体外放射分析

标记物的制备和鉴定
• 常用放射性核素：125I • 方法 1、直接法：最常用于肽类、蛋白质、酶的碘化标记，采 用化学或酶促氧化反应直接将125I结合于被标 记物分 子中酪氨酸残基或组胺残基上。 1）氯胺T法：125I-被ch-T氧化成125I+ ，后者取代酪氨酸残 基苯环上的氢原子。 2）乳过氧化物酶法：LPO催化H2O2释放活泼的新生态氧， 后者使125I-氧化成125I+ ，从而取代酪氨酸残基苯环上的 氢原子。 2、间接法：联接标记最常用。主要用于小分子化合物的 标记。
2 4 8 16 已知Ag浓度
32
• 标准பைடு நூலகம்线
标准曲线的拟合方式
• 标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的 客观尺度 反映检测质量的指标 标准曲 线要最大限度地反映量、效关系 便于自 动化分析，使用灵活 每一批分析必须做 一条标准曲线。
常用的方法有
• log-logit坐标系及线性回归法： 是目 前公认比较好的拟合方法，它是以结合 率的logit值为纵坐标，以标准品浓度的 对数值为横坐标，制成散点图，然后用 最小二乘法对各散点进行直线回归，得 出回归方程，获得标准曲线，可用计算 机或计算器完成。
Competive inhibition curve
• Binding rate（％）
• Concentration of antigen(mol/L)
抗体的工作浓度
• Ag*与Ag的免疫化学性质相同； • Ag*与Ag之和大于Ab，Ag*与Ab的量保持恒定。 Binding rate(%) 50%
RIA的基本条件
Specific binding reagent
• 特异性结合剂抗体特异性(specificity)：交 叉反应的程度越小越好 • 亲和力(affinity)：配体与结合剂相互结合 的程度，是反映结合剂质量的主要指标。 可用亲和力常数表示。 • 滴度(titer)：在RIA时，结合50%的标记配 体的结合剂稀释度；IRMA分析要求较高 滴度（过量）。
Labeled
• 标记品 • 合适的核素标记（半衰期、射线类型、能量等） • 标记物的用量要小，应等于或低于待测物的 最小量 • 足够的比活度 • 放化纯度高 • 免疫活性 • 稳定性好，贮存不易脱标
• 半对数坐标系制图法制图方法简便，但 易导致主观误差。 B/F (%) Log X
• 特异性抗体：亲和力大，滴度高，特异性强 • 标记抗原：纯度高；较高的比活度；放化纯度 >95%;保持免疫活性;标记稳定性好,无核素脱落 • 标准品:与被测物属同一种物质,具有相等的活 性,高度纯化;定量要精确(国家标准;药盒标准; 质控标准) • B与F分离技术:完全又快速,非特异性结合低;不 易受外界因素的干扰;价廉,操作简便,重复性好 (双抗法,沉淀法,双抗+PEG法,固相分离法,SPA 法,微孔滤膜法) • 放射性测量仪器: 计数器
Diluted multiple of Ab 50％的最大结合 率为抗体工作浓度
放射免疫分析
• 基本原理：
放射免疫分析
• RIA竞争结合原理示意图：
Standard curve
• 如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下 进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以 结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲 线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待 测样品的含量。 结合率 50%
• 放射免疫分析、免疫放射分析、放射受体分析、 受体放射分析、蛋白质竞争结合分析等。 • 其中以放射免疫分析和免疫放射分析应用最为 普遍。 • 不仅可用于样品中蛋白质、多肽、甾体类激素 等物质的测量，而且可用于具有生物活性的小 分子物质的检测，如血药浓度测定等。
分类
• Competive binding analysis • 放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一 类检测技术。另外还有放射受体分析、蛋白质 竞争结合分析、放射酶促分析等。 • Non-competive binding analysis • 免疫放射分析、受体放射分析是典型的非竞争 性体外放射分析。此外。还有酶的放射化学测 定、酶的激活剂或抑制剂测定法等。
标记物的纯化
• 1、凝胶过滤法（Sephadex G-50柱层析分 离较常用） • 2、离子交换层析法 • 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE） • 4、高效液相色谱法（HPLC）
标记物的鉴定
• 1、放射化学纯度，一般要求大于95% • 2、免疫活性 • 3、比放射性：单位化学量标记物中所含的放 射性强度。
Log-Logist 作图法
• logit Y=a+b logit Y=ln(logX/ 1B/Bo ) a＝截距 b斜率为“-”值 • Y＝结合率 Y与X呈负相关 r为负值，接近1表示曲线质量好
• Logistic 法是log-logit的发展，但克服了loglogit的不足，也是目前认为较好的拟合方 法。
Definition
• 在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name
Main methods
Radioimmunoassay,RIA
• 是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用 待测抗原与定量的标记抗原同有限量的 特异性抗体竞争性结合，以放射性测量 为微量定量手段，获得待测生物样品中 抗原浓度的技术。
Radioimmunoassay,RIA
• 抗原与相应的特异性抗体在适当条件的 反应体系中能够产生结合反应，形成抗 原抗体复合物。
体外放射分析
内容提要
• Part one: 体外放射分析技术 • Part two: 非放射免疫分析技术 • Part three: 临床应用
历史
• 1960年美国的Berson和Yalow 将核技 术与免疫学技术相结合建立了放射免疫 分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓 度，由于该法对医学的巨大贡献，1977 年Yalow获得了Nobel奖。