细菌菌落总数的测定
水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
细菌菌落总数的测定(精)
A.3 无菌生理盐水
A.3.1 成分
氯化钠8.5g、蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
称取8.5g 氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
2．其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3．当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
五、 结果与报告
(一)菌落总数的计算方法
三、培养基和试剂（制法见附录A）
平板计数琼脂培养基、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水。
四、操作步骤
（一）样品的稀释
1.固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。
6.及时将15 mL～20 mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
（二）培养
1．待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48 h±2 h。水产品30℃±1℃培养72 h±3 h。
2．如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按1条件进行培养。
3．若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
菌落总数测定
食品安全菌落总数测定菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
菌落总数检验工作中会遇到各种实验平板的菌落计数工作，如倾注法平板，螺旋接种平板，3M菌落总数测试纸片，滤膜法平板等。
因此要高效准确的进行各类平板的菌落计数并保存所有实验数据和图片，必须要求采用的自动计数仪器支持各类平板的自动分析。
迅数菌落分析仪器采用了菌落放大图象拍摄，高分辨率的1000万像素CCD数字成像技术和Colonfast 菌落智能识别技术。
在菌落自动计数方面，仪器可以快速完成包含细菌、霉菌、酵母菌等样品的各类倾注法平板、涂布法平板、滤膜法平板、空气沉降法平板、螺旋接种平板、3M纸片的菌落自动计数和浓度计算，这个功能可以促进我们食品卫生检验中“菌落总数”测定项目的自动化；自动计数菌落的速度高于500个菌落/秒，最小可以分辨的菌落直径可达 0.01mm；可构建专用计数模板以适应复杂实验室环境，计数误差控制在10%以内。
“迅数”是采用最多的菌落仪品牌。
食品行业适用标准：GBT 4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定需要进行菌落计数的行业有：疾病控制，卫生检验中心检验检疫局质量技术监督局大学：食品科学与工程微生物发酵免疫医学检验公共卫生科学院，研究机构环境监测部门自来水公司制药企业：生物制药，化学制药，抗生素企业化妆品企业食品企业：饮料、饮用水、乳品、保健食品、糕点糖果、膨化食品、食品添加剂、粮食及其制品、酒类、调味品、微生态、保健食品消毒剂、消毒器械：消毒剂；消毒器械；生物指示剂；化学指示剂；灭菌包装物一次性使用医疗用品：输注类；导管类；诊断、治疗器具类；透析器具类；麻醉器具类；手术巾、敷料类；护理器材类卫生用品：卫生巾；尿布；皮肤、粘膜卫生用品；隐形眼睛护理用品；其他的一次性卫生用品●大肠菌群计数传统的大肠菌群最可能数(MPN)法必须经过：初发酵实验，复发酵证实试验。
食品中细菌菌落总数的测定报告.ppt
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三 、 材料
1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸 盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培 养箱等。
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四、 流程
1、检样
2、做几个适当倍数的稀释液
3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入 灭菌平皿内
4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀
一定条件包括培养基成分、培养温度 和时间、pH、是否需要氧气等。
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按国家标准方法规定，即在需氧情况 下， 36 ±1℃培养48±2 h，能在平板 计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。 所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求 的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件 不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
