
在制备过程中，样品冷冻的速度非常重要，可以使用冰浴或液氮使样品迅速冷冻。
3.制备冷冻样品：-将冷冻固态样品放入冷冻切片机的样品夹内，确保样品与夹具接触良好。
-调整切片刀片的角度和位置，以确保薄片的切割。
-使用冷冻切片机制备冷冻样品，比如用于大脑切片的考尔密斯键切片机。
4.切片过程：-打开冷冻切片机的刀片和样品夹，以容纳载玻片。
-将切片刀片横跨切片机的切片口，并确保刀刃与样品夹接触。
-使用微调装置，轻轻地将切片刀片向下移动，以制备样品切片。
可以根据需要调整切片的厚度。
5.取样和处理：-将切制好的样品轻轻地使用毛刷或细针取下，并将其浸泡在PBS缓冲液或其他处理液中进行进一步处理。
-根据实验需求，可以进行染色、免疫标记和显微镜检查等处理。
6.制备切片贴片和载玻片：-取出切片贴片并将其浸泡在PBS缓冲液中，让其变湿。
-使用镊子或其他工具将处理好的样品放在切片贴片上，然后轻轻地将切片贴片放在载玻片上。
确保样品均匀分布在切片贴片上，并避免形成气泡。
7.干燥和封装：-将切片贴片从PBS缓冲液中取出，用纸巾或吸水纸轻轻地吸去多余的液体。
-将载玻片置于干燥盒中，确保切片在常温下彻底干燥。
-使用合适的密封胶将载玻片封装，以防止切片的氧化和损坏。
总结：冰冻切片实验是一种常用的技术，用于研究生物样品的结构和功能。
冰冻切片
冷冻切片一、恒温冷冻切片将组织在恒温冷冻切片机里切片。
冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
(1)、当冰冻组织取好后，有速冻开关的机器可先将开关打开，再在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻。
(2)、待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上(3)、粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片(4)、放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为5～6微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇中固定，固定时间为10～20秒(5)、水洗(6)、苏木素1分钟(7)、水洗(8)、盐酸酒精分化1秒钟(9)、水洗(10)、温水蓝化(11)、伊红2～5秒钟(12)、梯度酒精快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
冰冻切片的注意事项:(1) 速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。
而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
(2)固定：切片后应立即放入甲醇中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。
固定液有很多种，根据我们的实践，认为甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液。
如加5%冰醋酸较果更好。
(3)包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。
太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉,影响切片的质量。
(4)冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整,不能进入抗卷板。
最好能使用一次性刀片。
(5)如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
有关细胞和组织学技术一、细胞和组织免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。
由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。
因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十（一）细胞标本的取材目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。
应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。
近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。
细胞标本的取材有以下3种方法:1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。
新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。
优点是简便省时，细胞抗原保存较好。
缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。
2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。
用细针穿刺吸抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。
如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。
缺点是细胞分布不均匀。
洗涂法片虽可弥补3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。
体液采取后，必须量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。
②细胞数量较少者，可将液体自离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。
如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。
培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。
某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细入培养液内即可收集到理想的细胞标本。
某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。
制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。
③粘液丰富的标宜作免疫组化标记。
（二）组织标本的取材组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。
前三者均为新鲜不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。
组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。
为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。
为充分保存组织的抗原性，标本离体后庆立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70。
C冰箱内备用。
二、细胞和组织的固定（一）固定为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。
固定的作用不和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大。
如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，HBsAg属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。
（二）固定剂用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。
（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混合加热至60℃，搅拌并滴加1n NaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。
浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g ,蒸馏水90ml）。
有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。
也有人认为它减弱细胞的宜用于免疫荧光标记。
氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。
（6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。
Bullock等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性体仅为甲醛升汞液的1/10。
此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。
（7）Bouin’s液。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。
（8）Zamboni’s液。
该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。
采用组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。
固定时间6-18h。
（9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。
该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是过碘酸氧化组织中的结合，从而与糖形成交联。
组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液响其在组织中的位置（固定剂7-9配制法见附录1）。
2．非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。
（1）碳化二亚胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS IgA、IgG效果不佳。
（2）碳二亚胺-戊二醛液（ECD-G液）：配制法见附录一。
ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimide Hydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种（3）Zenker’s 液（重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后，临用时加水醋酸5ml）。
该固定液对免疫球蛋白染色最佳，固定时间约2-4h，染色前必须脱汞色素。
3．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲（1）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。
（2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。
Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞（3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。
（4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。
C保存备用。
（5）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。
C保存备用。
以上两种固定液适宜某些抗原，癌基因蛋白产物检测的固定，P53抗癌基因蛋白产物，PC-NA等抗原的保丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。
C低温冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。
以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多（见附录），不同的抗原和标本为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。
而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。
②最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。
必要时，可作多种固定固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。
②组织块不易过大过厚，必须小于制在0.3cm以内。
③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果人为假象。
（三）固定方法1．浸入法（Immersion method）将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温（4。
C）环境下进行，固定一般在2-12h之间。
2．灌注法（Irrigation method）此法适用于动物实验研究。
自左心室插入主动脉，先以krebs或生理盐注入固定液。
置灌注动物于4。
C冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。
外周组织一般在灌注后30min内取材，织块。
有主张用冷固定剂（4。
C）进行灌注。
我们的体会是一般光镜下观察的标本，室温固定即可获满意效果。
肽类抗原活性在断绝血液供应后24h几乎完全丧失。
灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。
达到充分固定之目的。
灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物以及其它不能进行灌注的组织固定。
三、组织切片技术应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。
其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原冻切片。
新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。
冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。
一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，上述现象更易发生。
冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多量降低冰晶的数量。