完整版荧光和化学发光免疫分析方法
化学发光免疫测定
时间分辨荧光法 消除样品背景干扰的另一种方法是时间分辨荧 光法。样品背景的荧光寿命一般为10ns，而镧 系鳌合物的荧光寿命一般为10-100μs。且斯托 克斯位移较大，很适用于时间分辨法进行测定。
时间分辨荧光免疫原理图
（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）
3 化学生物发光免疫分析法的特点 （1）优点： 高灵敏度 宽的线性范围 分析速度快 高选择性 高稳定性 花费少 所用试剂无毒 消除放射性同位素的污染。
（2）缺点： 实验结果的重复性方面存在一定问题 发光免疫测定是一种瞬时的化学反应 免疫反应中各种因素的干扰 氧化反应中各种因素的干扰 对催化反应原理有的还不十分清楚，对 实验的反应条件不易控制，干扰现象不 易估计和说明。
2. 发光标记物 （1）发光反应中消耗掉的标记物 a．Luminol及其衍生物 Luminol偶联于配体后，其发光效率较低 Isoluminol及其衍生物被广泛应用 Luminol的氨基取代导致Ф降低 Isoluminol的氨基取代导致Ф增加 此类标记可用于各种分析物，但CL需催化 剂，因此有较高的背景信号。
荧光免疫分析法优点： 消除放射性同位素的污染 稳定性较好 缺点： 高的背景光，限制了灵敏度 干扰测定
三．化学发光免疫分析法 这种分析方法既有发光检测的高灵敏度，又有免 疫分析法的特异性。 1．主要发光体系 鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物 焦焙酚 光泽精 吖啶酯 1，2-双氧基化合物 过氧化草酸酯 萤火虫发光体系 细菌发光体系
3 酶免疫分析法
用酶标记抗原或抗体 例：酶联免疫法测定氯霉素 微量反应板——羊抗兔IgG抗体 兔抗氯霉素抗体+氯霉素酶结合物 +氯霉素样品 没有结合的酶结合物被洗去，再向相应孔中加入 过氧化氢和邻苯二胺，作用一定时间后，结合后的酶 结合物将无色的邻苯二胺转化为蓝色的产物，加入终 止液后颜色由蓝变黄，用波长450nm（双波长时最适 参考波长≥600nm）酶标仪进行检测，吸光值与样品 中氯霉素含量成反比。 酶不稳定、光度分析线性范围窄
免疫荧光层析法 化学发光
免疫荧光层析法化学发光免疫荧光层析法（Immunofluorescence Assay，简称IFA）和化学发光（Chemiluminescence）是两种常用的检测技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
本文将介绍这两种技术的原理、步骤和应用，以及它们之间的区别和优缺点。
免疫荧光层析法是一种利用抗体与特定抗原结合后可发出荧光信号的检测方法。
它的原理是将标记有荧光染料（如荧光素）的抗体与待检样品中的目标抗原结合，形成免疫复合物。
通过荧光显微镜观察，可以检测到目标抗原的存在与否。
这种方法具有高灵敏度、高特异性和无需放射性标记物的优点，被广泛应用于病原微生物的检测、抗体的定量和细胞蛋白的定位等研究领域。
化学发光是一种利用化学反应产生的光信号来检测目标物质的方法。
它的原理是将待检样品中的目标物与标记有化学发光底物的抗体结合，形成免疫复合物。
当加入特定的激发剂后，底物会发生化学反应，产生可见的光信号。
通过光电倍增管或摄像机的检测，可以定量地测量化学发光强度，从而判断目标物的含量。
化学发光方法具有高灵敏度、宽线性范围和较低的背景信号等优点，因此在临床诊断和生物工程领域得到广泛应用。
免疫荧光层析法和化学发光在实验步骤上存在一些差异。
免疫荧光层析法的步骤包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和显微镜观察等。
而化学发光的步骤则包括样品制备、抗体标记、免疫反应、洗涤和化学反应等。
两种方法的原理都是基于抗体与抗原的特异性结合，但在标记物和检测信号的产生上有所不同。
免疫荧光层析法和化学发光在应用上也存在一些差异。
免疫荧光层析法常用于检测细胞表面标记物、病原微生物和抗体等，广泛应用于免疫学研究和临床诊断。
而化学发光常用于检测肿瘤标志物、药物残留和基因表达等，被广泛应用于药物研发和生物工程领域。
两种方法在不同领域有着各自的优势和适用范围。
总的来说，免疫荧光层析法和化学发光是两种常用的生物分析技术，具有高灵敏度、高特异性和广泛应用的特点。
化学发光与免疫荧光方法学对比
化学发光与免疫荧光方法学对比一、《化学发光与免疫荧光方法学对比》1.概述化学发光（CL）和免疫荧光（IF）是用于检测特定病原体或病原体的特异性抗体的两种测定方法。
CL和IF之间的最显著差异是不同的技术原理，以及其具有不同的优势和劣势。
下面将比较这两种技术的方法学、特点和限制。
2.方法学对比化学发光和免疫荧光是两种完全不同的化学和物理技术。
（1）化学发光：CL技术使用放射性核素结合到抗体或含有特异性抗原的配体上，将其作为一种探针来检测特定目标物质。
检测物质特异性结合探针后，将其照射到发射波长范围的暗室，从而得到特定的发光细胞图像。
