原核表达步骤
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。
本文将详细介绍原核表达的步骤。
1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。
RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。
在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。
2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。
这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。
在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。
这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。
3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。
翻译是在核糖体中完成的。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。
核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。
起始密码子是AUG。
核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。
终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。
翻译完成后，成品蛋白被释放出来。
4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。
这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。
5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。
这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。
分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。
蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。
6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。
这个过程由信号肽和其他分子机器完成。
信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。
原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。
这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。
理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤
5、 pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
若用PCR方法，可选用载体上的T7promoter （5‘载体特异性引物）and termintor（3‘特异性引物）引物中的一个和基因中的一个序列引物进行PCR验证，并可以判断插入方向。
6、DE3溶原菌的诱导表达
（1）从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50ug/ul 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac 启动子），继续培养2-3小时。
（3）将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
7、 SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100ul可溶上清中加入100ul 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min 使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750ul20mMTris-HCl, pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min, 除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1％SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
原核表达实验流程
二．DＮA连接和转化
基本原理
Ｔ4ＤNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DＮA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中,将克隆载体pGEM-Ｔ与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入ｐGＥM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
(６)４℃用JＡ转头(或与之相当的转头)以2500rpｍ／ｍiｎ离心2０miｎ,以回收细胞。倒去培养液,用2５mＬ冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘油有保存细胞的作用)
（7）4℃用ＪA转头（或与之相当的转头)以2500rpm／ｍin离心20ｍiｎ，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的１0％甘油重悬沉淀。(倾倒培养液时要小心，１0%甘油中的细菌沉淀附着力降低。)
(阳性）转化细胞１
酶切，获取目的基因
Peｔa／DH5a载体
重组
重组载体２
第二步
重组载体2DＨ5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性）转化重组载体３
BL21感受态细胞
转化细胞３
诱导表达
蛋白质提取
SDＳ-ＰAＧＥ电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的ＤNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源ＤNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CａCl２ 法将外源ＤＮA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaＣl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。
原核表达实验流程
pGEM-T载体
目的基因获取 PCR扩增
重组载体1 转化
DH5a感受态制备 DH5a感受态细胞
第二步
转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
（阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因
Pet28a/DH5a载体 重组
重组载体2
重组载体2 转化
DH5a感受态细胞
转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
(6) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存 细胞的作用）
(7) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时 要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）
3 ．方法
1 ）0.8%琼脂凝胶板的配制：取 0.6g 琼脂糖加80ml TAE（1 × ），
20ml水，微波炉加热融化3 分
(8) 将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃保存
(9) 感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那 霉素抗性的LB平板，
37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；
(10) 取 1μ g 超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没 有必要精确计算，可用根据经验估计)。
电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿 孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进 入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要 的。 实验材料
质粒DNA，pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液 10×
原核表达步骤
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
原核表达载体构建步骤
原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。
像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。
这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。
我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。
这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。
你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。
先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。
这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。
我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。
这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。
2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。
这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。
