魔芋葡甘聚糖酶解过程及各种不同分子量葡甘露低聚糖制备条件的研究

酶解 方 法： 将 配 制 好 的 不 同 浓 度 的 新 鲜 酶 液 1mL 加入到 99mL 不同 pH 的缓冲溶液中，于不同温 度下在集热式恒温加热搅拌器中保温 10min；磁力搅 拌作用下加 入 一 定 量 已 烘 干 至 恒 重 的 魔 芋 精 粉，于 不同 的 温 度 下 准 确 酶 解 一 段 时 间，取 出，煮 沸 灭 酶 10min。 1.2.2 降解产物分子量及分子量分布测定 测试方 法：采用凝胶渗透色谱法测定。仪器：美国 Agilent 公 司 的 1100 /1200 高 效 液 相 色 谱 系 统； 色 谱 柱： PL aquagel－ OH MIXED 8μm，300 × 7.5mm，货号为 5064 －5282；标准品：PEO / PEG，货号为 5064 － 5280；检测 器：G1362A 示差折光 检 测 器 （ RID） 。测 试 条 件： 流 动相为娃哈哈纯净水配制的 1‰的叠氮化钠溶液；流 速为 1mL / min；柱温为 35℃ ；进样量为 20μL；进样时 间为 20min。 1.2.3 降解产物红外光谱分析 将制备的降解产物 用无水乙醇沉淀，4000r / min 离心 20min，收集白色沉 淀进行真空冷冻干燥。采用 NICOLET 6700 型傅立 叶变换 红 外 吸 收 光 谱 仪 对 干 燥 后 的 产 物 在 650 ～
1.2 实验方法
1.2.1 β－ 甘露聚糖酶催化葡甘聚糖降解反应 本研 究中，不同浓度酶液的制备方法为：准确称取 1.0000g β－ 甘露聚糖酶，定容至 100mL，得到酶液Ⅰ；取酶液 Ⅰ 10mL 定 容 至 100mL，得 到 酶 液 Ⅱ； 取 酶 液 Ⅱ 中 10mL 定容到 100mL，得到酶液Ⅲ；取酶液Ⅲ中 10mL 定容到 100mL，得到酶液Ⅳ；取酶液Ⅳ中 10mL 定容 到 100mL，得 到 酶 液 Ⅴ； 取 酶 液 Ⅴ 中 10mL 定 容 到 100mL，得 到 酶 液 Ⅵ； 取 酶 液 Ⅵ 中 10mL 定 容 到 100 mL，得到酶液 Ⅶ； 以 上 配 制 好 的 酶 液 在 使 用 时 均 取 1mL，由于浓度相差较大，为方便标记，文中以Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ来分别代表 1mL 上述不同浓度 的酶液。将酶液置于 4℃ 环境保存，2d 内用完。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
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魔芋精粉 四川绵阳安县都乐魔芋制品有限公 司；β－ 甘露聚糖酶 四川禾本生物工程有限公司，酶 活力≥3291u / g；氢氧化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、柠 檬酸钠 成都科隆化工试剂有限公司，均为分析纯。
1100 /1200 高效液相色谱系统 美国 Agilent 公 司；NICOLET 6700 型傅立叶变换红外吸收光谱仪 美国赛默飞世尔公司。
收稿日期： 2010－10－15 * 通讯联系人 作者简介： 姚雪（1986－ ） ，女，硕士研究生，研究方向：生物大分子的改
性与利用。 基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（2007BAE42B04） 。
敬而远之。与 KGM 使用受限形成鲜明对比的是，近 年来对葡甘 露 低 聚 糖 的 研 究 和 应 用 愈 加 广 泛，研 究 发现，魔芋葡甘露低聚糖具有促生双歧杆菌［5］、吸附 病原菌［6］、降脂［7］、清除自由基［8］、抑制肠内氨的生成 和吸收［9］等特殊功能。能够实现 KGM 的可控降解， 得到各种不同分子量范围的 KGM 产品，并且使降解 后的 KGM 产物的分子量分散系数 D 值尽可能小，对 魔芋资源的深度开发利用和应用范围的推广是一个 关键问题。目前，在葡甘聚糖的降解方面，几乎全部 是将葡甘聚糖直接降解成分子量极低的低聚糖（ 分 子量通常在 104 以下） ，没有得到其它范围的分子量 分布的降解产物，未达到真正意义上的“可控降解”， 本文的目的就是通过筛选和优化各种控制降解产物 分子量和分 散 系 数 的 因 素，制 备 出 不 同 分 子 量 的 葡 甘露低聚糖。
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4000cm －1 范围做傅立叶衰减全反射测定。
2 结果与讨论
2.1 酶液浓度对降解产物分子量及分散系数的影响
在反应 温 度 50℃ ，缓 冲 液 pH 7.5，反 应 时 间 为 20min，底物浓度为 1.25% 的条件下，酶浓度对降解产 物分子量的影响如图 1 所示。从图 1 中可以看出，当 其它条件一致时，随着酶浓度的增加，降解产物的分 子量也呈递减的趋势，在酶浓度过大时，如 Ⅰ 和 Ⅱ， 分子量的降低不明显，在酶浓度过小时，如 Ⅵ 和 Ⅶ， 分子量的降低也不明显。正交实验时选取酶浓度水 平为酶液Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ酶浓度。
ntration ＞ substrate concentration ＞ pH ＞ temperature ＞ time.Effects of various factors on the molecular weight
distribution were in the following descending order： enzyme concentration ＞ temperature ＞ pH ＞ substrate
本研究中 pH 为 3.5、4.5 和 5.5 的缓冲液由柠檬 酸－ 柠檬酸钠体系组成；pH 为 6.5、7.5 和 8.5 的缓冲 液由磷酸氢二钾－ 氢氧化钠体系组成。
在 β－甘露聚糖酶催化葡甘聚糖的降解反应中， 主要考察不同酶液 （ Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ） 的 浓 度、缓冲液 pH （ 3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 ） 、酶解温度 （ 14、26、38、50、62℃ ） 、底 物 浓 度 （ 0.05% 、0.65% 、 1.25% 、1.85% 、2.45% 、3.05% ） 和 反 应 时 间 （ 2.5、5、 10、20、30、40、50、60min） 这五个单因素对降解产物 分子量及分子量分布的影响。依据单因素实验的结 果确定因素 水 平 范 围，以 降 解 产 物 的 数 均 分 子 量 和 分子量分散系数 D 值为考察指标，进行 L18 （37 ） 正交 实验，以进一 步 分 析 酶 解 过 程 中 各 因 素 对 实 验 指 标 的影响程度。
concentration ＞ time.
