杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白
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(2)将谷胱甘肽转移酶基因（GST）导入外源基因前端，利用 GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白。
(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。
Bac–to–Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
3 ：主要操作流程
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备 转化DH10Bactem.coli
37℃培养过夜。 ❖ 7.保种，提重组质粒
重组病毒的提取(试剂盒）
❖ 1 用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min， 弃上清。
❖ 2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。
❖ 3 加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放 置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
❖ 4 加入300 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此 时会出现白色絮状沉淀。
❖ 5 12,000 rpm 室温离心15min，收集上清。 ❖ 6 加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。 ❖ 7 12,000 rpm 室温，离心15 min，弃上清。 ❖ 8 加入800ul buffer w2洗涤, 12,000 rpm 室温离心1min，
❖ 5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； ❖ 6.加10ml 0.1M MgSO4重悬菌体，冰浴20min； ❖ 7．4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； ❖ 8. 加10ml 0.1M CaCl2+15%甘油，重悬； ❖ 9.200μl每管分装至1.5ml tube管（-80℃预冷），-80℃保
证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 ❖ 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下
插入要表达的外源基因。 ❖ 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA
序列，用于与野生病毒DNA同源重组。
直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困 难，为纯化常采用下列方法：
(1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni 柱进行亲和层析纯化。
❖ 杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20 世纪80 年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因 工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳 动物细胞表达系统)之一 。
❖ 杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒 （Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV ）表达系统和家蚕核型多 角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus, BmNPV ）表达系统。
提取重组病毒 Sf9细胞转染，复制重组病毒
生产重组蛋白
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备
❖ 1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 50mg/ml卡那霉素（kan）和6μl l5mg/ml四环素(tet)混匀；
❖ 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 37℃,200rpm培养14-16h；
Bac-to-Bac杆状病毒 表达载体系统生产重 组蛋白
蛋白组 吴召慧 21Байду номын сангаас-5-10
主要内容：
❖ 1.杆状病毒表达载体系统简介 ❖ 2.基本原理 ❖ 3.主要操作流程
1：杆状病毒表达载体系统简介
❖ 杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状 病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一 个重组蛋白生产系统 。
缺点 ❖ 瞬时表达 ❖ 糖基化简单
2：基本原理
❖ 1：目的基因插入转移载体。 ❖ 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯
化获得重组病毒。
❖ 3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。
❖ 4：纯化目的蛋白
杆状病毒表达载体的构建
❖ 转移载体 通常由三部分组成： ❖ E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保
❖ 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和 非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒 亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属 （GV）
杆状病毒表达系统的优缺点
优点 ❖ 对外源基因容量大 ❖ 适合表达细胞毒性蛋白 ❖ 安全性且表达产量高 ❖ 后加工过程完全 ❖ 可以同时表达多个外源基因 ❖ 体内表达
存。
转化DH10BACTME.coli
❖ 1.冰上融化DH10BACTM E.coli感受态细胞（约5min）； ❖ 2.取1ng pFastbac-重组质粒至DH10BACTM E.coli感受态
细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min； ❖ 3.42℃热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min； ❖ 4.加800μl室温预热的LB培养基，37℃,220rpm，4h； ❖ 5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）, ❖ 6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上），
b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM- III SFM培养基，混匀；
❖ 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 新鲜LB液体培养基【加100μl kan（50mg/ml）和200μl tet （5mg/ml四环素）】，37℃,220rpm，约2h，至OD=0.40.6；
