原核表达步骤

实验方法与步骤

1 表达质粒的构建及测序分析

1.1 cofilin-1的片段的准备

1.1.1 引物设计

根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。引物如下：

引物名称序列

F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′

R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 cofilin-1片段PCR

1 反应体系：

2.5μl

KOD polymerase(3’-5’核酸外

切酶活性)

KOD polymerase buffer 5μl

MgSO4 2.5μl

DMSO（“万能溶剂”） 2.5μl

dNTPMixture 5μl

PrimerF（底物） 1.5μl

PrimerR 1.5μl

Template（模板）5μl

ddH2O 25μl

Total 50μl

2PCR反应条件：

①94℃预变性3min

②94℃退火30s

③65℃延伸40s

④68℃40s

⑤go to②30个循环

⑥68℃5min

⑦4℃forever

3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测

（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。

（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。

（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。

4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：

（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。

（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。

（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。

（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，

弃滤液。

（5）将柱子装回收集管中，加入700μl SPW wash buffer，10000×g离心1min，弃滤液。

（6）重复步骤（5）一次。

（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2min，洗脱DNA。

1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提

接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。质粒抽提采用Omega

Bio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：

1 取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素

100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm 培养12h。

2 加入200μl GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。

3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。

4 加入200μl Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。

5 往重悬液中加入200μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。

6 加入300μl Solution Ⅲ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，10000×g离心10min。

7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。

8 将柱子装回收集管中，加入500μl HiBind buffer。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。

9 将柱子装回收集管中，加入700μl Wash Solution。室温下，10000×g离心1min。重复该步骤一次。

10 重复步骤9一次。

11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2mi。

跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。-20℃冰箱中保存备用。

1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切

用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37℃水浴反应4h，反应体系如下：

表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：

表达载体15μl cofilin-1片段10μl

92μl10×H Buffer 2μl 10×H Buffer（Ｌ

ＭＨＫＴ代表缓

冲液中盐浓度或

成分不同）

XhoI 1μl XhoI 1μl

NdeI 1μl NdeI 1μl

ddH2O 1μl ddH2O 6μl

Total 20μl Total 20μl

1.4 酶切产物的回收

酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。步骤同PCR反应产物胶回收。

1.5 连接反应

将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收

产物于16℃连接24h，反应体系如下：

cofilin-1 cDNA酶切回收产物18μl

pET-28a酶切回收产物6μl