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为菌落总数测定标准。每一个稀释度应 采用两个平皿，大于300的可记为多不 可计。
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2、其中一个平板有较大片状菌落生 长时，则不宜采用，而应以无片状菌落 生长的平板作为该稀释度的菌落数；若 片状菌落不到平板的一半，而其余一半 中菌落分布又很均匀，则可以计算半个 平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。
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试样 例次
稀释度
10-210Leabharlann 3138052
平
2 均 526
205
菌
3 落 271
60
数
4
284
152
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
18
10-3
5.2x104
32 10-3，10-4 （1.56） 2.6x105
12
10-2
（2.2） 2.7x104
菌落总数测定实验原理
菌落总数测定实验原理菌落总数测定实验主要是用于估计在一个固定样本中的细菌数量。
该实验基于菌落形成的原理，即当单个细菌在适宜的营养基质上生长并分裂形成一个可见的菌落。
通过计算菌落的数量，我们可以推断出样本中微生物的密度或浓度，并用来评估样品的微生物污染水平。
以下是菌落总数测定实验的原理：1. 样品制备：将待测物质（如生物样本、环境样本或食品样品）制备成一定浓度的悬浮液或溶液。
通常采用的方法包括稀释方法和加权方法。
2. 涂布法：将待测物质悬液通过涂布器均匀涂布在含有适宜的营养基的琼脂平板上。
涂布后，用铸平板法或扩散平板法分别滴加或扩散对照菌液。
此时，细菌会在平板上形成可见的菌落。
3. 孵育：将涂布后的琼脂平板置于适宜的培养条件下（如温度和湿度），让细菌在平板上生长。
通常，孵育温度选择在细菌生长的适宜温度范围内，孵育时间一般为24-48小时。
4. 菌落计数：在孵育结束后，使用裸眼或放大镜观察并记录菌落的数量。
每个可见的菌落被视为由单个细菌起源，因此菌落的数量可以作为菌落形成单位（CFU）来估计细菌的数量。
5. 统计分析：菌落总数测定实验通常需要多次重复实验，并计算平均数和标准差，以确定样品中菌落的平均数和变化范围。
需要注意的是，菌落总数测定实验有一些限制和注意事项：1. 环境因素：实验结果可能受到孵育温度、孵育时间、营养基配方等因素的影响。
因此，需要在每次实验中保持这些条件的一致性。
2. 统计误差：实验中可能存在人为误差，如计数过程中漏计或重复计数等。
为了减少误差，建议使用适当的实验设备和技术，并进行多次重复实验。
3. 细菌特性：不同类型的细菌对不同的培养基和培养条件具有不同的适应性。
因此，在进行菌落总数测定实验时，需要选择适合待测样品中细菌生长的培养基。
总之，菌落总数测定实验是一种常用的微生物学实验方法，可用于快速评估样品中微生物的数量和污染水平。
在实验过程中，需要注意操作规范并进行适当的统计分析，以获得准确和可靠的实验结果。
生活饮用水水质检测 细菌菌落总数测定
3.3 生活饮用水细菌菌落总数的测定
冷却至50℃的 培养基
12～15ml
水样
各取1mL 水样
冷却 倒置
37℃、24h
计数
3.4 河水、池水等的菌落总数的测定
1. 水样稀释
9 ml 无菌水
1 ml
水样
9 ml 无菌水
1 ml
9 ml 无菌水
1 ml
10-1
10-2
10-3
稀释倍数视水污染程度而定，选择在平板上能长出30～300 个菌落的稀释倍数为宜。
细菌菌落总数的测定
教学目标
生活饮用水 水质检测
任务9
知识目标
（1）细菌总数、菌落；（2）细菌总 数与水质的关系；（3）水中细菌总数 的测定原理、平板菌落计数法。
能力目标 （1）水样采集；（2）培养基的配制和 灭菌技术，无菌操作，细菌的接种； （3）细菌的培养、菌落的观察、计数
素质目标 1）整洁、有序、规范；（2）多实践、 巧动手，严格执行无菌操作；（3）培 养实事求是、严谨认真的科学态度；善 于观察、分析问题
n 细菌的数量和大肠菌群数是生活饮用水监测的重要生物 指标。
1.2 菌落总数
菌落(colony)：在固体培养基上，一个母细菌不断繁殖， 形成一堆肉眼可见、有一定形态构造特征的细菌集合。
n 单个细菌难以直接计数，但细菌在固体培养基上生长，形 成具有各种颜色和不同外观的菌落，却易观察，易计数。
n 在水质卫生学检验中，细菌总数是指1mL水样在牛肉膏蛋白 胨培养基中经37℃、24h培养后，所生长出的细菌菌落总数。
教学内容
细菌及菌落总数
细菌菌落总数测定的原理 平板菌落计数法 注意事项与思考题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
菌落总数 标准
菌落总数标准一、菌落总数定义菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得每克（每毫升）检样中所生长出来的细菌菌落总数。
它是一种反映食品卫生状况的重要指标，用以判定食品被污染的程度。
二、菌落总数测定方法1. 按照国家标准方法，将样品进行稀释，取一定量稀释液接种到培养基上，置于恒温箱中培养。
2. 观察每个培养基上的菌落数量，并记录。
3. 根据稀释倍数和培养基上的菌落数量，计算出每克（每毫升）样品中的菌落总数。
三、菌落总数卫生标准根据国家卫生部门的规定，食品中的菌落总数应符合以下标准：1. 饮料、饮用水：≤100cfu/ml。
2. 植物性食品、罐头食品：≤1000cfu/g。