我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。
三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。
温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。
不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。
这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。
把连接产物导入到感受态细胞里面。
这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。
不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。
导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。
我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。
2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。
这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。
在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。
如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。
五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。
原核表达和真核表达
原核表达和真核表达原核表达的步骤和主要试剂1、获得目的基因；2、构建重组表达载体；3、获得含重组表达质粒的表达菌种；4、诱导表达；5、包涵体的分离。
获得目的基因 PCR法钓基因引物（捷瑞），普通taq酶（Regene，Fermentas）/Pfu酶（Fermentas）/Hotstart Taq酶（Fermentas）,dNTP(Regene，Fermentas)RT-PCR法获取基因Trizol（Invitrogen，捷瑞），DEPC（捷瑞或其他进分），Rnase抑制剂（MBI），M-MLV/AMV（Fermentas）或M-MLV/AMV一步法RT-PCR试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen、Omega）构建重组表达载体 内切酶（Fermentas），载体（捷瑞，Fermentas），琼脂糖（西班牙），T4连接酶（Fermentas，promega），测序获得含重组表达质粒的表达菌种 菌株（捷瑞），质粒小抽试剂盒（捷瑞、Qiagen、Axygen），感受态细胞制备试剂盒（捷瑞），抗生素（捷瑞，Amresco，sigma），测序（伟沃）诱导表达 IPTG（捷瑞，Amresco，sigma），胰蛋白胨（Oxiod），酵母粉（Oxiod），琼脂（进分，国产）包涵体的分离 Triton X -100（捷瑞，进分），PMSF(sigma)，DTT （Amresco，进分），尿素（Amresco，进分，sigma）,还原型谷胱甘肽（Amresco，进分，sigma）真核表达蛋白质在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录加工系统获得具有一定构象和生物活性的蛋白质。
真核表达现在主要有毕赤酵母表达体系、杆状病毒昆虫细胞表达体系、哺乳动物细胞表达体系。
各种表达系统各有其优缺点，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但它们的加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。
原核表达步骤
原核表达步骤一、转录（Transcription）转录是指DNA转录为RNA的过程，即DNA的信息通过RNA的合成而表达出来。
转录是生物体中基因表达的第一步，也是生物体合成蛋白质的关键步骤之一。
在原核生物中，转录过程分为三个阶段：启动、延伸和终止。
启动阶段是指RNA聚合酶（RNA polymerase）与DNA的结合，并在DNA上找到起始转录位点。
延伸阶段是指RNA聚合酶沿DNA模板链向下滑动，并合成RNA链。
终止阶段是指RNA聚合酶在遇到终止信号时停止转录，释放出合成的RNA链。
二、剪接（Splicing）剪接是指在转录过程中，将RNA前体分子中的内含子（intron）剪切除去，将外显子（exon）连接起来的过程。
原核生物中的剪接方式相对简单，通常是直接将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子。
剪接的主要作用是消除内含子的干扰，使RNA分子能够直接参与翻译过程。
通过剪接，原核生物能够快速生成成熟的RNA分子，提高基因表达效率。
三、翻译（Translation）翻译是指将RNA的信息翻译成蛋白质的过程。
在原核生物中，翻译过程发生在核糖体（ribosome）中，涉及到mRNA、tRNA和rRNA等多种分子。
翻译分为三个主要步骤：启动、延伸和终止。
启动阶段是指核糖体与mRNA的结合，并识别起始密码子（AUG）位置。
延伸阶段是指核糖体沿mRNA滑动，将氨基酸依次加入正在合成的多肽链中。
终止阶段是指核糖体在遇到终止密码子（UAA、UAG、UGA）时停止翻译，释放合成的多肽链。
四、调控（Regulation）调控是指控制基因表达水平的过程，包括转录调控和翻译调控两个方面。
原核生物通过调控转录和翻译过程中的各个环节来实现基因表达的精确调控。
转录调控主要通过转录因子（transcription factor）和启动子（promoter）之间的相互作用来实现。
转录因子能够结合到启动子上，促进或抑制RNA聚合酶的结合，从而调控基因的转录水平。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
原核表达步骤
1.引物的设计及合成2.基因的克隆: PCR反应PCR产物的回收和纯化PCR产物的酶切3.质粒pET-32a的扩增、提取及酶切接种含有pET-32a空质粒的DH5α的菌株至LB (含有Amp l00ug/mL)中，37℃培养过夜。
取5mL菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，酶切提取出的质粒，-20℃保存。
4.重组原核表达质粒的构建：4.1重组质粒的连接4.2感受态细胞的制备和转化：参照《分子克隆实验指南》的方法进行BL21感受态细胞的制备[16]。
在平板上挑取新鲜的BL21菌落，接种到5mLLB培养基中，37℃振荡培养2~5h，OD600达到0.35～0.5之间，取l～2mL菌液于无菌离心管中，冰上放置至0℃，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，用200uL CaCl2(0.1M)重悬，冰上放置30min，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，0.1M CaC12100uL重悬，4℃放置备用。
4.3重组质粒转化感受态细胞：将10uL重组原核表达质粒加入到100uL的BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，将离心管放入42℃水浴中热休克90s，立即将离心管冰浴5~10min，每管加入800uL的LB培养基，然后放入37℃摇床中100rpm培养45min，取出离心管5000rpm离心5min，弃去600uL上清，将沉淀的细菌混匀并涂布氨卞抗性的LB平板，涂布后正置30min后倒置于37℃培养箱中，培养12~16h。
4.4 重组质粒的鉴定4.4.1 PCR鉴定：挑取抗性LB平板上长出的BL21重组菌，并接种LB培养基中(含Amp100ug/mL)，37℃、200rpm摇振培养3~5h，PCR鉴定。
4.4.2 酶切鉴定：应用限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，通过双酶切鉴定目的基因有无插入及大小是否正确。
酶切结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。
4.4.3重组质粒基因序列测定：挑选PCR检测条带亮，酶切鉴定正确的菌株测序。
原核表达操作流程
（1）PCR扩增及产物回收双引物扩增，25µL体系如下：上游加酶切位点引物1µL 、下游加酶切位点引物1uL、ddH2O 10µL、PrimeSTAR Mix12.5 µL、cDNA 0.5µL 、。
PCR反应程序为：①98℃2min；② 98℃15s、55℃15s、72℃30s、36个循环；③72℃5min；④保持在4℃。
取所有PCR产物电泳检查扩增结果，并进行大量胶回收。
（2）载体构建及质粒转化将PCR产物进行BamHI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA 片段，用胶回收试剂盒回收该片段；同样采用BamHI和NotI对载体质粒pET-28a 双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离纯化，胶回收试剂盒回收载体片段。
将PCR目的片段连接到载体上，连接体系为：回收片段XμL(50ng)、回收载体YμL(50-100ng)、Ligation mix X+Y uL、16℃连接过夜。
取连接产物10μL转化入E.coli Trans5α 感受态细胞中，冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上放置1~2min，加250μL 的LB 液体培养基于37℃摇床缓慢摇45min，涂含卡纳霉素的LB 平板，37℃培养过夜。
在平板上挑取单菌落，PCR 筛选阳性克隆。
（3）原核诱导表达及表达条件优化将重组质粒转化入E.coli BL21（DE3）的感受态细胞内，涂布于含卡纳青霉素30μg/mL 的LB 平板中，于37℃培养过夜。
次日，挑单菌落于50mL培养基中过夜培养。
将50mL扩大培养之后的菌液分成两份，分别加入含有500mL培养基的1L锥形瓶中继续扩大培养，大约经过2-3个小时之后，当OD600接近0.6-1.0时，取2mL菌液离心，去上清液，得到菌体沉淀后放-20℃保存，作为SDS-PAGE对照样品。
然后，加入100mM IPTG 至终浓度1mM（IPTG/培养基体积=1/100），37℃培养4h后离心得沉淀菌体（4℃4000g，20min），-20℃。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位与功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不与哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株与与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性与构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。
