《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》(2021)要点汇总
《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》（2021）要点
感染性疾病一直备受临床关注。新型冠状病毒肺炎全球大流行，给世界经济和人类健康带来严峻挑战，更让病原的精准快速检测成为关注的热点。近年来，因物价、政策等方面的灵活性，独立实验室已广泛开展基于高通量测序（也称新一代测序技术，
NGS）的病原学检测实验。NGS技术应用的成功案例，对部分感染性疾病的病原学诊断起到决定性作用。然而目前，临床对NGS应用的适应证认识不足，送检存在较大的盲目性和随意性；操作过程复杂，缺乏规范；提供检验的主体多元而检测质量良莠不齐；结果解释缺乏可信的标准，误导临床的案例屡见不鲜，限制了该技术的临床应用和普及。
一、共识制定过程
二、分类和术语
（一）分类
宏基因组高通量测序技术（mNGS）通过对临床样本的DNA或RNA 进行鸟枪法测序，可以无偏倚地检测多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）。二代和三代测序平台均可用于该项技术。按从临床样本中提取的核酸类型可以分为宏基因组测序和宏转录组测序。按照测序模式可以分为单端测序和双端测序。
（二）术语和定义
NGS：
也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。
mNGS：m指宏基因组，也称元基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。诊断宏基因组学：指用于临床诊断目的的宏基因组学。
临床宏基因组学：
含义与诊断宏基因组学类似，但应用场景更为广泛。
微生物组：
指某一个系统、生态环境或特定区域中全部微生物的总和。
试剂盒基因组：
游离脱氧核糖核酸（cfDNA）：
读长：
文库：
比对：
深度：
覆盖率：
相对丰度：
Q值：
标定对照：
无模板对照：
检出限（LOD）：
正常无菌部位：
三、mNGS技术应用于感染性疾病的适应证
（一）临床适应证
共识1对常规微生物学检查容易明确病原体的感染，如尿路感染通过尿培养手段，不建议mNGS。
共识2患者表现为发热或发热症候群，病因未明确（符合不明原因发热定义），考虑感染或不除外感染，但规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。
共识3各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，或考虑继发或并发危及生命的严重感染，建议常规检测的同时，或在常规检测基础上，开展mNGS。
共识4免疫受损患者疑似继发感染，常规病原学检查未能明确致病原或/和规范性经验抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。
共识5疑似局部感染，病原学诊断未明确、不及时处理则后果严重（危及生命或会导致局部功能不可逆性丧失）时，考虑常规检测的同时，或在其基础上，开展
mNGS。如眼部（角膜炎/溃疡、眼内炎、急性视网膜坏死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外伤累及深部组织等情况。
共识6高度疑似感染性疾病，但病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测、处理原发感染灶（如拔去导管、外科引流或拔去引流管、玻璃体切除）、调整经验抗微生物治疗
方案的同时开展mNGS。
共识7慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者临床表现相似、难以鉴别时，病情严重或抗感染治疗疗效不佳需要明确病因，建议在完善常规检测、调整经验治疗的同时开展mNGS。
共识8除以上共识2～7之外的患者人群，不建议无条件普遍进行mNGS检测；进行mNGS检测前请感染病学和/或临床微生物学专家会诊。
共识9不建议应用mNGS技术评估抗感染治疗效果。
（二）微生物学适应证
共识10针对微生物，考虑出现疑似新发病原体，或某特殊病原体，缺乏传统技术或传统技术手段不能确定种属时，建议常规检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。
共识11临床表现高度怀疑感染性疾病而多种传统技术反复检测不能明确致病微生物，但仍高度怀疑微生物所致，建议继续完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。
共识12传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，建议进一步完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。
共识13感染性疾病的病原体已明确或高度怀疑某病原体，临床表现提示该病原体可能具有特殊的毒力表型，需要了解其毒力因子的相关信息时，可以考虑对感染相应临床标本进行mNGS物种鉴定的同时，采用mNGS检测毒力基因。
（三）耐药学适应证
共识14感染发生在正常有微生物定植的部位，或检测标本采集有污染时（如支气管肺泡灌洗液），不建议采用mNGS进行耐药性检测。共识15感染发生在正常无微生物定植的部位且标本采集过程污染概率低时，可以考虑采用mNGS进行物种鉴定的同时检测耐药基因，并通耐药表型试验对耐药基因进行验证。对有菌种特异性的耐药性基因，在测序深度足够时，可以考虑应用
mNGS
检测获得性的耐药基因，预测耐药表型。
（四）流行病学和感染控制学适应证
共识16出现某种疾病的聚集性发病或暴发，怀疑是微生物导致的感染性疾病但病原不明，且常规快速检测无结果时，建议完善常规检测的同时或在其基础上开展mNGS明确致病微生物。
共识17感染性疾病患者有特殊区域（如北美地区有某些致病性真菌）旅居史，或有特殊职业工作史（如畜牧业、屠宰业、水产业等），感染病原未明，建议常规手段检测的同时开展mNGS。
四、mNGS的基本流程和管理要求
（一）标本采集
共识18从正常无菌部位采集mNGS检测标本，应严格无菌操作，避免污染；从有菌定植或污染部位采集的标本，应采取必要措施，尽量减少污染；用于宏基因组RNA测序的标本，应添加核酸稳定剂。mNGS 标本的运送须防污染、防震荡、冷链快速运送；标本如不能及时检测，
应保存于低于-70
冰箱或液氮（血液标本应分离血浆后保存）。建议的常用临床标本采集要求和相关说明见表1。
（二）DNA/RNA提取