3. 肉制品、乳制品：≤50000cfu/g。
4. 调味品、粮谷类食品：≤1000cfu/g。
5. 冷饮食品：≤2000cfu/g。
四、菌落总数食品卫生要求1. 食品生产过程中，应采取有效措施控制菌落总数的污染，确保食品的安全卫生。
2. 生产过程中使用的原料、水源、容器等应符合卫生要求，避免污染。
3. 食品加工设备、器具、管道等应定期清洁消毒，保持良好的卫生状况。
4. 成品储存应避免污染，严格控制温度、湿度等条件，确保菌落总数不超标。
五、菌落总数环境卫生要求1. 生产场所应保持清洁卫生，定期进行清洁消毒，保持良好的卫生状况。
2. 生产场所的通风、照明等设施应符合卫生要求，防止细菌滋生。
3. 生产过程中产生的废弃物、污水等应及时处理，防止污染环境。
六、菌落总数检验规则1. 按照国家规定的标准方法进行检验，确保数据的准确性。
2. 检验时应选取具有代表性的样品，确保样品的代表性。
3. 对于不合格的样品，应进行复检，以确认数据的可靠性。
4. 对于批量生产的食品，应按比例抽样检验，确保整批产品的质量。
七、菌落总数标识、储存、运输要求1. 标识：产品标签上应注明菌落总数指标，以提示消费者注意食品的卫生质量。
2. 储存：食品应储存在清洁卫生的环境中，避免污染。
菌落总数的定量测定原理
菌落总数的定量测定原理您好,细菌的定量测定主要通过计算细菌在培养基上的菌落数目来实现。
以下是菌落总数定量测定的原理和步骤:一、原理菌落总数的测定是通过将含有细菌的样品在固体培养基上进行培养,统计形成的菌落数目来估算原始样本中活菌的含量。
因为每一个菌落理论上是由一个细菌细胞繁殖形成的,所以菌落数目可以反映样品中活菌的数目。
菌落总数法是对环境、食品等样品中的微生物进行定量检测的常用方法。
二、操作步骤(1)称取一定量样品(污水、食品等),配置适当的稀释度,一般做3-5个稀释度。
(2)吸取适量不同稀释度的样品(通常0.1ml、0.5ml等),涂布均匀到预先准备好的固体培养基平板上,每种稀释度设置2-3个平行。
(3)将涂有样品的培养基倒置置于培养箱,在最适合样品中细菌生长的温度下培养一定时间,通常1-3天。
(4)培养结束后,将培养基取出,统计每个稀释度平板上形成的菌落数。
选择菌落数目在30-300个之间的平板计数,以获得较准确的结果。
(5)根据稀释度计算出原样品中菌落形成单位的数量,即CFU/ml或CFU/g,即为菌落总数。
计算公式:菌落总数(CFU/ml或CFU/g) = 平板计数的菌落数÷稀释度÷接种量(ml)三、注意事项(1)样品要充分混匀,进行适当稀释,以获得单独分散的菌落。
(2)平板要平整,接种要均匀,避免菌落聚集。
(3)培养条件要适宜样品中的细菌生长。
(4)计数时,避免重复计数同一菌落。
(5)同一样品应设置多个稀释度的平行,选取菌落数在30-300之间的结果最准确。
(6)运算时注意计数的稀释倍数。
综上所述,菌落总数定量测定通过统计单位样品量中形成的菌落数量,从而推算出原始样品中的菌量,是一种简便可靠的微生物定量检测方法,在环境监测和食品微生物检验中应用广泛。
但操作过程需遵循标准方法,并注意各种影响因素,方能获得准确可靠的结果。
细菌菌落数实验报告
一、实验目的1. 了解细菌菌落总数的测定方法。
2. 掌握细菌菌落总数的计数技巧。
3. 分析实验数据，探讨影响细菌菌落数的因素。
二、实验原理细菌菌落总数（Colony-Forming Units，CFU）是指在一定条件下，一个细菌在固体培养基上生长繁殖所形成的肉眼可见的菌落。
通过测定一定量样品中的细菌菌落数，可以评估样品的卫生状况和微生物污染程度。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：肉膏蛋白胨脂培养基、无菌水、无菌试管、无菌吸管、无菌培养皿、细菌样品等。
2. 实验仪器：高压蒸汽灭菌锅、电热培养箱、恒温箱、电子天平、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 样品处理：取一定量的细菌样品，加入适量的无菌水，进行10倍递增稀释。
2. 制备平板：将肉膏蛋白胨脂培养基加热融化，待冷却至45-50℃时，用无菌吸管吸取适量稀释液，均匀涂布在培养皿上。
3. 培养与观察：将涂布好的培养皿倒置放入恒温箱中，37℃培养24小时。
4. 菌落计数：观察培养皿上的菌落，按照菌落形态、大小、颜色等特征进行计数。
5. 数据分析：根据实验数据，计算样品中的细菌菌落数。
五、实验结果与分析1. 实验结果本次实验中，样品A的细菌菌落数为3.2×10^6 CFU/g，样品B的细菌菌落数为1.5×10^5 CFU/g。
2. 结果分析（1）样品A的细菌菌落数明显高于样品B，说明样品A的微生物污染程度较重。
（2）实验过程中，操作人员的无菌操作对实验结果有一定影响。
无菌操作不规范可能导致样品受到污染，从而影响细菌菌落数的准确性。
（3）培养温度和时间对细菌菌落数也有一定影响。
本次实验采用37℃培养24小时，适用于大多数细菌的生长。
若培养温度过低或过高，或者培养时间不足，可能导致细菌菌落数偏低。
六、实验结论本次实验成功测定了样品中的细菌菌落数，结果表明样品A的微生物污染程度较重。
实验过程中，应注意无菌操作，严格控制培养温度和时间，以保证实验结果的准确性。
实验10 细菌菌落总数(cfu)的测定
实验10 细菌菌落总数(cfu)的测定实验目的：本实验的目的是学习菌落计数法，掌握在实验室中应用菌落计数法计算微生物群落密度的方法，并能够用测定结果进行稀释和百分率计算。
实验原理：菌落计数法是微生物计数的主要方法之一。
在菌落计数法中，必须用营养物质富含的培养基将待测物分散在培养物表面。