（2）免疫荧光：IF技术通过使用荧光标记抗体或特异性抗原，以可见光范围的荧光作为探针，检测特定的抗原或抗体。
被检测物质与荧光探针结合后，将其照射到可见光范围的暗室，从而得到特定的荧光细胞图像。
3.特点对比（1）CL技术可用于快速检测特定的物质：通过使用核素，可以迅速检测出特定的物质，这种技术不受受体或抗原的数量或特性影响。
（2）IF技术可以更简单、更灵敏地检测出特定物质：在IF技术中，荧光标记的抗体和抗原可以特异性地结合，使得能够更灵敏地检测出特定的物质，且不会受受体或抗原的数量或特性影响。
4.限制对比（1）CL技术存在一定的检测限制：CL技术受探针的数量的影响，抗原和抗体的结合特异性不强，因此无法准确检测受体或抗原的特定性。
（2）IF技术存在一定限度的检测效果：IF技术受荧光标记抗体和抗原的数量以及荧光强度的影响，因此无法准确检测受体或抗原的特定性。
综上所述，化学发光和免疫荧光有许多不同的方法学特点和限制，因此它们有不同的优势和劣势。
取决于检测病原体的要求，可以根据检测目标的特点，选择适合自己的技术来使用。
荧光分析与化学发光分析
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
Em En
图6-7 菲、蒽、苝的光谱图
图6-8 萘、菲、蒽、苝、 并四苯混合物的常规荧光 光谱及混合物的同步光谱 图
图6-9 工厂区大气 样品萃取物中强致癌 物苯并(α)芘及其共 存物的荧光光谱和同 步光谱
三、 荧光定量分析
1. 荧光强度与浓度的关系 荧光的发光是由于物质在吸光之后发射出波长较长的荧光，因此溶液的荧光强度 与该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。溶液被入射光(I0)激 发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光强度(F)。但由于激发光源能量的一部 分被透过，因此，在透射光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂 直的方向观测。 根据比耳定律，透过光的比例为 I -ε b C (6-1) - =10 I0 式中： I0为入射光(激发光)强度； I为透过光强度；C为浓度，b为液层厚度；ε 为摩尔吸光系数。 相应地被吸收的部分是 I -ε b C (6-2) 1- - =1-10 I0 将上式重新排列，可得被吸收的光的量为 -ε b C I0-I= I0 (1-10 ) (6-3)
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
化学发光与荧光免疫技术及仪器与分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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3．过碘酸盐氧化法
直接偶联
标记物可用发光剂或催化剂，适用于芳香伯胺或脂肪 伯胺发光剂，标记方法稳定标记物不易脱落，但此法不 适用于无糖基的蛋白质和含有糖基但氧化后会影响免疫 学活性的蛋白质。
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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4．戊二醛法
间接偶联
氨基 芳香伯胺基
2．眯唑类化合物 较常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉碱 (lophine)。
3．吖啶酯类 典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光泽精 (1ucigenin)。
4．苯酚类化合物 其中主要有邻苯三酚，即焦性没食子酸。 5．芳香草酸酯类 主要有双-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和 双-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。 6．(金刚烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物
熟悉电化学发光免疫分析的基本原理和标记物， 时间分辨荧光免疫分析法的基本原理及其标记物和螯 合物。
了解荧光偏振免疫分析法的基本原理和技术特点， 化学发光免疫分析的临床应用
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
3
第一节 化学发光免疫分析技术
基本原理 反应的底物 标记方法 反应类型 相关仪器
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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化学发光和荧光免疫技术及仪器和分析