共识19建议实验室的核酸提取流程、病原体核酸提取试剂盒应经过验证；高宿主背景标本提取时应采用经过验证的方法去除宿主细胞或核酸；整个提取过程必须有防污染措施，包括阴性对照和阳性对照等。（三）建库和测序
共识20建议采用经过验证的流程进行建库和测序；建库慎用各种扩增方法，因为扩增会使正常菌群或污染病原体的序列扩大，难以判断真正病原体；测序原始数据应进行质控，并且过滤掉低复杂度、低质量的序列，确保测序原始数据的质量。
（四）生物信息学分析
共识21建议生物信息学分析流程应进行性能确认和验证，包括数据库的优化、比对方法和比对参数的优化等，确保准确报告致病病原体。
五、mNGS应用于感染性疾病病原诊断的质量管理保证
（一）特殊病原体的DNA/RNA提取技术要求
共识22建议病毒核酸提取应保证病毒核酸的完整性；对于细胞壁较厚的病原体应采取常规方法以外的破壁方法。
（二）标本采集、DNA/RNA提取、建库引入的实验室污染问题
共识23污染既包括标本采集、核酸提取、建库测序引入的污染，也包括生物信息学分析引入的污染；建议实验室自建有效的防污染策略，
包括使用背景微生物库的方法。
（三）测序深度对结果的影响
共识24建议实验室验证不同标本、不同感染类型病原体检测所需的测序深度。
（四）生物信息学分析结果中疑似背景微生物对病原诊断结果的影响共识25建议实验室建立自己的背景微生物数据库以控制假阳性结果。（五）病原诊断阈值的设定
共识26考虑建立mNGS的诊断阈值以排除背景微生物的干扰、改善检测结果的准确性。
（六）数据库对病原学诊断结果的影响
共识27建议实验室验证自建的数据库中物种的准确性，过滤数据库错误和不正确的序列，并定期更新数据库。实验室应尽最大可能完善病毒、真菌和寄生虫数据库，提高鉴定的敏感性和准确性。
六、mNGS应用于感染性疾病病原诊断的性能验证和标准化
共识28对mNGS整个检测和分析流程进行性能验证是其应用于临床的瓶颈，建议对感染性疾病常见的“代表性”物种进行检出限、包容性、抗干扰、精密度、携带和交叉污染、稳定性等的验证。
七、mNGS应用于感染性疾病的报告解读
共识29解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、Q30等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。
共识30
mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。
共识31血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。
共识32
mNGS报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。
共识33建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR或一代测序等分子生物学检测，G试验，GM试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。
共识34采用
mNGS进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对
mNGS测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上。
共识35mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。
共识36mNGS结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑mNGS检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案。
共识37
建立mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。
共识38不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫真菌细菌病毒），核酸提取效率存在差异［难易程度：病毒/span革兰阴性菌/span革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）/span真菌］，致病力也相去甚远，因此不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。
共识
39
mNGS病原微生物检测结果，建议由具有一定生物信息学知识，并从事临床感染或临床微生物等专业人员，结合患者临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果，综合判断。不加以正确解读与甄别，盲目依据mNGS报告开展治疗，必将导致抗微生物药物的滥用。
综上，本文对mNGS技术应用于感染性疾病病原检测的质量管理进行了推荐，并给出了推荐强度。因为该技术可对部分病例的病原诊断产生决定性影响，现实中又存在种种问题，所以需要确保该技术的检验质量，并需要进行持续性评估。
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宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识
宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识 感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下，脓毒症(严重感染)患者病死率高达50%[1-3]。最新调查研究发现，中国脓毒症相关性标化死亡率为66.7例/10万人口，全国每年共有脓毒症相关性死亡病例近103万例[3]。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。 传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。因操作简单、快速、技术要求不高，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍在临床上广泛使用。但传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。 基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，且无需特异性扩增[4-8]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。 