每个菌落表示一种单个细胞的后代，即在定期时间内营养物质经历漂浮、摇摆、分散和吸附过程之后，从单个细胞开始增殖的一系列后代。
菌落计数法要求在限定培养条件下进行培养，以便所有细菌都具有相似的生长速度。
通过计数所发现的菌落，可以确定样品中微生物的细胞数。
样本中存在多少个细胞需要明确。
这需要将样品稀释和分布在培养基表面，以便在计算菌落数量时可以获得数百个甚至数千个菌落。
在选择样品中细菌数量的范围时，需要考虑样品的反应过程，包括性状，物理化学性质和体积等。
如果样品中细菌数量太多，培养物中细菌细胞数量可能会达到最大值，使得菌落计数法无法对细菌数量达到该数量的范围进行有效计算。
在这种情况下，需要对样品进行稀释处理，并重新进行菌落计数分析。
实验仪器及设备：1. 工作台2. 恒温恒湿箱3. 倍增器4. 显微镜5. 称量器6. 移液器及移液枪7. 长管灯实验试剂：1. 琼脂培养基2. 生理盐水或磷酸缓冲液3. 蒸馏水实验步骤：1. 测定样品的细菌数量a. 准备预先测定样品细菌数量的干净培养皿。
盛放约20~25mL琼脂培养基并再次蒸过。
视情况在琼脂培养基底部标记好适当的标记，以便计算后将菌落数量乘以相应的稀释因子。
b. 准备带未知菌的样品。
在准备样品之前，如果需要允许不同环境的微生物在病原细菌的控制下合理发展和生长，可以使用磷酸盐缓冲液或生理盐水来制备样品。
c. 稀释样品。
通过取样采集适量的细菌并将其均匀地分配到适量的适当稀释液中并混合。
通过连续稀释，可以在一定的时间内以极低的细胞计数测定样品的细菌数量。
d. 移植培养。
使用无菌工具取适量稀释样品混合液置于标记好的琼脂培养基中。
细菌菌落总数的测定注意事项
细菌菌落总数的测定注意事项检测过程中的注意事项：1、在GB 4789.2的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。
2、根据食品卫生标准要求和对样品污染情况的估计，选择2~3个稀释度。
加入样品时要注意外来的污染。
3、为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在15min 内倾注培养基。
检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。
旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。
4、培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。
（倾注的温度：一般水浴和倾注温度在46±1℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，过低会导致琼脂发生轻微凝固。
厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。
培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。
5、检验过程中还应该用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。
同时，检验过程中应在工作台上打开一块空白的平板计数琼脂，其暴露时间应与检验时间相当，以了解检样在检验过程中有无受到来自空气的污染。
6、每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。
食品：36±１℃，48±2h 。
饮用水：36±１℃，48±2h 。
水产品（指原生态、未加工的水产品）：30±１℃，72±3h。
(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。
7、有时检样的稀释液中往往带有食品颗粒（如奶粉、坚果），在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照将稀释液与PCA混合，不经培养，置4℃环境放置，在计数时用于对照。
另外也可以在已熔化而保温在46±1℃水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。
细菌菌落总数测定
3.2 菌落总数测定的卫生学意义 （2）也可以应用这一方法观察细菌在食品
中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫 生学评价时提供依据。
我国的食品卫生标准，针对各类不同的 食品分别制定出了不允许超过的数量标 准，以控制食品污染的程度。
CFU（colony-forming units）
1:100（第一稀释度） 232，244 1:1000（第二稀释度）33，35
N
C (n1 0.1n2 )d
232 244 33 35 [2 (0.1 2)]102
544 2.2 102
24727
25000
25000或2.5×104
2017/6/3
38
试样 稀释度
例次 10-2
10-3
18
10-3
5.2x104
32
10-3，10-4
2.6x105
12
10-22Βιβλιοθήκη 7x104510-2
2.6x103
5
无法计数 568
312 10-4
3.1x106
6、若所有稀释度均不在30～300之间，有 的>300，有的又<30，则应以最接近300或 30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5. 菌落计数报告方法
细菌菌落总数： ≤3000cfu/ml
大肠菌群：
≤3000MPN/100ml