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三、标记方法
按照标记物的应用:
化学标记 生物标记
化学标记: 用于化学发光(酶)免疫测定
➢直接用发光物质(如鲁米诺、吖啶酯类等)标记抗体或抗原
➢以催化剂(如HRP、GOD等)和／或协同因子(如ATP、 NAD等)标记抗体或抗原
反应速度
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
化学发光免疫分析与荧光免疫分析的差别
化学发光免疫分析与荧光免疫分析的差别
在体外诊断领域，化学发光免疫分析CLIA与免疫荧光分析IFA都是常⽤的检测⽅法，最终也都是以光度计进⾏检测，不过两者的原理是有本质区别的。
化学发光免疫分析相⽐于放射免疫、荧光免疫、酶联免疫，这种⽅法更有优势，它具有灵敏度⾼、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要⼗分昂贵的仪器设备等特点，⽽且⽆辐射、
标记物有效期长并可实现全⾃动化。
化学发光试剂吖啶酯
化学发光免疫与荧光免疫区别：
虽然两者都是发光反应，最直观的区别就是，化学发光是试剂⾃⾝发光，⽽荧光是⽤光源照射（通常是紫外线）后再发光。
两者的发光原理是不⼀样的，因此检测的结果也会产⽣差异。
化学发光是利⽤化学反应产⽣的能量促使产⽣能级跃迁，从⽽发光，典型的如鲁⽶诺检测⾎迹；荧光是⼀种光致发光现象，必须提供光源去激发分⼦产⽣能级跃迁，进⽽发光。
化学发光⽐荧光免疫⼲扰⼩：
使⽤这两种⽅法进⾏免疫分析时，区别很明显，化学发光⽆需外加光源，背景⼲扰⼩；⽽荧光则需要外加光源，在垂直光源的⽅向上检测，⽣物样品中的蛋⽩质、氨基酸等分⼦也会产⽣
背景荧光，背景稍⾼⼀些，需要选择合适的荧光试剂，以及样品处理⽅法以减少⾮特异性吸附
蛋⽩的影响。
直接法是每个抗原的抗体都要荧光标记，⽽且荧光标记后可能会影响抗体效价甚⾄失效。
间接法只要对相应的抗原做出相应的抗体，再⽤标记好的⼆抗结合上就⾏了，不⽤每个抗体都要
荧光标记，⽽且对⼀抗的效价影响甚微。
化学发光⼲扰很⼩，特异性⾮常⾼，整个⽅法的使⽤
受到化学分析本⾝不特异性的制约。
磁珠材料的发展使化学发光技术的发展越来越成熟。
(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应, 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原.由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质,并通过免疫应答排除抗原性异物,以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康.特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制,针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体,只能对同一种抗原发挥免疫功能.而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1。
1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答（免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上.1。
2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1。
3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团,它直接决定免疫学反映的特异性.抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。
荧光分析与化学发光分析
已知电子激发态的自旋多重性为2S+1，S是自 旋量子数的代数和。大多数分子含有偶数电子，在 基态时这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道 中。然而，根据保利不相容原理，在一个轨道上的 这两个电子的自旋是相反的，自旋量子数为+½(↑) 和-½(↓)。由于自旋成对的结果，大多数分子的自旋 量子数的代数和S=0，此时这个分子所处的电子能 态称为单重态(singlet state)，即2S+1=1。如果分子 中有一个未成对的电子，则S=½，而2S+1=2，此 种状态称为双重态(doublet state)。若分子中有两个 未成对的电子，此时S=1,2S+1=3，这种状态称为 三重态(triplet state)。
