体外放射分析

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

标记物的制备和鉴定
• 常用放射性核素:125I • 方法 1、直接法:最常用于肽类、蛋白质、酶的碘化标记,采 用化学或酶促氧化反应直接将125I结合于被标 记物分 子中酪氨酸残基或组胺残基上。 1)氯胺T法:125I-被ch-T氧化成125I+ ,后者取代酪氨酸残 基苯环上的氢原子。 2)乳过氧化物酶法:LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧, 后者使125I-氧化成125I+ ,从而取代酪氨酸残基苯环上的 氢原子。 2、间接法:联接标记最常用。主要用于小分子化合物的 标记。
2 4 8 16 已知Ag浓度
32
• 标准பைடு நூலகம்线
标准曲线的拟合方式
• 标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的 客观尺度 反映检测质量的指标 标准曲 线要最大限度地反映量、效关系 便于自 动化分析,使用灵活 每一批分析必须做 一条标准曲线。
常用的方法有
• log-logit坐标系及线性回归法: 是目 前公认比较好的拟合方法,它是以结合 率的logit值为纵坐标,以标准品浓度的 对数值为横坐标,制成散点图,然后用 最小二乘法对各散点进行直线回归,得 出回归方程,获得标准曲线,可用计算 机或计算器完成。
Competive inhibition curve
• Binding rate(%)
• Concentration of antigen(mol/L)
抗体的工作浓度
• Ag*与Ag的免疫化学性质相同; • Ag*与Ag之和大于Ab,Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%
RIA的基本条件
Specific binding reagent
• 特异性结合剂抗体特异性(specificity):交 叉反应的程度越小越好 • 亲和力(affinity):配体与结合剂相互结合 的程度,是反映结合剂质量的主要指标。 可用亲和力常数表示。 • 滴度(titer):在RIA时,结合50%的标记配 体的结合剂稀释度;IRMA分析要求较高 滴度(过量)。
Labeled
• 标记品 • 合适的核素标记(半衰期、射线类型、能量等) • 标记物的用量要小,应等于或低于待测物的 最小量 • 足够的比活度 • 放化纯度高 • 免疫活性 • 稳定性好,贮存不易脱标
• 半对数坐标系制图法制图方法简便,但 易导致主观误差。 B/F (%) Log X
• 特异性抗体:亲和力大,滴度高,特异性强 • 标记抗原:纯度高;较高的比活度;放化纯度 >95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落 • 标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活 性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准; 质控标准) • B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不 易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好 (双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA 法,微孔滤膜法) • 放射性测量仪器: 计数器
Diluted multiple of Ab 50%的最大结合 率为抗体工作浓度
放射免疫分析
• 基本原理:
放射免疫分析
• RIA竞争结合原理示意图:
Standard curve
• 如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下 进行分析,测得各标准点的结合率(B/F),以 结合率对标准品量作图,可以得到一条标准曲 线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待 测样品的含量。 结合率 50%
• 放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。 • 其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为 普遍。 • 不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素 等物质的测量,而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测,如血药浓度测定等。
分类
• Competive binding analysis • 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一 类检测技术。另外还有放射受体分析、蛋白质 竞争结合分析、放射酶促分析等。 • Non-competive binding analysis • 免疫放射分析、受体放射分析是典型的非竞争 性体外放射分析。此外。还有酶的放射化学测 定、酶的激活剂或抑制剂测定法等。
标记物的纯化
• 1、凝胶过滤法(Sephadex G-50柱层析分 离较常用) • 2、离子交换层析法 • 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE) • 4、高效液相色谱法(HPLC)
标记物的鉴定
• 1、放射化学纯度,一般要求大于95% • 2、免疫活性 • 3、比放射性:单位化学量标记物中所含的放 射性强度。
Log-Logist 作图法
• logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1B/Bo ) a=截距 b斜率为“-”值 • Y=结合率 Y与X呈负相关 r为负值,接近1表示曲线质量好
• Logistic 法是log-logit的发展,但克服了loglogit的不足,也是目前认为较好的拟合方 法。
Definition
• 在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name
Main methods
Radioimmunoassay,RIA
• 是以抗原抗体的免疫反应为基础,利用 待测抗原与定量的标记抗原同有限量的 特异性抗体竞争性结合,以放射性测量 为微量定量手段,获得待测生物样品中 抗原浓度的技术。
Radioimmunoassay,RIA
• 抗原与相应的特异性抗体在适当条件的 反应体系中能够产生结合反应,形成抗 原抗体复合物。
体外放射分析
内容提要
• Part one: 体外放射分析技术 • Part two: 非放射免疫分析技术 • Part three: 临床应用
历史
• 1960年美国的Berson和Yalow 将核技 术与免疫学技术相结合建立了放射免疫 分析法,并首先用于测定血浆胰岛素浓 度,由于该法对医学的巨大贡献,1977 年Yalow获得了Nobel奖。
相关文档
最新文档