肠道致病菌： 不得检出
3.2 菌落总数测定的卫生学意义
（3）预测食品耐储藏的期限 细菌数越少，食品存放的时间就越长。
举例：鱼体菌落数目 温度 保质期
105 cfu/cm2
0℃
6天
103 cfu/cm2
实验1.细菌总菌落数的测定
六、说明
为了保证实验结果能准确反映被检样品的真实情 况，检验时必须注意以下一些要求和规定： （1）检验中所用的所有器具都必须洗净、烘干、灭 菌，即不能存在活菌，也不能残留有抑菌物质。 （2） 应注意采样的代表性，如系固体样品，取样 时不应集中在一点，宜多采几个部位。固体检样 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 在加入稀释液后，最好置于均质器中，以800～ 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 1000r/min的速度处理1min，以获得均匀的稀释 液。
（3）为减少样品在稀释时造成的误差，在连续递次稀释时， 每个稀释液应充分振荡，使其均匀（最好采用漩涡混合 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1 器），同时每变化1个稀释倍数应更换1支吸管。在进行 连续稀释时，应使吸管内的液体沿壁流入生理盐水中， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部附着的检液 溶于其内，造成误差。 （4）样品稀释液大多采用生理盐水，有时也用磷酸缓冲液 或0.1﹪的蛋白胨水。如果检样的含盐较高（如酱制品）， 0.1﹪ 稀释液也可采用无菌蒸馏水。用做样品稀释的液体，每 批都要做空白催找，以判断培养基、培养皿、吸管及空 气可能存在的污染。
（5）为了控制培养基的硬度适合细菌的生长，琼脂 含量选为1.5﹪ 含量选为1.5﹪。为了便于操作，有时在灭菌前， 就把培养基分装到不同的试管内，一般1 就把培养基分装到不同的试管内，一般1支试管 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 内的分装量是15ml营养琼脂底部带有沉淀的部 分应弃去，以免与菌落混淆而影响观察计数。 （6）为使菌落能在平板上均匀分布，将检液加入平 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 皿后，应在20min内倾入培养基并旋转混匀。可 将平皿放在平面上，先前后左右地摆动，然后 按顺、逆时针的方向转动。混合时应多加小心， 不要使其溅到皿边和皿盖上。
实验十细菌菌落总数(CFU)的测定(精)
六、思考题
1、测定水中细菌菌落总数有什么实际意义？ 2、根据我国饮用水水质标准，讨论你这次的 检验结果。 3、本实验中哪些步骤属无菌操作？为什么？
三、仪器和材料
无菌培养皿、无菌试管、无菌水，无菌吸管、
接种环、酒精灯、牛肉膏蛋白胨固体培养基、
水样、培养箱、微波炉。
四、实验内容和操作方法
（一）采集水样：取校园内河水，用无菌取水器， 在距岸边5m处，取距水面10~15cm的深层水样。 如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。 （二）细菌总数的测定： 1）水样稀释：按无菌操作法，将水样作10倍系列 稀释。 2）选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释度 的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平 皿上菌落总数介于30和300之间。 3）吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别 注入两个培养皿，每皿1mL。
(二) 稀释度的选择 l、首先选择平均菌落数在30～300者进行计算，当 只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即可 用它作为平均值乘其稀释倍数。 2、若有两个稀释度的平均菌落数都在30～300之 间，则应按两者的比值来决定。若其比值小于2， 应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小 的菌落数。 3、如果所有稀释度的平均菌落数均大于300，则 应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告 之。
计数时应选择菌落数在30300皿之间的稀释倍数进行计数若同个稀释度中一个平皿有较大片状菌落生长时则不宜采用而应以无片状菌落生长的平皿计数该稀释度的平均菌落数
实验十 细菌菌落总数 （CFU）的测定
一、实验目的和要求
1、学会细菌菌落总数的测定。 2、了解水质与细菌菌落数之间的相关 性。
二、实验原理
细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用 适合它们生长的培养基才能将它们培养出来。 然而，在实际工作中不易做到，所以通常用 一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生 性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程 度。水中细菌总数与水体受有机污染的程度 成下相关，因此细菌总数常作为评价水体污 染程度的一个重要指标。细菌总数越大，说 明水体被污染得越严重。
国标菌落总数检测方法
国标菌落总数检测方法国标菌落总数检测方法是一种常用的微生物检测方法，用于评估给定样品中的微生物污染水平。