3. 化合物的荧光和化学结构的关系 产生荧光必须具备两个条件。首先，物质分子必须具有 能吸收紫外或可见光的生色基团；其次该物质应具有一定的 荧光效率。分子中能发射荧光的基团，称为荧光基团。荧光 基团一定是生色基团，但生色基团未必一定是荧光基团。这 是由于它的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂 分子或其他溶质分子之间的相互碰撞，因此不能发射荧光。 荧光效率(ΦF)又称为荧光量子产率，是荧光物质吸光后所 发射的荧光量子数与所吸收的激发光的量子数的比值，即
化学发光分析是利用化学发光现象进行分析测定 的一类方法。与荧光分析一样，属于发光分析的范 畴。化学发光与荧光分子的发光相似，他的大部分 性质和荧光相同，不同点在于荧光的激发能来自外 光源的激发(照射)，而化学发光的激发能则产生自 化学反应，也即某些物质在进行化学反应时，由于 吸收了反应时产生的化学能，使分子或原子被激发， 这种受激分子或原子返回基态时，以光辐射的方式 释放能量。其光辐射的能量及光谱范围由化学反应 的物质所控制(处于可见光区)。每一个化学反应都 有其特征的化学发射光谱，其发光强度则与物质的 浓度有关，这是化学发光分析的依据。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是现代生物医学研究和临床诊断中常用的分析方法。
这两种方法在原理和应用中有一些差异，但都具有高灵敏度、高选择性和高自动化程度的特点。
以下将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用和优缺点。
荧光免疫分析方法是基于荧光分子的发射特性进行分析的一种方法。
其原理是，通过标记抗体或抗原的荧光物质，使其具有荧光，并与待测物发生特异性的免疫反应。
然后，通过荧光测定仪器对免疫反应产生的荧光进行检测和分析。
荧光免疫法具有高灵敏度、高选择性、多样化的荧光标记物选择以及可通过多色荧光分析多个指标等特点。
因此在生物医学研究、肿瘤标志物筛查、病毒感染和免疫补体等方面具有广泛的应用。
荧光免疫分析方法主要分为直接荧光免疫分析和间接荧光免疫分析。
直接荧光免疫分析通过将荧光标记物直接结合到抗体或抗原上，实现荧光信号的检测和分析。
间接荧光免疫分析则是先将抗体与细胞或蛋白质结合，然后再用荧光标记的二级抗体结合到一级抗体上，以增强荧光信号。
这两种方法各有优缺点，可以根据具体需要选择使用。
化学发光免疫分析方法是基于化学发光反应进行分析的一种方法。
其原理是，在特定的化学反应条件下，荧光标记的抗体或抗原与待测物发生免疫反应，产生化学发光信号。
然后通过化学发光仪器对化学发光信号进行检测和分析。
化学发光免疫方法具有高灵敏度、快速、特异性高、背景干扰低等优点，因此在临床诊断和分子生物学研究中得到广泛应用。
化学发光免疫分析方法主要分为催化化学发光和基因工程发光两种类型。
催化化学发光是通过特定的酶促发光底物，在酶的作用下产生化学发光信号。
催化化学发光免疫分析方法常用于免疫分析和临床诊断。
基因工程发光则是通过将荧光基因植入生物体内，利用生物体自身的酶促发光反应产生化学发光信号。
基因工程发光免疫分析方法主要用于分子生物学研究领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在临床诊断和生物医学研究中具有广泛的应用。
它们可以用于检测血液中的肿瘤标志物、感染性疾病的病原体抗原和抗体、免疫系统功能等指标。
化学发光免疫分析法-自己整理
化学发光免疫分析法（CLIA）A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法：（竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比）、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B o值越小。
例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。
实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A（A-HRP在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITQ标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU，测定尿液中A的含量、仪器:Flash ' n glow LB955管全自动进样冷光分析仪（Berthold公司）; 高速离心机（Beckman公司）,转速13000 r/min磁性分离器（北京科美生物技术有限公司定制，磁场强度2800高斯） XW80旋涡混合器（上海精科实业有限公司）试管12 X 60 mm®江拱东医用塑料厂）磁性微粒子（磁性分离剂,Adaltis公司）三、试剂1、A标准品2、A单克隆抗体•0——AFBi-BSA^HRP *：F!TC H AFB I +^4}抗FITCEFITC庐合別比FITCr^t I--r i詩玩FITC AFB1 FrrOAFBt^JMI 时fTC旳舸更片单丸垮序汗士体-F：障羊舍和料TJ5H笛箭♦—厲FR1 