细胞凋亡的流式细胞术检测精品PPT课件
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5.炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症 反应
主动过程，有新蛋白合成， 耗能
胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩，核固缩
溶酶体相对完整，局部 无炎症反应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp）， 电泳呈“梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ü 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变
小，SSC增大 ü 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ü 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、
SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变 小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 2.1 PI单染检测 Ø 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 Ø 2.3 细胞内钙离子测定 Ø 2.4 线粒体膜电位检测 Ø 2.5 Caspases细胞酶的检测 Ø 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU Ø 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
ü 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此 时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
ü PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整 性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的 完整性已经丧失， Annexin V可以进入到细胞浆内，与位 于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈 现绿色荧光。
ü 此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7AAD )双染色是检测早期凋亡 细胞的敏感方法。
不开的最基本生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数 目，清除衰老、过剩、有害的细胞。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
Ø 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞 脱离，细胞质中线粒体大体完整，染色质固缩；
Ø 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细 胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
ü Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ü Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本
相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ü Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进
入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4 随后会和钙离子结合并发出荧光。
2.1 PI单染检测
ü 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。
ü 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序 降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经 乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的 DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方 图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
ü 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所 占的比率。
ü PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可 以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较
ü 该法简便、标本制备容易、检测费用低
ü 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰 相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现 ，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其 他方法进行检测
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2 细胞凋亡的流式检测方法
3 流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
Ø 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀 现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的 程序，自我结束生命的死亡方式。
Ø 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) Ø 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离
ü 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
ü Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后 经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当 Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以 上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成 正比。
Ø 凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等 的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜 所包围； Ø 凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
1.2 细胞坏死
Ø 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的 反应。
Ø 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 Ø 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
ü 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下， PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并 暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
ü Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V， 就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨 酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
2.4 线粒体膜电位检测
ü JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
ü 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中， 形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞
细胞凋亡与细胞坏死的区别
——————坏死—————————凋—亡———
———————————————————
1.性质
病理Hale Waihona Puke Baidu，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成， 不耗能
4.形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀
主动过程，有新蛋白合成， 耗能
胞膜及细胞器相对完整 细胞皱缩，核固缩
溶酶体相对完整，局部 无炎症反应
6.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈均一 DNA片状
7.凋亡小体
无
8.基因调控
无
DNA片段化（180-200bp）， 电泳呈“梯”状条带
有
有
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 利用流式仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析 ü 凋亡早期细胞因体积减小，胞浆及染色质固缩，FSC变
小，SSC增大 ü 凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小 ü 坏死细胞则因细胞膜通透性改变，细胞肿胀，FSC、
SSC变大，胞膜破裂，胞内含物释出后FSC、SSC均变 小。
2 细胞凋亡的流式检测方法
Ø 2.1 PI单染检测 Ø 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 Ø 2.3 细胞内钙离子测定 Ø 2.4 线粒体膜电位检测 Ø 2.5 Caspases细胞酶的检测 Ø 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU Ø 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53
ü 线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此 时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光……凋亡细胞
ü PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整 性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的 完整性已经丧失， Annexin V可以进入到细胞浆内，与位 于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈 现绿色荧光。
ü 此法简单、可靠，由于凋亡时 细胞膜的改变大大早于DNA 的 改变，因此Annexin V/PI(或7AAD )双染色是检测早期凋亡 细胞的敏感方法。
不开的最基本生物现象，通过凋亡可以平衡机体内细胞的数 目，清除衰老、过剩、有害的细胞。
与细胞凋亡有关的疾病
细胞凋亡的形态特征
Ø 凋亡的起始：微绒毛消失，细胞间接触消失，与周围细胞 脱离，细胞质中线粒体大体完整，染色质固缩；
Ø 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细 胞色素C到胞浆，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面；
ü Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 ü Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本
相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 ü Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进
入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4 随后会和钙离子结合并发出荧光。
2.1 PI单染检测
ü 与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来 同时判定细胞周期和凋亡。
ü 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序 降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经 乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的 DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方 图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰
ü 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所 占的比率。
ü PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可 以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较
ü 该法简便、标本制备容易、检测费用低
ü 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰 相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现 ，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其 他方法进行检测
目录
1
细胞凋亡与细胞坏死
2 细胞凋亡的流式检测方法
3 流式检测细胞凋亡面临的问题
1.1 细胞凋亡
Ø 细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀 现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的 程序，自我结束生命的死亡方式。
Ø 程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) Ø 细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样，是机体生存和发育离
ü 由于该法必须用活细胞，因此 检测时间受到限制，且对凋亡 晚期细胞和坏死细胞无法准确 区分。
2.3 细胞内钙离子测定
ü Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后 经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当 Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以 上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成 正比。
Ø 凋亡小体的形成。核膜核仁破碎，核染色质断裂为大小不等 的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞膜 所包围； Ø 凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
1.2 细胞坏死
Ø 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后出现的 反应。
Ø 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 Ø 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。
2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测
ü 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下， PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并 暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。
ü Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V， 就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨 酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。
2.4 线粒体膜电位检测
ü JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential) ΔΨm 的理想荧光探针。
ü 线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中， 形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光……正常细胞
细胞凋亡与细胞坏死的区别
——————坏死—————————凋—亡———
———————————————————
1.性质
病理Hale Waihona Puke Baidu，非特异性
生理性或病理性，特异性
2.诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
3.生化特点 被动过程，无新蛋白合成， 不耗能
4.形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、 细胞肿胀