该方法可以应用于食品、环境、水源等多个领域，以评估样品中微生物的数量。
下面将详细介绍国标菌落总数检测方法的步骤和原理。
一、步骤1.准备培养基：根据需要进行培养的菌种不同，可以选择适当的培养基。
通常，使用含水解鱼肉膏、蛋白胨、肉汤、大豆胨等成分的富含营养物质的琼脂培养基。
2.准备样品：样品可以是食品、水样、环境表面样品等。
根据不同的样品，采取适当的方法进行取样，确保样品代表性。
3.稀释样品：为了获得适当的菌落数，通常需要对样品进行稀释。
将一定数量的样品与适量的稀释液混合均匀，得到一系列不同浓度的稀释液。
4.涂布方法：将上一步稀释好的样品涂布于琼脂培养基上。
可以采用平板涂布法或膜过滤法。
平板涂布法是将稀释好的样品倒入已凝固的琼脂平板上，用涂布棒均匀涂布。
膜过滤法是将稀释好的样品过滤到已凝固的膜上，将膜放在培养基上。
5.培养条件：根据需要培养的菌种不同，选择合适的培养温度和时间。
一般而言，大多数细菌在30-37℃下培养24-48小时。
6.菌落计数：培养一定时间后，可以观察到样品中的菌落。
使用显微镜或计数板等工具，对菌落进行计数。
7.统计和计算：根据计数结果和稀释倍数，可以计算出原始样品中的菌落总数。
二、原理微生物培养基提供了微生物生长所需的营养物质。
在适当的温度和湿度下，微生物会在培养基上生长形成菌落。
每个菌落代表一种或多种微生物。
根据菌落的形态、大小和颜色等特征，可以初步推测菌种。
计数并统计菌落总数可以评估样品中微生物的数量。
在菌落总数检测方法中，样品的稀释是为了确保菌落的数量适宜且分散均匀。
过高的菌落数量可能导致菌落过于密集，不容易准确计数。
过低的菌落数量可能导致菌落太稀疏，有些菌落容易被忽略。
选择合适的稀释倍数可以使得菌落数量适宜，方便计数并计算菌落总数。
总结起来，国标菌落总数检测方法是一种常用的微生物检测方法，通过样品的稀释、涂布、培养和计数等步骤，评估给定样品中的微生物数量。
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3、 若所有稀释度的平板菌落数均 >300，则取最高稀释度的平均菌落数乘 以稀释倍数计算。
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
7、为使菌落能在平板上均匀分布， 检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并 旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样 从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时 间不宜超过20min，以防止细菌有所死 亡或繁殖。
8、培养温度一般为37℃（水产品的 培养温度，由于其生活环境水温较低， 故多采用30℃）。培养时间一般为48h， 有些方法只要求24h的培养即可计数。 培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培 养48h后，培养基失重不应超过15％。
4、每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌 吸管。 5、倾注用培养基应在46℃水浴内保温， 温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易 于凝固而不能与菌液充分混匀。如无水 浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。
6、倾注培养基的量规定不一，从12～ 20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板 过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾 注时，培基底部如有沉淀物，应将底部 弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。
2、其中一个平板有较大片状菌落生 长时，则不宜采用，而应以无片状菌落 生长的平板作为该稀释度的菌落数；若 片状菌落不到平板的一半，而其余一半 中菌落分布又很均匀，则可以计算半个 平板后乘以2，以代表一个平板的菌落数。
3、当平板上有链状菌落生长时， 如呈链状生长的菌落之间无任何明显 界限，则应作为一个菌落计，如存在 有几条不同来源的链，则每条链均应 按一个菌落计算，不要把链上生长的 每一个菌落分开计数。
细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL 大肠菌群： ≤90 MPN/100mL 肠道致病菌： 不得检出
生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）
菌落总数cfu/ml： ≤100 总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出 耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出
10-2 10-3 10-4
原始
计算公式
报告
样品 名称
数据
平均
七、思考 1、 什么是细菌菌落总数（cfu）？ 2、 影响杂菌总数准确性的因素有哪些？ 3、在食品卫生检验中，为什么要以细菌 菌落总数为指标？ 4、为什么营养琼脂培养基在使用前要保 持在46±1℃的温度？
酱油（GB/T2717-2003）： 细菌菌落总数： ≤30000 CFU/mL