（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达实验
原核表达实验原核表达操作流程实验概要本实验介绍了原核表达的具体操作流程，包括：外源基因的诱导表达，大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化。
实验原理1. E. coli 表达系统E. coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E. coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2. 外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
主要试剂1. 诱导表达材料1) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌2) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
3) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2. 大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1) 酶溶法a. 裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaClb. 50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
c. 10 mg / mL 溶菌酶。
d. 脱氧胆酸。
e. 1 mg / mL DNase I。
2) 超声破碎法a. TE 缓冲液。
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实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。
引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。
1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。
称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。
（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。
（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。
4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。
DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。
（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。
（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。
将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。
（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，弃滤液。
（5）将柱子装回收集管中，加入700μl SPW wash buffer，10000×g离心1min，弃滤液。
（6）重复步骤（5）一次。
（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。
13000×g离心2min，洗脱DNA。
1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。
质粒抽提采用OmegaBio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：1 取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。
划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm 培养12h。
2 加入200μl GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。
3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。
4 加入200μl Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。
5 往重悬液中加入200μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。
6 加入300μl Solution Ⅲ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。
室温下，10000×g离心10min。
7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。
室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
8 将柱子装回收集管中，加入500μl HiBind buffer。
室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
9 将柱子装回收集管中，加入700μl Wash Solution。
室温下，10000×g离心1min。
重复该步骤一次。
10 重复步骤9一次。
11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。
13000×g离心2mi。
跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。
-20℃冰箱中保存备用。
1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37℃水浴反应4h，反应体系如下：表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：表达载体15μl cofilin-1片段10μl92μl10×H Buffer 2μl 10×H Buffer（ＬＭＨＫＴ代表缓冲液中盐浓度或成分不同）XhoI 1μl XhoI 1μlNdeI 1μl NdeI 1μlddH2O 1μl ddH2O 6μlTotal 20μl Total 20μl1.4 酶切产物的回收酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。
步骤同PCR反应产物胶回收。
1.5 连接反应将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收产物于16℃连接24h，反应体系如下：cofilin-1 cDNA酶切回收产物18μlpET-28a酶切回收产物6μl10× T4 DNA ligase buffer 3μlT4连接酶3μlTotal 30μl1.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）1 于-20℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37℃恒温箱中培养过夜。
挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。
2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，180rpm，培养2-3h，当OD600=0.3~0.5时，停止摇菌。
3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min 左右。
4 4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80℃保存备用。
1.7 连接产物的转化1 将感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。
2 将16μl连接产物加入100μL感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。
3 将Eppendorf管放入42℃水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。
4 于EP管中加入400μl LB培养基，置于摇床上，37℃，50rpm培养45min。
5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20μg)，置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
1.8 双酶切鉴定重组子1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，37℃，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。
3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37℃水浴箱中水浴4h。
反应体系如下：质粒pET28a-cofilin-1 1μl10×H Buffer 1μlXhoI 1μlNdeI 1μlddH2O 6μlTotal 10μl4 电泳分析。
将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析1.8.2 重组子的序列分析挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃、180rpm过夜12h，15％甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。
并送样品英骏公司测序。
2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备具体方法和步骤同1.6。
2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。
于LB固体培养基（含卡那霉素20μg）上划平板，并筛选阳性单克隆。
2.3 cofilin-1的诱导表达挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养至OD600=0.8～1.0。
取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导β-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h。