为了规范运用mNGS进行病原微生物的诊断、正确解读检测结果和指导治疗，我们组织了急危重病、感染病学和病原微生物学相关领域的专家，制定了本共识。 1 mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向 新一代测序技术是一个开放的分析和诊断系统，目前已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。 自2008年成功应用于临床诊断新发病原体感染以来[9-10]，目前mNGS技术已经逐步用于临床疑难感染诊断，如华山医院张文宏团队[11]用mNGS协助确诊猪疱疹病毒的跨物种传播，并给予针对性治疗使患者痊愈，深圳市第三人民医院用mNGS确诊了一例罕见阿米巴脑炎[11-12]。 mNGS对脓毒症、免疫抑制宿主并发严重感染、重症肺部感染等疾病具有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体；另外对于抗菌药物治疗方案的制定和治疗效果的评估具有一定的指导作用[9-16]。Long等[17]研究发现血培养联合mNGS诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高。以健康人群为基线，建立每种微生物在正常人群中的分布情况模型，进而计算脓毒症指数来评估检出微生物的核酸数量，Crumaz等[18]发现在脓毒症患者血液标本中病原菌的脓毒症指数绝对值、丰度显著升高，而且其变化与临床治疗效
高通量测序技术在临床感染性疾病实验室诊断中的应用
高通量测序技术在临床感染性疾病实验室诊断中的应用【摘要】随着测序技术的不断进步，高通量测序技术在临床实验室中受到越来越多的关注，其在感染性疾病的诊断和治疗中有着重要价值。与传统的微生物实验室诊断手段相比，高通量测序技术在对复杂和混合感染的诊断、敏感性、准确性、检测时间等方面均显现出优势。然而，该技术在检测规范、成本、报告解读等方面还有一些问题亟待解决，在感染诊断的临床应用中仍存在许多挑战。近年来，在国家政策的支持与规范下，测序行业持续健康发展，其应用市场也逐渐走向成熟；同时，国内外微生物专家努力推动相关共识及标准的形成，医院也在提高实验室测序相关仪器以及人员和知识储备，以促进高通量测序技术的临床应用，充分利用其优势，使其更好地服务于临床诊疗。本文主要从高通量测序技术在临床微生物感染性疾病实验室诊断中的应用现状以及政策体系支持及发展方向等方面进行阐述。 微生物感染性疾病具有较高的发病率，不能及时诊断、治疗会带来严重的后果，是导致人类死亡的重要原因。感染性疾病实验室检测能够及时准确地为临床提供客观的医学数据，对临床病情的诊断以及针对性治疗方案的确定有着积极意义，是各级医疗机构控制感染不可或缺的检测项目。传统的感染性疾病实验室检测方法，如炎性标志物和细菌分离培养在解决临床问题方面尚存在局限性。高通量测序技术可直接获取样本中的物种基因信息，实现微生物的鉴定，已经逐渐从科研走向临床应用，成为临床微生物实验室诊断的重要手段。 01、临床微生物感染性疾病实验室诊断 1. 临床微生物感染性疾病实验室诊断的重要性实验室诊断是临床感染性疾病诊断最直接、最客观的证据之一。常规感染性
疾病实验室诊断可分为感染相关标志物检测和病原体检测两大类。人体感染病原微生物后，由于免疫系统应答会出现一系列生理和病理反应，继而产生与感染相关的特异性生物标志物改变。 通过检测感染特异性生物标志物可帮助临床医师进行感染性疾病的诊断或鉴别诊断、指导药物使用、评估病程进展和判断预后。因此，感染相关生物标志物的实验室诊断既是感染诊断的重要依据，也是治疗指导、预后评价与随访的重要参考。微生物培养结果是感染性疾病实验室诊断的金标准，既是感染明确诊断的唯一方法，也是感染用药指导的直接依据，因此在感染性疾病诊断中具有不可替代的地位。 2. 临床微生物感染性疾病实验室诊断方法及问题感染相关生物标志物可反映感染早期免疫反应和炎性反应，因此被作为感染性疾病早期诊断及预后监测的一个重要依据。常用的感染相关生物标志物包括C反应蛋白/超敏C反应蛋白、降钙素原、血清沉淀样蛋白A等，具有灵敏性高、可有效鉴别细菌性感染和病毒性感染的特点。随着对炎症生物标志物研究的不断进展，新的标志物被广泛提出，如：白细胞介素-6、干扰素γ、肿瘤坏死因子-α等，大大提高了对感染性疾病实验室诊断的特异性及检出率。例如，白细胞介素-6作为急性感染早期诊断、感染严重程度评价和预后检测的重要指标已被写入《感染相关生物标志物临床意义解读专家共识（2017）》中。 但由于这些指标的非特异性（如C反应蛋白除提示炎症外，还与心血管疾病相关）以及在感染过程中的波动性，对于感染性疾病的鉴别诊断提出较大的挑战。共识也指出，没有绝对灵敏又绝对特异的生物标志物，多指标的联合检测能更早、更准确地对疾病进行诊断或鉴别诊断，降低疾病误诊率。传统病原体检测的
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识
高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专 家共识 引言 高通量宏基因组测序技术是一种快速、灵敏、高通量的新 一代测序技术，它能够同时检测多个样本中的病原微生物，并提供详细的遗传信息。随着相关技术的不断创新和发展，高通量宏基因组测序技术已经在临床微生物学的研究和诊断中取得了显著的突破。为了规范和促进该技术在临床应用中的使用，研究人员、临床医生和相关专家共同制定了本文档，旨在提供高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识。 背景 病原微生物的检测对于诊断和治疗临床感染疾病非常重要。传统的微生物学检测方法存在一定的局限性，如无法同时检测多个病原微生物，检测结果需要较长时间等。而高通量宏基因组测序技术可以通过同时测定多个DNA或RNA样本中的微 生物基因组序列，快速、准确地鉴定和定量病原微生物，并提供详细的遗传信息。
技术原理 高通量宏基因组测序技术主要包括DNA或RNA的提取、文库构建、测序和数据分析等步骤。首先，从临床样本中提取DNA或RNA，并使用特定的引物扩增目标基因组或全基因组序列。然后，将扩增的DNA或RNA文库构建成测序文库，经过高通量测序仪进行测序。最后，通过数据分析得到鉴定和定量病原微生物的结果。 临床应用 1. 临床诊断 高通量宏基因组测序技术可以快速鉴定病原微生物，并提供详细的遗传信息，对于临床感染疾病的诊断非常有价值。通过该技术，可以检测多种微生物，包括细菌、真菌和病毒等，为临床医生提供准确的诊断依据。 2. 菌群分析 高通量宏基因组测序技术可以对人体菌群进行深入研究。通过测序分析，可以了解人体内各种微生物的组成和数量，对于研究肠道菌群与人体健康之间的关系非常重要。
