精原干细胞研究进展

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------精原干细胞研究进展精原干细胞研究进展动物生殖生理学课程论文精原干细胞移植的研究进展【摘要】 :精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs) 是精子发生的起始细胞。

SSCs 移植是近年发展起来的一项技术，是将供体动物的 SSCs 移植到受体动物的睾丸内，使其在受体睾丸内迁移、定居、增殖并启动精子发生，产生有受精能力精子的过程。

该技术在雄性不育的治疗、精子发生机制的探讨、干细胞生物学研究及优质动物或转基因动物繁育等方面具有广阔的应用前景。

本文就 SSCs 移植技术、移植研究的发展和 SSCs 移植应用作一综述。

【关键词】 : 精原干细胞、移植、鉴别、分离、受体Progress on Spermatogonial Stem Cell Transplantation 【Abstract】 : Spermatogonial stem cells (spermatogonial stem cells, SSCs) are initiating cells of sperm production. SSCs transplantation is novel technique developed in recent years, in which the testicular cell suspension from donor animals is microinjected into seminiferous tubes at the surface of the host testis, and subsequently, the donor SSCs survive, migrate, proliferate, initiate the spermatogenesis and produce the sperms with normal fertilization ability in the host testis.1/ 19This technique provides a new opportunity for therapy of sterile male, study of spermatogenesis mechanism and production of transgenic animals. Here the advances in SSCs transplantation are reviewed. 【Keywords】 : Spermatogonial stem cells; transplant; Identification; separation; receptor 干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞，包括胚胎干细胞和成体干细胞。

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs) 是一种成体干细胞，位于生精上皮基底部，是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞，是哺乳动物成体睾丸生精上皮中唯一可复制的多能二倍体细胞，能在体外分离纯化、培养、冻存，可进行同体或异体移植。

SSCs 移植是从可育供体将 SSCs 移植到不育受体睾丸中，使供体来源的精子发生在受体睾丸中恢复的过程。

其结果是供体基因型通过受体传给受体子代。

SSCs 移植有助于阐明雄性生殖干细胞和其在睾丸的生理功能，有助于开发出分离与培养精原干细胞体外系统，检查精子发生缺陷，纠正雄性不育和引入遗传改变进雄性生殖系。

本文就 SSCs 移植技术、移植研究的发展、应用及潜在的问题作一综述。

1 SSCs 的生物学特性SSCs 来源于原始生殖细胞(primordial germcells， PGCs) ， PGCs 先演化为性原细胞，性原---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------细胞再发育为 SSCs[1]。

初始 SSCs 为单个型( A single， As) 精原细胞， As 能自我更新或者分裂产生 2 个通过胞质桥相连的对称型( A paired， Apr) 精原细胞， Apr 进一步分裂形成 4、 8、 16 个细胞的链状排列型(A aligned， Aal) 精原细胞。

Aal 即为第 1 代分化的 A1 型精原细胞。

A1 随后进行连续 6 次的细胞分裂，依次产生 A2、 A3、 A4 等中间型和B 型精原细胞， B 型精原细胞经过数次分裂后，体积增大分化为初级精母细胞，再经过减数分裂产生精子细胞，最终形成精子[2] 。

目前认为，仅单个型原细胞具有干细胞性质，即所谓的精原干细胞。

因此， SSCs 又被称为 As 型精原细胞。

SSCs 相对数量极少，仅占成体生殖细胞的0. 02%~0. 03%[3]。

SSCs 一方面能够自我更新，产生新的干细胞以维持自身数量的恒定，一方面能够在自身基因或外来信号的调节下增殖分化为各阶段的 - 1 -动物生殖生理学课程论文生殖细胞直至精子。

2 SSCs 移植技术自从 1994 年 Brinster 等利用显微注射技术，以 LacZ 基因为报告基因，将正常小鼠的SSCs 移植入白消安处理过或遗传缺陷的小鼠曲细精管中的试验成功以来， SSCs 移3/ 19植技术得到了很大的发展［4］。

目前， SSCs 移植技术一般需要经过 5 个步骤：1) 供体的选择；2) SSCs 的体外培养； 3) SSCs 的鉴别与分离；4) 受体动物的准备； 5) 移植操作，即将移植液注入受体睾丸的生精小管中。