AF61^■ —FITC(- 歼ITC一餅3、A-BSA吉合物4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL）5、F ITC标记的A单克隆抗体6 HRP标记的A7、P BST 洗涤液L PBS,含% Tween-20）8、分析缓冲液mol/L的PBS缓冲溶液,pH ,含%BSA %的水解明胶、％的Procli n-300）9、发光底物液（鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液）实验用水为二次蒸馏水四、试剂处理1、用分析缓冲液为稀释液，梯度稀释标准品；2、取A-BSA-HR溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释,配制1:1000、1:2000、1:5000的A-BSA-HRP溶液,4 C保存.FITC-A单克隆抗体溶液的配制：取FITC-A 单克隆抗体溶液，以分析缓冲液为稀释液，梯度稀释，配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000的FITC-A单克隆抗体溶液，4 C保存。
荧光和化学发光分析法
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A 跃迁的类型 n →π* εmax＜100 平均寿命10-5~10-7 s； π→π* εmax≥104 平均寿命10-7~10-8 s π*→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有π*→π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光。 2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系 荧光的产生是分子先经历π→π* 或n →π* 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生π* →π 或π* → n 而得到荧光。
光源
样品池
激发 单色器
检测器
数据处理 仪器控制
发射 单色器
斩波器（磷光镜）
利用荧光和磷光发射寿命的差别
通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。
2、定量方法
*
定量依据
定量分析方法
2.1.4 定量分析方法
*
1、定量依据 荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子产率Φ ： 由朗伯-比耳定律得： 荧光强度 If ：
外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。
02
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
2.1.1.1 荧光及其产生
*
（1）. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态各振动能级，发射时间约为10-7～10-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。 e 2、辐射跃迁
实验条件对荧光强度的影响
溶液黏度和温度 黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。 温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。
溶液的PH值 不同PH值下，荧光分子存在形式不同。
Cary Eclipse 荧光分光光度计
2.1.3 仪器装置
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法
化学发光免疫分析法（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是一种用于高
灵敏性和特异性检测抗原和抗体的分析方法。
它可以用于测定血清中和其他生物样品中的多种抗原和抗体，包括肿瘤抗原、抗生素和其他药物物质，也可用于研究免疫应答机制，因此在生物分析、临床诊断和科学研究中受到普遍的应用。
该分析法的原理是利用酶或其他生物分子介导的亲和免疫反应，一种特定的抗
原或抗体与抗原或抗体受体上的一种指定的抗体结合后，再加上一种特定的子细胞质因子，这种反应会产生化学发光。
由于这种反应发生的时间很短，后续过程不容易受到干扰，并且其发光参量也比一般的发光反应更高，因此检测结果具有高灵敏性和特异性。
CLIA结果的准确性和可靠性在生物分析的领域得到了认可，其快速、实用性、特异性和准确性为生物技术提供了更有力的保证。
它不仅普遍用于临床诊断，还可用于研究生物的抗原和抗体的交互作用，有助于更好地研究免疫应答机制和其他相关科学问题。
化学发光免疫分析方法.