宏基因组高通量测序技术在革兰阴性菌耐药表型检测中的研究进展
宏基因组高通量测序技术在革兰阴性菌耐药表型检测中的研究 进展 摘要 耐药细菌感染的不断蔓延对公共卫生安全构成重要威胁，早期诊断和目标治疗是治疗成功的关键。传统细菌培养及药物敏感性检测耗时长、敏感性不高，无法满足临床诊治需求，高通量测序等分子检测技术成为新的发展方向。本文对近年来有关高通量测序在革兰阴性菌耐药诊治中的进展做一综述。 细菌耐药现象日益常见且已成为全球公共卫生安全最大威胁之一［1］。临床实践过程中，广泛耐药革兰阴性菌（extensively drug resistant Gram-negative bacilli，XDR-GNB）作为院内常见复杂耐药菌受到关注，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药现象尤为严重，已出现对所有抗菌药物耐药的超级菌种［2, 3, 4, 5, 6］。感染性疾病的精准治疗成为临床迫切要求。目前传统的细菌检测手段普遍存在耗时长、敏感性不高等不足，经验性使用广谱抗菌药物是初始抗感染治疗的常用方案。经验性抗感染治疗常导致药物的不恰当使用，不仅延误治疗，也会加重耐药现象。传统细菌及其耐药检测手段已无法满足现今医疗需求，寻找新的快捷、简便检测手段成为了迫切需求，分子检测手段就此进入舞台［7, 8］。 一、常见耐药检测方法 抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）检测目前主要包括细菌耐药表型检测及细菌耐药基因分子检测。耐药表型检测技术主要为传统的抗微生物药物敏感性试验（drug susceptibility testing，DST）。DST是体外定性或定量测定抗菌药物抑制或杀灭细菌能力的实验。其常见方法包括稀释法（包括琼脂稀释法和肉汤稀释法）、纸片扩散法、梯度扩散法和自动化仪器法。细菌耐药基因分子检测技术是通过检测存在的耐药基因来推断耐药表型的方法，包括多重PCR检测及高通量测序检测。高通量测序（nextgeneration sequencing，NGS）是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子
宏基因检测结果简要解读
宏基因检测结果简要解读 病原学的精准诊断对于感染性疾病的诊断和治疗具有重要意义。传统的病原学诊断高度依赖于临床医师的经验，通常根据患者的临床表现做出病原体的鉴别诊断，针对可疑的病原体进行检测，逐一排查；因传统检测方法的局限性往往无法兼顾罕见致病病原体和混合感染等情况，而宏基因组第二代测序(metagenomics next generation sequencing，简称mNGS)技术可以快速、无偏倚地同时检测多种病原体。 mNGS正愈加普遍地应用于临床感染性疾病病原检测，成为助力疑难、危重感染诊断的好帮手，但是很多临床医生对报告单的结果解释有所疑惑，因此本文针对目前本中心提供的病原微生物宏基因检测项目报告单的结果部分做出一些说明。 病原微生物宏基因检测结果包括如下几个部分： 1.细菌列表； 2.真菌列表； 3.病毒列表； 4.寄生虫列表； 5.1 结核分枝杆菌复合群列表； 5.2 非结核分枝杆菌（NTM）列表；
5.3 支原体/衣原体列表； 6.耐药基因列表； 7.疑似背景列表。 列表中会报告检测到微生物所属的属的中文名、拉丁文名、序列数和相对丰度以及种的中文名、拉丁文名、序列数、相对丰度和基因组覆盖度，针对细菌和病毒还会提供其所属类型，如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、DNA病毒、RNA病毒等。其中，序列数是指能够特异性比对到该病原体的碱基序列数目，宏基因技术是把微生物的核酸打断成核酸片段后进行测序，换句话说，序列数就是检测到多少个核酸片段属于该微生物，因此序列数往往与该病原体的载量正相关。相对丰度是指该病原体在检测到的同类微生物中的序列占比，由于细菌、真菌、病毒和寄生虫的微生态特征、临床意义不同，它们是独立计算相对丰度的，例如，某个细菌的相对丰度是该细菌在该样本所有检出细菌中所占的百分比。因此相对丰度越高，表示该病原体在标本中的占比越高，但不同大类间的微生物相对丰度无法互相比较。基因组覆盖度是指该微生物核酸序列覆盖到该微生物整个基因序列的比值，基因组覆盖度与序列数有关，序列数越多，核酸越高，表示该病原体在标本中真实存在的可性能越高。 举例说明，下图中金黄色葡萄球菌，能够比对到葡萄球菌属的核酸序列有95条，这95条序列在该样本所有细菌序列中的占比为0.656%，其中有78条能够特异性比对到金黄色葡萄球菌，因为该样本葡萄球菌属中只检测到了金黄色葡萄球菌，所有它的相对丰度等于葡萄球菌属的相对丰度（另外17条序列比对到葡萄球菌属的共有序列，无法特异性比对到某种葡萄球菌）。这些能够比对到金黄色葡萄球菌的序列总共有6636个碱基，覆盖到了该物种总基因组长度（2821361个碱基）的0.2352%。 除疑似背景列表外，其他列表视为报告的正文。正文列表中的病原微生物符合宏基因技术判读指标，包括序列的数量、特异性和相似度等指标合格。疑似背景列表中的微生物是从技术指标上无法明确判
2021高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识(全文)
2021高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共 识（全文） 快速准确的微生物鉴定技术始终是临床微生物关注的焦点。传统微生物检验，诸如形态学、培养、抗原抗体及靶向核酸检测等方法在解决疑难及未知病原微生物上存在局限性［1, 2］。新型宏基因组下一代测序（metagenomics next－generation sequencing，mNGS）技术直接针对样本中所有核酸进行无偏性测序，结合病原微生物数据库及特定算法，检测样本中含有的可能病原微生物序列。随着该技术的社会经济成本不断降低和技术的不断完善，已逐渐从科研走向临床应用，成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段［3］。利用mNGS技术进行病原微生物检测需经样本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序并满足测试的质量控制要求后，采用特定算法软件与专用的病原微生物数据库进行比对，实现对病毒、细菌、真菌、寄生虫及非经典微生物等的检测［1，4, 5］。mNGS技术不依赖培养，对常见病原微生物检验阴性、经验治疗失败、不明原因的危急重感染的病原学诊断以及新发突发传染病的病原体发现具 有独特价值［6, 7］。 为进一步规范mNGS技术在感染性疾病诊断中的应用，提高危急重症和疑难感染性疾病的诊疗水平，在多项国家科技专项的支持下，参考国内外相关文献、共识与规范［8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15］，特别借鉴了