❖ 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇 动一次，同时冰浴上0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%甘油；
弃滤液。重复洗涤一次。 ❖ 9 室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解
10min ，4℃保存。
Sf9细胞转染
❖ 1．37℃预热Sf900TM- III SFM培养基； ❖ 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TMIII SFM培养基；
(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达，该蛋白与生物素 具有非常高的结合能力，可以对表达产物进行纯化。
Bac–to–Bac系统重组病毒的构建和基因的表达
3 ：主要操作流程
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备 转化DH10Bactem.coli
37℃培养过夜。 ❖ 7.保种，提重组质粒
重组病毒的提取(试剂盒）
❖ 1 用1.5 ml离心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm离心1min， 弃上清。
❖ 2 加入250 μl溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮。室温静置1- 2min。
❖ 3 加入250 μl溶液Ⅱ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放 置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
❖ 4 加入300 μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此 时会出现白色絮状沉淀。
❖ 5 12,000 rpm 室温离心15min，收集上清。 ❖ 6 加入800ul异丙醇，混匀至有沉淀出现。 ❖ 7 12,000 rpm 室温，离心15 min，弃上清。 ❖ 8 加入800ul buffer w2洗涤, 12,000 rpm 室温离心1min，
❖ 5.细菌液4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； ❖ 6.加10ml 0.1M MgSO4重悬菌体，冰浴20min； ❖ 7．4℃，4500rpm，离心5min，弃上清； ❖ 8. 加10ml 0.1M CaCl2+15%甘油，重悬； ❖ 9.200μl每管分装至1.5ml tube管（-80℃预冷），-80℃保
证转移载体能在大肠杆菌中扩增。 ❖ 含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子，在该启动子下
插入要表达的外源基因。 ❖ 启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA
序列，用于与野生病毒DNA同源重组。
直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困 难，为纯化常采用下列方法：
(1)在外源基因的前端插入6×His，表达的融合蛋白可通过Ni 柱进行亲和层析纯化。
❖ 杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20 世纪80 年代真核表达研究领域的一个重大进展，现已成为基因 工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳 动物细胞表达系统)之一 。
❖ 杆状病毒表达载体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒 （Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus， AcMNPV ）表达系统和家蚕核型多 角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosisi virus, BmNPV ）表达系统。
提取重组病毒 Sf9细胞转染，复制重组病毒
生产重组蛋白
DH10Bactem.coli感受态细胞的制备
❖ 1.取3mlLB液体培养基至15ml无菌离心管，加入3μl 50mg/ml卡那霉素（kan）和6μl l5mg/ml四环素(tet)混匀；
❖ 2.接种DH10BACTME.coli菌种至上述LB培养基中， 37℃,200rpm培养14-16h；
Bac-to-Bac杆状病毒 表达载体系统生产重 组蛋白
蛋白组 吴召慧 21Байду номын сангаас-5-10
主要内容：
❖ 1.杆状病毒表达载体系统简介 ❖ 2.基本原理 ❖ 3.主要操作流程
1：杆状病毒表达载体系统简介
❖ 杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system，BEVS）是利用携带有外源目的基因的重组杆状 病毒作载体，在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一 个重组蛋白生产系统 。
缺点 ❖ 瞬时表达 ❖ 糖基化简单
2：基本原理
❖ 1：目的基因插入转移载体。 ❖ 2：目的基因转移到病毒基因组靶位点，空斑纯
化获得重组病毒。
❖ 3：重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫。
❖ 4：纯化目的蛋白
杆状病毒表达载体的构建
❖ 转移载体 通常由三部分组成： ❖ E. coli质粒的复制原点和抗生素抗性基因（如Ampr），保
❖ 杆状病毒科分为包含体病毒亚科（Eubaculovirinae）和 非包含体病毒亚科（Nudibaculovirinae），包含体病毒 亚科分为核型多角体病毒属（NPV）和颗粒体病毒属 （GV）
杆状病毒表达系统的优缺点
优点 ❖ 对外源基因容量大 ❖ 适合表达细胞毒性蛋白 ❖ 安全性且表达产量高 ❖ 后加工过程完全 ❖ 可以同时表达多个外源基因 ❖ 体内表达
存。
转化DH10BACTME.coli
❖ 1.冰上融化DH10BACTM E.coli感受态细胞（约5min）； ❖ 2.取1ng pFastbac-重组质粒至DH10BACTM E.coli感受态
细胞轻弹两下混匀，冰上静置30min； ❖ 3.42℃热击45秒；立即转移至冰上冰浴2min； ❖ 4.加800μl室温预热的LB培养基，37℃,220rpm，4h； ❖ 5.涂布至LB琼脂平板（含Kan,Tet,Gen）, ❖ 6.挑取白色菌落接种至5mLLB液体培养基（抗生素如上），
b．转染试剂充分摇匀后取8μl加入100μl Sf900TM- III SFM培养基，混匀；
❖ 3.按1:100取1ml过夜培养的DH10BACTME.coli菌液至100ml 新鲜LB液体培养基【加100μl kan（50mg/ml）和200μl tet （5mg/ml四环素）】，37℃,220rpm，约2h，至OD=0.40.6；
❖ 4.上述细菌液转移至50ml无菌离心管,冰浴20min，每5min摇 动一次，同时冰浴上0.1M MgSO4,0.1 M CaCl2+15%甘油；
弃滤液。重复洗涤一次。 ❖ 9 室温或风干DNA，加入50-80ulEluent溶液，冰上溶解
10min ，4℃保存。
Sf9细胞转染
❖ 1．37℃预热Sf900TM- III SFM培养基； ❖ 2.准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：
a．溶解5μl纯化的杆状病毒重组质粒于100μl Sf900TMIII SFM培养基；