为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶
免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，
通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为
1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～
122％之间。 Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免 疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间 ，检测灵敏度 为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及 10.0％。 农产品中样 品添加回收率在79.8％～115.4％之间。 同时， 将建立的分析方法与黄 曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为
菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。 且通过样品的
添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法
与 HPLC 方法有良好的相关性。
Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化
学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面 ， 然后将抗
方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮
过多症（PHA）进行快速筛选， Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支
持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双
夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方
面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方
种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度
快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要
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荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。
由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。
本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。
一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。
特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。
而对变异或其他抗原毫无作用。
1、抗原1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。
抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。
1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。
半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。
如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。
抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。
因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。
2、抗体2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。
2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。
人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。
3、抗原抗体的结合体外抗原抗体反应又称血清学反应第一阶段为抗原和抗体的特异性结合，需时短，几秒至几分钟，无可见现象出现。
第二阶段，可见反应阶段，表现为凝集、沉淀、细胞溶解等，时间较长，历时数分钟、数小时以致数天4、抗原抗体结合的特点（1）抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发生反应。
抗原与抗体两者为非共价键结合，为可逆反应（2）抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应；以沉淀反应为例，分子比例合适，沉淀物产生既快又多，体积大。
分子比例不合适，沉淀物产生少，体积小，或不产生沉淀物。
（3）特异性抗原和抗体有相对应的极性基，抗原和抗体的特异性结合，也就是这些极性基的相互吸附。
抗原和抗体结合后就由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响。
如有适当浓度的电解质存在，就会使它们失去一部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝聚或沉淀现象。
若无电解质存在，则不发生可见反应。
（4）合适的pH是抗原抗体反应必要的条件之一。
pH过高或过低可直接影响抗原和抗体的理化性质。
二、免疫分析1、定义免疫分析法利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。
2、分类非标记免疫分析技术：免疫扩散、免疫电泳标记的免疫分析技术：酶免疫分析、放射免疫分析、其它免疫分析法（荧光免疫技术、胶体金免疫技术、发光免疫技术和铁蛋白免疫技术等）3、免疫标记技术3.1基本原理：采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。