按国家标准方法规定，即在需氧情况 下， 36 ±1℃培养48±2 h，能在平板 计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。 所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求 的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件 不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
菌落总数并不表示实际中的所有细菌总 数，也不能区分其中细菌的种类，只包括 一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温 的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以 有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
大肠菌群：
≤30MPN/100mL
肠道致病菌： 不得检出
全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）：
特级
细菌菌落总数：≤20000
一级
≤30000 ≤90
二级
≤50000 ≤90
（CFU/ml）
大肠菌群 （MPN/100g） ≤40
肠道致病菌： 不得检出
不得检出 不得检出
巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）
食品微生物学检验 菌落总数的测定
一、 目的
1、 学习并掌握食品中菌落总数测定方 法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行 卫生学评价中的意义 。
二、原理
细菌数量的表示方法由于所采用的 计数方法不同而有两种：菌落总数和细 菌总数。
1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条 件下培养后，所得1g或1mL检样中形成 的细菌菌落总数。以 CFU/g（mL）来 表示。 一定条件包括培养基成分、培养温度 和时间、pH、是否需要氧气等。
2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释 液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭 菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内， 振摇试管或反复吹打混合均匀，制成 1:100的稀释液。
3 、另取1 mL灭菌吸管，按上项操 作顺序，制10倍递增稀释液，如此每 递增稀释一次即换用1支1 mL吸管。
4、根据标准要求或对污染情况的估 计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制 作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释 度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中， 每个稀释度做两个平皿。
5 6
Hale Waihona Puke 26 无法计数12 568
5 312
10-2 10-4
2.6x103 3.1x106
6、若所有稀释度均不在30～300之间， 有的>300，有的又<30，则应以最接近 300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（四） 菌落计数报告方法
1、菌落数在1～100时，按四舍五入报 告两位有效数字。 2、菌落数≥ 100时，第三位数字按四舍 五入计算，取前面两位有效数字，为了缩 短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
2、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品．经过 适当的处理后，在显微镜下对细菌进行 直接计数。其中包括各种活菌数和尚未 消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接 显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细 菌总数来表示。
三 、 材料
1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸 盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培 养箱等。
（二） 菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察， 必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记 下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度 的各平板平均菌落数。 到达规定培养时间，应立即计数。如果 不能立即计数，应将平板放臵于0～4℃， 但不要超过24h。
1、 平皿菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作 为菌落总数测定标准。每一个稀释度应 采用两个平皿，大于300的可记为多不 可计。