《高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识（第一版通用部分）》［16］，组织本领域有关专家起草了本共识，以促进mNGS技术的规范应用和良性发展。本共识中声明的内容为专家讨论并推荐的要点。 一、临床应用的基本要求 （一）适应证 基于医学决策的mNGS病原微生物检测申请，一般用于传统检验方法未能给出明确病原学结果从而影响患者准确诊疗的感染性疾病、新发突发传染病、验证常规检验结果或排除其他发热疾病。推荐临床通过拟诊先行传统微生物检验及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测拟诊疑似常见病原微生物，不盲目使用mNGS技术。在必要或紧急情况下，如危急重症、疑难感染、群体性感染事件等，可考虑作为一线检测方法。表1列出了mNGS临床应用适应性说明。
最新：宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识(2023年版)
最新：宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专 家共识（2023年版） 血液病患者因原发病和（或）治疗相关原因等，免疫功能低下，感染是其常见的并发症。血液病患者感染相关临床症状和体征常不典型，感染病原谱广，传统微生物学检测阳性率低、耗时长。因此，病原诊断是优化抗感染治疗、改善患者预后的关键环节。病原宏基因组二代测序（mNGS）是一项覆盖病原谱广且高通量的检测技术，已在临床感染领域得到了广泛的应用。在血液病患者感染病原诊断方面，mNGS检测具有阳性率高、受到抗菌药物干扰小、覆盖病原广的优势。然而，目前尚无mNGS在血液病感染病原诊断中应用的指南或专家共识。为优化血液病患者病原mNGS 检测适应证及规范报告解读，在参考血液病领域感染诊治及病原mNGS 相关指南等的基础上，中华医学会血液学分会抗感染学组特邀请血液学、病原mNGS检测等领域专家共同制定此专家共识。 一、血液病患者感染临床送检mNGS适应证 共识1：感染是血液病患者常见的并发症，当疑似感染发生时，应首先选择传统微生物学检测，仅在特殊情境下谨慎选择病原mNGS检测。 （一）中性粒细胞缺乏（粒缺）伴发热 共识2：低危且无明显感染灶的患者，如经验抗菌药物治疗≥7 d未明显好
转可考虑在送检血培养的同时送检外周血标本mNGS；高危患者初始经验性治疗72~96 h无效时，推荐送检传统微生物学检测的同时送检血液mNGS。 多项研究显示：在粒缺伴发热患者感染中mNGS检测灵敏度高于传统微生物学检测，尤其对于已经接受经验性治疗的患者，传统微生物学检测可因抗菌药物使用灵敏度明显降低，而mNGS受影响程度小于传统微生物学检测；与此同时，mNGS对于识别病毒、真菌以及多种微生物混合感染具有优势。 （二）血流感染（BSI） 共识3：疑似BSI患者，在留取血培养标本的同时留取血浆样本，于-80 ℃暂存；如72 h内血培养阴性且抗感染治疗无改善的患者，推荐将留存样本进行mNGS。疑似脓毒症的重症患者，建议送检血培养同时送检血mNGS。 多项研究显示：联合mNGS与血培养可以显著提高病原检出率，同时增加混合感染病原的检出；与此同时，研究表明在已明确病原的BSI中，病原的持续检出可与BSI严重程度及控制不佳有关。在导管相关BSI中，凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌是常见的感染病原，因其也是皮肤定植菌，mNGS检出时难以区分定植与感染。因此，不常规推荐mNGS作为疑似
《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》(2021)要点汇总
《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》（2021）要点 感染性疾病一直备受临床关注。新型冠状病毒肺炎全球大流行，给世界经济和人类健康带来严峻挑战，更让病原的精准快速检测成为关注的热点。近年来，因物价、政策等方面的灵活性，独立实验室已广泛开展基于高通量测序（也称新一代测序技术， NGS）的病原学检测实验。NGS技术应用的成功案例，对部分感染性疾病的病原学诊断起到决定性作用。然而目前，临床对NGS应用的适应证认识不足，送检存在较大的盲目性和随意性；操作过程复杂，缺乏规范；提供检验的主体多元而检测质量良莠不齐；结果解释缺乏可信的标准，误导临床的案例屡见不鲜，限制了该技术的临床应用和普及。 一、共识制定过程 二、分类和术语 （一）分类 宏基因组高通量测序技术（mNGS）通过对临床样本的DNA或RNA 进行鸟枪法测序，可以无偏倚地检测多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）。二代和三代测序平台均可用于该项技术。按从临床样本中提取的核酸类型可以分为宏基因组测序和宏转录组测序。按照测序模式可以分为单端测序和双端测序。 （二）术语和定义
NGS： 也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。 mNGS：m指宏基因组，也称元基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。诊断宏基因组学：指用于临床诊断目的的宏基因组学。 临床宏基因组学： 含义与诊断宏基因组学类似，但应用场景更为广泛。 微生物组： 指某一个系统、生态环境或特定区域中全部微生物的总和。 试剂盒基因组： 游离脱氧核糖核酸（cfDNA）： 读长： 文库： 比对： 深度： 覆盖率： 相对丰度： Q值： 标定对照： 无模板对照： 检出限（LOD）：
最新：宏基因组二代测序技术在新生儿感染性疾病中的临床应用专家共识(最全版)