2. 1 供体的选择作为 SSC 移植的供体动物，首先要带有一定的标记以区别于受体本身的细胞。

目前，常用的受体动物是能在精子发生各阶段都表达 E colil -半乳糖苷酶的转基因小鼠，这种小鼠的精原细胞在含 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal) 的培养液中可被孵育染成蓝色，可与受体本身的精原细胞相区别。

另外， Kanatsu 等使用能在身体所有细胞都表达绿色荧光蛋白(GFP) 的新生期转基因小鼠，这种小鼠的精原细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光[5]。

这两种动物都是良好的供体动物。

选择供体动物将其麻醉，取出睾丸，消化分散曲精小管，收集 SSC。

2. 2 SSCs 的体外培养 1998 年， Nagano M 第一次提出小鼠的 SSCs 需经体外培养一段时间后才能移植，其目的是使 SSCs 在体外增殖，增加移植的数量，并使细胞能够在培养时进行自身的损伤修复，从而提高移植成功率。

在体外培养条件下，添加干细胞因子(stem cell factor， SCF)、---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 白血病抑制因子(1eukemia inhibitory factor， LIF) 及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF) 对 SSCs 的分裂增殖均有较好的效果[9]。

近年来有许多改进小鼠 SSCs 培养体系的报道，如 Jeong D 用成纤维细胞系作为饲养层细胞， DMEM 作为基础培养液，添加干细胞因子、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等营养物质，使牛 SSCs 可在改进的培养液中培养存活 1 个月[10]。

2. 3 SSCs 的鉴别与分离选择适龄的供体动物，准确地鉴别精原干细胞，可提高 SSCs 移植的成功率。

SSCs 所占的比例很小，在 1 104 个的睾丸细胞中仅有 2 个SSCs，所以将供体动物诱导成隐睾症可减少 SSCs 分化，从而达到增加 SSCs 比例的目的。

在鉴定 SSCs 方面，人们还未找到 SSCs的特异性分子标记。

因为精原干细胞和其他的干细胞表面标志存在一定程度的相似性，所以一些干细胞表面标志也用来鉴定 SSCs，如 SSEA-1、SSEA-3、 SSEA-4 和 AP 等。

一般是通过这些分子及其相应抗体来筛选和鉴定 SSCs[6]。

最近有学者报道，神经标志物蛋白基因产物 9. 5(Protein gene pr- oduct 9. 5， PGP9. 5) 可作为猪睾丸中 SSCs 的特异标记，这一结果为 SSCs 特异性分子标记的进一步研究奠定了一定的基础5/ 19[7]。

SSCs 分离的原理是根据曲精细管内各种细胞的比重、大小、贴壁速度及表面标记等性质的不同将其分离。

过去主要方法有重力沉降法、牛血清白蛋白梯度离心法、Percoll 密度梯度离心法。

目前有报道采用多参数筛选法和荧光激活分析法，从隐睾小鼠睾丸中可获的SSCs 是用普通方法获得的 SSCs 的 166 倍。

Buageaw A 等通过使用磁力活性的细胞进行细胞分选[8]。

将洗过的精子用 H-Y 抗原的单克隆抗体处理。

再把被第二抗体所包裹的超磁化多聚体小珠加到精子中，过柱，利用磁体将与磁珠相连的精子从样品中去除。

相对于多参数筛选法、荧光激活分类分析法，免疫磁珠法不但有更高的效率，而且对 SSCs 的损伤也小。

- 2 - 动物生殖生理学课程论文 2. 4 受体动物的准备受体动物的年龄是影响移植效率的关键因素之一[11]。

用不同的方法处理受体动物睾丸的目的主要有两个方面：首先，抑制受体动物自身 SSCs 的精子发生；其次，尽量减少对受体动物睾丸的损伤。

通常在进行 SSCs 移植之前，用白消安(Busulfan，抗肿瘤药物) 处理受体动物。

其作用机理是 Busulfan 使 DNA 烷基化从而破坏受体 SSCs 增殖，剂量因种群而异，但这种方法会导致骨髓减少从而使动物致死---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ [12]。

Busulfan 处理 17 周龄的猪和绵羊，不但睾丸重量和 SSCs 的数量减少，而且有全身性的毒性。