Key words： konjac glucomannan； β－mannanase； number average molecular weight； dispersion coefficient；
gel chromatography
中图分类号： TS201.2 + 3
Study on the enzyme－catalyzed degradation of konjac glucomannan and the preparation conditions on the degradation product of various molecular weights
姚 雪，罗学刚* ，韩本超 （ 西南科技大学植物学系，四川绵阳 621010）
摘 要： 通过单因素实验和正交实验研究 β－甘露聚糖酶在催化降解魔芋葡甘聚糖的过程中酶液浓度、缓冲液 pH、温 度、底物浓度以及反应时间对降解产物分子量及分子量分布的影响，同时得到各种不同分子量范围葡甘聚糖降解产物 的制备条件。结果表明：在降解过程中，各因素对降解产物分子量的影响大小依次为酶液浓度 ＞ 底物浓度 ＞ pH ＞ 温度 ＞ 时间，对分散系数 D 值的影响大小依次为酶液浓度 ＞ 温度 ＞ pH ＞ 底物浓度 ＞ 时间。 关键词： 葡甘聚糖，β－甘露聚糖酶，数均分子量，分散系数，凝胶色谱
文献标识码： A
文 章 编 号： 1002－0306（ 2011） 09－0097－05
魔芋是天南星科魔芋属多年生草本植物，其主要 活性成分葡甘聚糖（ KGM） 是一种水溶性的天然高分 子多糖，可广泛应用于环保、食品、医药、化工以及生物 领域［1－2］。KGM 相对分子量为 200000 ～ 2000000［2］，如 此巨大的分子量也使 KGM 具有良好的凝胶性、增稠 性、成 膜 性 等 多 种 特 性［3］，但 同 时 巨 大 的 分 子 量 使 KGM 在水中的粘度非常大，影响了 KGM 在水中的溶 解度，限制了 KGM 的应用范围。在食品领域，KGM 特殊的生理 功 能 使 它 深 受 糖 尿 病、肥 胖 症 患 者 以 及 中老年消费者的喜爱，但 KGM 巨大的分子量却使它 难消 化、易 阻 塞，使 人 体 产 生 腹 胀、腹 泻 等 一 些 不 适 症状［4］，因而被人们视为 “发物”，让许多消费者对其
2.2 缓冲液的 pH 对降解产物分子量及分散系数的 影响
在反 应 温 度 50℃ ，酶 浓 度 为 Ⅳ，反 应 时 间 为 20min，底物浓度为 1.25% 的条件下，缓冲液 pH 对降 解产物分子量的影响如图 2 所示。从图 2 中可以看 出，当其它条件一定，pH 由 3.5 增加到 7.5 时，分子量 曲线逐渐下降，在 pH 为 7.5 左右下降至最低点，此 时，随着 pH 的增加，分子量又开始上升，即 pH 7.5 是 酶的最适 条 件，此 时 酶 活 力 达 到 最 大。 正 交 实 验 时 选取 pH 的水平为 3.5、5.5 和 7.5。
图 1 酶浓度对降解产物分子量及分散系数的影响 随着酶浓度的增加，分散系数呈上升趋势（ A－ B 阶段） ，达 到 一 个 最 大 值 后 又 有 轻 微 的 下 降 趋 势 （ B－ C 阶段） 。魔芋葡甘聚糖的酶解主要是一个多次 剪切过程［15］ ，即 酶 分 子 分 布 在 部 分 葡 甘 聚 糖 分 子 链 上，而其它分子链只有等酶脱附之后才能进行水解， 这就造成了降解产物中始终存在着分子量几乎没有 发生变化的 大 分 子 链，同 时 也 存 在 已 被 多 次 剪 切 的 小分子链，这也造成了分散系数 D 值较大的可能性。 在 A－ B 阶段，当酶浓度逐渐增大时，剪切的分子链和 次数便随着 增 大，由 原 来 全 是 大 分 子 链 的 体 系 逐 渐 开始出现小分子链，并且随酶浓度的增加，小分子链 出现的概率越大，于是 D 值便开始增大；在 B － C 阶 段，酶浓度增大到一定值时，被剪切的分子链越来越 多，当小分子链的数量大大超过大分子链的数量时， 体系开始以小分子链为主，分散系数 D 值又开始有 所下降。