最新：宏基因组二代测序技术在新生儿感染性疾病中的临床应用专家共识 （最全版） 摘要 近年来基于高通量测序平台的宏基因组二代测序（mNGS）技术在新生儿感染性疾病领域得到了广泛应用。为了更加规范mNGS技术在新生儿重症监护病房的应用，中华医学会儿科学分会新生儿学组和中华儿科杂志编辑委员会组织专家以国内外循证医学证据和最新进展为基础，从mNGS 技术的临床适应证、标本采集与转运、报告解读等方面给出建议。 宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）平台是基于高通量测序技术对各种临床样本中的全部生物基因组进行测序的实验室诊断技术，近年来已逐渐被认识并应用于各种感染性疾病的诊断。mNGS可以同时测定某一临床样本中数千万条核酸序列，然后通过强大的生物信息学平台将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，以鉴定可能的致病病原体。此外，mNGS还可以直接从临床样本分析耐药基因，辅助临床诊断以及分析人类宿主反应（转录组）数据以预测感染原因和评估疾病风险。mNGS技术的成功开展对部分感染性疾病患者尤其是免疫抑制人群及重症感染人群的病原学诊断起到了突破性作用。长期以来新生儿感染一直是儿科医生面临的重大挑战，新生儿的免疫系统不成熟，易感因素多，在接触病原体时防御功能较为脆弱，导
致相对高的发病率和病死率。由于新生儿感染的临床表现往往不典型，病情较为隐匿、进展迅速，快速明确病原体对疾病的诊治及转归十分重要。基于mNGS具有无偏倚性、覆盖广、敏感性高，用时相对较短等优点，尤其可在混合感染或病毒感染方面展现其优势，因此mNGS在新生儿感染性疾病中具有广阔的应用前景，但现阶段在新生儿重症监护病房（neonatal intensive care unit，NICU）实践中仍存在一定的局限性及问题：成本相对昂贵；对新生儿的临床适应证认识不足，送检存在较大的盲目性和随意性；样本类型的选择以及对样本送检的流程及注意事项不清楚；实验检测流程操作复杂，缺乏统一标准；测序结果复杂，可能出现假阳性结果误导临床等。以上问题均限制了mNGS在NICU中的临床应用和推广。为了提高mNGS的诊断质量，规范其在新生儿感染性疾病领域的临床应用，中华医学会儿科学分会新生儿学组和中华儿科杂志编辑委员会成立专家组，广泛征求意见和建议，基于国内外临床证据，结合临床实践经验，于2021年7—12月经过专家反复讨论，制定了“宏基因组二代测序技术在新生儿感染性疾病中的临床应用专家共识”（简称本共识）。本共识主要目标读者为儿科尤其是新生儿科专业医生。 一、mNGS在NICU感染性疾病中的应用 共识1：患儿具有急危重症表现，不除外感染，或有继发或并发危及生命的严重感染，需要尽快明确病原体，建议常规检测的同时送检mNGS。 急危重症指多器官功能衰竭，由新生儿败血症、脑膜炎、重症肺炎、腹腔
2023高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识完整版
2023高通量测序技术在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识(完整版) 摘要 高通量测序技术在分枝杆菌病领域中的应用日益普及，而在实际应用过程中，临床医师对技术本身及如何合理应用检测结果仍存在很多疑问。本共识针对高通量测序技术临床应用中存在的突出问题，依据公开发表的研究数据和参与专家的应用经验，经众多专家讨论形成，为在分枝杆菌病诊断过程中合理使用高通量测序技术提供参考。 高通量测序(high-throughputsequencing)技术在感染性疾病病原学诊断及常见病原微生物的耐药诊断中优势明显，在分枝杆菌病领域也得到越来越广泛的应用，为疑难分枝杆菌病的诊断、鉴别诊断和耐药诊断提供了循证医学证据。 然而在实际应用过程中，临床医师存在诸多困惑。鉴于此，高通量测序共识专家组针对高通量测序技术临床使用过程中存在的突出问题，撰写了本共识，以期提高该技术的临床应用水平，去伪存真，使这项先进的检验技术得到科学合理的应用。 一、高通量测序技术概况 高通量测序技术泛指二代测序技术和第三代测序技术，目前已有多种用于临床感染性疾病的病原微生物鉴定，尤其是当缺乏诊断线索时，鉴定病原微生物具有显著优势。依据检测策略的不同，其主要分为靶向测序、宏基因组学测序（mNGS）
和全基因组测序（WGS\ 分枝杆菌靶向测序技术是先通过靶向捕获分枝杆菌特异基因后再进行高通量测序，主要适用于临床怀疑分枝杆菌感染的患者，既有助于诊断结核病/非结核分枝杆菌（NTM）病，又可以检测耐药基因突变,从而精准指导临床医师用药。 2018年，WHO发布的《应用高通量测序技术检测耐药结核病相关基因突变的技术指导原则》重点关注了靶向测序技术用于结核病耐药诊断的功能。mNGS技术则是直接对标本中所有的核酸进行无偏倚检测和序列分析，相比分枝杆菌靶向测序，mNGS可检测出种类繁多的微生物，但无法实现对结核分枝杆菌耐药基因的全面检测。 二、高通量测序技术的特点 二代测序技术近年来发展迅猛，具有通量高、速度快的优点，但存在读长较短，不利于后续生物信息学分析的缺点，且PCR扩增过程中DNA序列碱基的G-C偏好性会影响检测的准确性。 第三代测序技术也被称为单分子测序技术，可实现对DNA/RNA分子直接测序，且读长较长，一般为几十甚至上百kb,测序通量高，数据可实时读取分析，速度更快，在临床的应用也越来越多。 大量研究数据表明二代测序技术和第三代测序技术各有所长：二代测序读长短但
mNGS在感染性疾病中的应用
mNGS在感染性疾病中的应用 感染性疾病是指细菌、病毒、真菌、非典型病原体、寄生虫等及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有很大的危害性和很高的病死率，是当今世界严重威胁人类健康的常见疾病。 病原微生物检测是诊断感染性疾病的重要方法，同时对治疗方案具有非常重要的指导意义。近些年新兴的宏基因组学第二代测序（mNGS）检测方法有力提高了检出率和弥补了传统检测方法的不足，但与之同时，mNGS在实际应用中也存在被过度夸大和神化的现象，这源自于太多人对mNGS的一知半解，愿此文能帮助大家提高对mNGS的认识和正确应用。 1、mNGS较传统病原学检测方法的优势 传统的病原微生物鉴定方法主要有涂片镜检、分离培养、生化反应和质谱等方法，但其存在周期长、过程复杂及灵敏度低等缺点，在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，如分枝杆菌菌种鉴定需要长达30～40天的时间，而一些苛养菌及病毒对培养条件要求极其苛刻，甚至不能培养，而且对于未知或者罕见的病原微生物无法快速识别。据统计，约70%的感染性疾病患者因传统检测方法无法确定病原体信息，不能得到及时有效地救治，从而使病情恶化。宏基因组学第二代测序（mNGS）则无需对病原体进行分离培养，也不依赖已知核酸序列，可直接快速客观地对临床样本中的较多病原微生物（包括病毒，细菌，真菌，寄生虫）进行测序鉴别，且无需特异性扩增，大大节省了检测时间，提高了诊断效率，在对未知物种及难以培养的病原体鉴定方面更是具有无可比拟的优势。传统的分离培养方法通常只能培养出一种微生物，当存在混合菌（包括混合不同类型微生物）感染时通常会漏检，当定植菌超过致病菌的载量时，通常只培养出定植菌而造成漏检和误导临
