基因文库的建立演示课件.ppt

利用P1载体 构建基因组文库
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七. 利用YAC载体构建基因组文库
1. 两臂DNA片段的制备:
pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化
2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 凝胶电泳 片段回收和纯化
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失
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COS
利 用 单
质 粒 载 体 文 库
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COS
利 构用 建双 基 因 组质 文粒 库载
体
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六. 利用P1载体构建基因组文库
构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
5. 基因组文库的扩增
包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 -70℃保存
精心Fra Baidu bibliotek理
五. 利用COS质粒载体构建基因组文库
构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。
2) 重组DNA分子的包装与感染
与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA
mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在精K心a整n理r平板上4 X 105 - 2 X 106 Kanr。
要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓
度和两种DNA分子的克分子比率。
4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增
利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，
让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能
发生变化）
5. 基因组文库质量的评价
1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质
为提高文库质量，可采取以下措施： 1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG
2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法
3. 重组DNA分子的形成：
控制克分子比率，使其形成串状DNA分子
4. 重组DNA分子的包装
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株：
E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 组建的cDNA文库也就不同
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3. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达 亦不相同
4. 不均匀性
在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的数 目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而 来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的 克隆数相较，这是两种文库的另一差别。
1) 包装物制备用菌株:
E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白
N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 f—插入片段与基因组DNA长度之比
二．建立基因组文库的一般程序
1．载体DNA片段的制备
DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应
2． 供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段
酶法
部分酶切
分离特定大小DNA片段
完全酶切
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3. 供体与载体DNA连接
粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计
算文库大小。
2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续
筛选基因工作量。
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三. 利用质粒载体 构建基因组文库
该法简单、快速、易于 操作，但仅适合一些低 等真核生物和原核生物。
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四. 利用λ载体构建基因组文库
1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得
第四章
基因文库的建立
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基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library)
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第一节
基因组文库的构建
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定义：
含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。
一. 基因组文库的规模
N= ln（1-P） ln（1-f）
脉冲场
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酵 母 人 工 染 色 体 构 建
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第二节
cDNA文库的建立
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定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部
mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖所产生的无性 繁殖系的总和。
一．cDNA文库的特点
1. 基因特异性
常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗 传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—15% tRNA
E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])-
头部蛋白
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i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。