3.2主要类型：放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术三、荧光免疫分析(Fluorescence immunoassay, FIA)1、定义免疫荧光技术(FIA)是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。
FIA以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合，但不影响其免疫学特性。
然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。
2、分类传统的荧光免疫分析受到散射光、样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰，分析灵敏度较低。
在这个背景下，两种现代荧光免疫分析方法迅速发展。
荧光偏振免疫分析法就是其中之一。
它以其快速、精确和特异的优势很快便为人们广泛接受。
时间分辨荧光免疫分析是另一种现代荧光免疫分析技术。
2.1荧光偏振免疫分析方法(Fluorescence polarization immunoassay, FPIA)（1）基本原理FPIA是一种利用反应分子在反应体系中的旋转速度与分子大小呈反比的特点而对荧光标记抗原进行检测的技术，在免疫反应体系中抗原（相对为小分子物质）的旋转要比抗原-抗体复合物快，以荧光物质标记的抗原与待测样品中的抗原竞争结合特异性抗体，形成荧光抗原-抗体复合物，该复合物的旋转比单纯的荧光物标记抗原慢，当此时反应体系接受偏振光的照射，如荧光抗原分子的长轴与投入的偏振光面平行，那么荧光物质吸收的偏振光最多，分子呈激发态，回到基态时会发射出偏振荧光，而如果反应体系中的分子发生旋转，发射的偏振光就会减弱，减弱的程度与分子旋转的速度呈正比，与分子大小呈反比。
通常反应体系受垂直偏振光激发后，在与激发光呈适当角度处用第二个偏振器测量发射荧光强度，其偏振面既可垂直定位也可水平定位，在测定时样品中抗原浓度越低产生的荧光抗原-抗体复合物就越多，游离的荧光标记抗原越少，反之亦然，荧光抗原-抗体复合物越多，偏振光就越强。
根据荧光偏振的改变测定标本中抗原的浓度，偏振光的强度与样品中抗原的浓度呈反比，用已知浓度的样品制备标准曲线，未知浓度的样品则可通过与标准曲线比较得出分析结果与传统荧光分析相比，具有一些优点，如均相测量方案，易于快速进行，荧光标记物质半衰期长，结果准确等。
但是由于FPIA是针对相对分子质量的大小进行测量的，因此，对本身分子很大的物质不适合采用此方法。
（2）应用FPIA技术在很早时便有应用于抗生素（庆大霉素）和抗癫痫药（苯妥英钠）浓度测定的报道，人们也将之用于类固醇、儿茶酚胺、高半胱氨酸等物质的体内分．析。
尤其适用于血清中或尿中微量半抗原的测定。
FPIA也可用于中药和天然药物的检测领域等。
2.2时间分辨免疫分析方法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay, TRFIA)（1）基本原理TRFIA是用三价稀土离子及其鳌合剂代替荧光物质或者同位素作为示踪物，标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，待反应发生，如抗原抗体结合、生物素亲和素相互反应、核酸探针杂交反应等后，用具有时间分辨功能的时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。
目前用于TRFIA的三价稀土离子主要为镧系离子，其中铕离子最为常用。
免疫反应后形成的抗原-抗体-铕标记物复合物在弱碱性缓冲液中经激发光激发所发生的荧光信号甚弱，主要因为水是稀土离子产生荧光的淬灭剂，这时须加入一种含有β-二酮体(β-NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、Triton X-100、醋酸和邻苯二甲酸氢钾的酸性溶液（pH值2~3），使稀土离子从鳌合物中解离下来。
游离的三价铕离子在TOPO协同下，与β-二酮体形成一种新的鳌合物，非离子型的表面活性剂可以有效地将复合物形成大分子的微囊，微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的β-NTA；而其外层为亲水性基团，可以和水分子结合，这种微囊可最大限度地将能量传递给Eu3+，从而阻断了β-NTA吸收能量传递给水所产生的淬灭效应，使原来的荧光信号增强近100万倍，大大有利于荧光测量，因此我们也称之为“解离-增强的镧系荧光免疫分析”。
（2）特点荧光光谱独特：激发光光谱带宽，激发最大波长在300~500nm，有利于增高激发能，提高标记物的比活性；发射光光谱带很窄，甚至不到10nm，有利于降低本底，提高分辨率；Stokes位移大：可以达到250~350nm，最大程度地排除了非特异性荧光背景的干扰；荧光寿命长：一般镧系元素鳌合物的荧光衰变时间为60~900μs；因此，延迟测量时间，待背景荧光完全衰减后测定，所测得的便是标记物的特异性荧光，从而消除了蛋白质背景荧光的干扰；稀土元素标记物体积小：为原子标记，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，既保证了被检测物质的稳定性，又可实现多位点标记，标记物稳定，可以保存1~2年，克服了同位素以及酶标等不稳定的缺点。
（3）应用TRFIA多应用于临床以及免疫、生物分析领域。
但是，随着近些年来生物药物的广泛开发，一些细胞因子、激素、功能性蛋白质均成为药物研制的热点，而TRFIA 凭借其独有的特点，在药物分析中的应用也逐渐增多起来。
四、化学发光免疫分析1、定义化学发光免疫分析(Chemi-luminescence immunoassay, CLIA)是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。
化学发光（Chemi-luminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反)发光剂(现象。
某些物质．应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
2、分类2.1直接化学发光免疫分析 (Direct chemical luminescence immunoassay, DCLIA)基本原理：用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。
2.2化学发光酶免疫分析 (Chemi-luminescence enzyme immunoassay, CLEIA）。