最新：宏基因组学测序技术在中重症感染中的 临床应用专家共识第一版(全文)
最新：宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识第一版 （全文） 基于宏基因组学测序（mNGS）的病原学诊断技术是一种非靶向的广谱病原学筛查技术，近几年越来越多的研究表明其在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了关键性作用。由于mNGS高昂的成本及较高的实验条件要求，目前尚未纳入常规临床检验中。可以预见，随着测序成本的下降及我国医疗水平的不断提高，基于mNGS 的病原学诊断技术在临床大规模开展的条件已经逐步成熟。 随着基因组学技术的发展，高通量测序技术〔又称下一代测序技术（NGS）〕越来越广泛地应用于感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等各个方面，并且朝着快捷、经济的方向飞速发展。近年来采用宏基因组及宏转录组发现了两个临床感染病例的新发病原体，例如沙粒病毒和新型布尼亚病毒，开启了宏基因组学测序（mNGS）技术在临床感染中应用的先例。由于mNGS 不依赖于特定基因引物的序列扩增，而是将待测样本的所有DNA 或RNA 混合测序，并通过将测序数据与病原体数据库进行比对，获得病原体的分类信息，因此能在较短的时间内完成对样本的无靶向检测，单次即可检测上千种病原体，检测的病原体种类包含病毒、细菌、真菌和寄生虫等。 现阶段而言，受限于高昂成本，mNGS 主要集中应用于重大疾病、突发
公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳入常规临床检测。 检测与质控 检测设施设备控制：必须按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的相关规定开展临床mNGS。检测实验室应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的相关规定。实验室空气洁净度需要建立标准对照和监测系统，实验室存在的背景微生物需要进行定期的汇总更新。测序设备需要采用获得国家医疗器械注册许可的测序平台。 检测实验质控：mNGS 过程主要包括样本处理（包含运输）、核酸提取、文库构建、上机测序及数据比对与判读。对于这些影响检验结果的关键过程，需要有相应的质控点，包括运输过程保持低温状态、核酸提取质量、文库出库浓度和片段分布大小、下机总数据量、有效数据量、测序质量及数据分析可靠性等，任何不符合质控标准的检测都应及时终止并重新检测，或者在无法重新检测的情况下，可提供预警，以供临床参考。全流程的质控标准应包含但不限于如下几点：①每批次实验中都应该包括内参和（或）阳性、阴性对照品。②内参和（或）阳性对照品被有效检出且检测到的碱基序列片段数量应满足实验预期的检测敏感度阈值。③对于不同类型的样本，建议有基本的序列数据量。因为mNGS的科学原理是对临床样本中的所有核酸进行高通量测序，除了测试到样本中包含的病原体序列信息外，一定也包含了人基因组或转录组的序列。由于临床样本中微生物的
一文了解不同领域宏基因组测序专家共识在临床应用中关键点的异同
一文了解不同领域宏基因组测序专家共识在临床应用中关键点 的异同 引言 针对宏基因组测序技术在感染病原体的临床应用，目前主要存在多篇专家共识。依照出版时间顺序与主要内容： 2019年2月《中华急诊医学杂志》发布《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用专家共识》。该共识介绍了mNGS 分析和诊断技术，在急危重症感染患者(急症)应用的适应症、基本流程和质量控制、临床应用和结果解读原则和mNGS 在急危重症感染性疾病应用中尚存在的问题等方面。 2020年5月《中华危重病急救医学》发布《宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识》。共识分为5个部分，从重症角度说明mNGS的应用价值(共识背景、检测与质控、规则与应用、mNGS技术展望和结语)。 2020年11月《中华传染病杂志》发布《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》。这是全球首篇针对所有感染性疾病的mNGS临床应用专家共识，在二代测序病原检测技术越来越普及的当下，对感染病宏基因组学病原诊断的应用具有里程碑式的重要意义，建立了中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。 2020年12月《中华检验医学杂志》发布《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》。从检验科的角度，规范mNGS技术在感染性疾病诊断中的应用，提高危急重症、疑难感染性疾病和新发突发传染病的救治水平。 2021年2月发布的《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》。该文对宏基因组高通量测序技术的临床适应症、实验流程、质量管理、性能验证和报告解读进行讨论并撰写共识，对关键问题给出了推荐意见和处理方法。 2021年9月《中华检验医学杂志》发布《宏基因组测序病原微生物检测生物信息学分析规范化管理专家共识》。为提高临床对mNGS
2023感染科NGS检测的意义及解读
2023感染科NGS检测的意义及解读 近年来，随着高通量测序技术，也称新一代（或下一代）测序技术（NGS）的迅猛发展，在操作流程不断简化、检测通量不断增长的同时，检测成本也大大降低，使其在感染病原体检测中呈现出一定的技术优势，并得到越来越广泛的应用。当前，基于NGS鉴别微生物的主要方式有两种：宏基因组测序（mNGS）与病原体靶向测序（tNGS）。 病原宏基因组检测，无需预设，无需培养，无偏好性，直接提取临床样本中的DNA、RNA，进行高通量测序，经过专用病原数据库比对与分析，一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等病原体的检测。基于病原体核酸序列盲测的mNGS技术横空出世，成为感染病诊断的利器。 01指南共识推荐 mNGS经历快速发展的五年，被引入多部共识/指南。最新共识均推荐mNGS病原学诊断重要方法，包括《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体临床应用专家共识》、《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》、《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》等。