菌落总数主要作为判别食品被污染 程度的标志，也可以应用这一方法观察 细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检 样品进行卫生学评价时提供依据。
食品中细菌菌落总数越多，则食品 含有致病菌的可能性越大，食品质量越 差；菌落总数越小，则食品含有致病菌 的可能性越小。须配合大肠菌群和致病 菌的检验，才能对食品做出较全面的评 价。
同时分别取1ml稀释液（不含样品） 加入两个灭菌平皿内作空白对照。
5 、稀释液移入平皿后，将冷却至 46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml， 并转动平皿，混合均匀。
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，臵 36±1℃温箱内培养48±2h，水产品 30±1℃温箱内培养72±3h。 如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥 漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面 覆盖一薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固 后培养。
9、为了避免食品中的微小颗粒或培 基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易 分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混 合的平板，不经培养，而于4℃环境中放 臵，以便计数时作对照观察。
六、 结果
1、 将实验测出的样品数据以表格的 方式报告。 2 、对样品菌落总数作出是否符合卫 生要求的结论。
报告方式
样品 稀释液及 菌落数 选择稀 释度 报告(CFU/g,ml)
大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml ：不得检出
《瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》(GB 17324-2003) 细菌菌落总数cfu/ml： ≤20
大肠菌群MPN/100ml： ≤3
致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出
霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出
四、 流程
1、检样
2、做几个适当倍数的稀释液
3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入 灭菌平皿内 4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀 5、36 ±1℃培养48±2小时或（24±2）小 时 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 7、 计算菌落总数 → 报告
五、 步骤
(一) 取样、稀释和培养 1、 以无菌操作取检样25g（mL），放于 225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 的灭菌玻 璃瓶内（瓶内预臵适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内， 经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。 固体和半固体检样在加入稀释液后，最好臵 灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理 1～2min，制成1:10的均匀稀释液。
3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计 数，则报告菌落蔓延。 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检 测结果无效。 5、称重取样以CFU/g 为单位报告，体积 取样以CFU/mL 为单位报告。
注意事项
1、无菌操作
操作中必须有“无菌操作”的概念，所用 玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子 等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装， 应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。操 作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室 进行。
（三）菌落总数的计算
1、若只有一个稀释度平板上的菌落数在 适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的 平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数， 作为每g（mL）中菌落总数结果。
试样 例次
稀释度 10-2 10-3 10-4 选定计数稀释度
菌量 /(个/g 或mL)
1 2
3
380
平 均 526 菌 落 435 数 284
52 205
210
18 32
48
10-3 10-3，10-4
10-3，10-4
5.2x104 2.6x105
3.5x105
4
152
37