其中《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体临床应用专家共识》推荐mNGS作为新发、罕见、疑难感染性疾病一线检测手段。推荐内容如下： 推荐意见24（强烈推荐，Ⅲ）：对于呼吸道感染，二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析。 推荐意见26（强烈推荐，Ⅲ）：对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段。 存在的问题 01数据量的问题 可能存在病原体数据量不够被背景序列淹没的情况，人源核酸含量越高，mNGS敏感性越低，病原体检出序列数越少，甚至导致假阴
王一民医生：怎样快速解读mNGS报告：一个判断病原致病情况的工具
王一民医生：怎样快速解读mNGS报告：一个判断病原致病 情况的工具 关于mNGS需要了解的基本概念 首先我们需要了解一些关于mNGS的基本概念。NGS是高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。m指宏基因组（metagenome），是标本中全部生物（人、物种）基因组的总称。mNGS指对标本中的全部生物基因组进行测序。物种组（Microbiome）指某一个系统、生态环境或特定区域中全部物种的总和。生物医学领域常常是特指存在于人体特定环境中全部物种遗传物质的总和。例如，人体的肠道物种组是人体肠道全部物种遗传物质的总和。而在整个标本中的确会存在环境物种、人员物种，还有微生物物种。 另外还有一些mNGS报告中存在的关键信息，这也涉及到我们在解读时存在的一些问题。 读长一般指测序仪单个测序反应所得到的碱基序列。读长长度指该碱基序列的碱基数。读长数量指测序获得的碱基序列的数量。因此读长会受到病原体的大小、数量等方面的影响。一些公司的检测报告会基于读长有一个分解，于是就有了序列数（RPTM），它是每一千万条测得序列中包含的阳性序列条数。另外，深度、覆盖率、相对丰度也是在解读报告中关键的信息。如果测序的深度越深，那么检出碱基的可信度越高。覆盖度越广，病原体所占基因组的比例也越高。相对丰度越高，表示该物种所占比例越高。在质量控制分析中包含碱基质量分布图，它能够帮助我们去判断质控。
（王辉, 等. 宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识. 中华检验医学杂志, 2021, 44(2): 107-120.）免疫抑制患者肺炎病原学特点——多样，混合 如今的肺炎或重症肺炎临床救治困难之一就包含病原诊断困难，因为无法明确病原体而导致在临床救治中的难度。 目前我们收治的患者越来越多，大多是一些免疫抑制的患者，而在这些患者中，可能会存在多样性、混合性的感染问题。我们在解决这样的问题时，不是像单一病原体致病那样去分析，而需要分析对于多种病原共存的宿主，应该如何去评估病原体的价值。 免疫受限宿主病原检查的复杂多样性 指南告诉给我们，对于这样的宿主，如果想明确病原就需要去兼顾可能的病原体，进行一些针对性的检测，不是广覆盖或者盲目的做所有检查。但要做到更加精准的、有针对性的检查似乎有困难，并且由于免疫受限宿主标本获取困难，而导致在很多检查中无法去获取标本。像血培养、鼻咽拭子、尿抗原等检测是比较容易做的，但如果做一些灌洗液的分子生物学PCR就不是件容易的事了。 常规临床微生物检验——不同的病原，合适的标本，恰当的方法常规微生物检验遵循的原则就是针对不同的病原体，应该用合适的标本以及恰当的方法来发现它们。比如针对某些病原体，用快速染色的方法可以快速精简的提供线索甚至诊断，如说抗酸染色、弱抗酸染色、墨汁染色、硫胺、六胺银染色。荧光染色则对于真菌的识别率比较高。我们过去更加倚重的是培养技术，但是做培养是比较难的，
【规范与指南】血液样本微生物游离DNA的NGS检测原理与应用
【规范与指南】血液样本微生物游离DNA的NGS检测原理与 应用 京港感染论坛 早诊快诊，助力精准防治 01 已知可引起人类疾病的微生物多于1000种，病原学的探寻始终是感染性疾病诊治的重要环节，对于一些类型的感染性疾病，病因的探求仍然存在很大的困难，尤其对于血流感染，超过50%尚不能明确病因。随着病原NGS的广泛应用和不断成熟，已成为感染检测的重要手段。本文将以血液样本的病原微生物NGS检测为主要内容，对其检测流程、特征、临床应用、阈值、性能验证与质控进行介绍与分享。 02
03 病原mNGS检测的原理如下图左侧所示，相对于非感染人群，患者的临床标本中如果某种微生物核酸大量检出，而非感染人群中该微生物核酸量未检出或明显低于感染患者，则意味着该微生物是感染病原体的可能性较高。 病原mNGS检测流程包括标本采集、运输、核酸提取和富集、建库测序、生信分析以及可疑病原菌报告。检测流程受到众多的因素影响。标本的优化选择、快速的转运、恰当的保存、人源背景的处理、合理提取及建库试剂盒的选择、测序的平台、深度、测序序列长度、数据库分析、合理化报告都会直接影响到报告的质量。
04 整个mNGS检测的过程，就好比这样的一个过程：样本就像一个上了锁的书箱，箱子里的书本就是人与微生物的基因组。由于受限于目前的技术，无法轻松的打开箱子获取其中的完整信息，因此我们采用一系列湿实验的方法，把这个箱子摧毁，这时书本已经被损坏，变成了一张张碎纸条，这些碎纸条就是所谓的DNA片段，经测序后变成了我们说的reads。 碎纸条上由四种字符组成-“ATCG”，基于这些碎掉的片段，我们去图书馆查找出处，这里的图书馆就是大家常说的“基因组数据库”。例如“假作真时真亦假，无为有处有还无。”我们可以还原到《红楼梦》。在报告中的读长数（reads）即是我们拿到纸条的数目，如果我们看到很多的纸条都来自同一本书（比对到同一微生物的序列数较高），覆盖的书本章节越多（基因组的覆盖度越高），则代表其更加可靠。 05 血液样本的病原NGS检测与组织、肺泡灌洗液等这些标本不同，其检测的主要是血浆中的游离核酸-cfDNA。而组织、BALF、痰液等标本中，其病原主要以菌体形式存在，核酸是存在于病原细胞中的，