酵母单杂交-实验步骤总结
酵母单杂交实验流程
酵母单杂交实验流程概述：酵母单杂交实验是一种常用的研究方法，用于确定基因的遗传方式和相互作用。
通过将两个不同的酵母菌株进行杂交，可以获得具有两个不同亲代特征的杂交子代。
本文将详细介绍酵母单杂交实验的流程。
实验材料和设备准备：1. 两个不同的酵母菌株，分别标记为A和B。
2. 酵母菌培养基。
3. 酵母菌培养皿。
4. 酵母菌细胞计数板。
5. 显微镜和显微镜玻片。
6. 移液器和移液管。
7. 离心机。
实验步骤：1. 预培养酵母菌株：将酵母菌株A和B分别接种到含有适宜培养基的培养皿中，分别培养过夜，以确保菌株处于最佳生长状态。
2. 制备酵母菌株的细胞悬液：用适量的酵母菌培养基将菌落转移到离心管中，用移液管充分混合。
然后，使用显微镜和细胞计数板计数酵母菌细胞的浓度。
调整浓度至所需的菌数。
3. 杂交：将菌株A和B的细胞悬液按照一定比例混合，然后在培养皿中滴加混合液。
确保混合液均匀分布在培养皿表面。
4. 孵育：将培养皿置于恒温培养箱中，培养一定时间，以便杂交子代形成。
5. 筛选杂交子代：从培养皿中挑选出杂交子代的克隆菌落。
使用显微镜检查克隆菌落的形态，选择具有两个亲代特征的菌落。
6. 单克隆培养：将所选菌落分别转移到新的培养皿中，培养过夜。
确保每个菌落都是来自单个细胞的纯系。
7. 验证杂交子代：对单克隆菌落进行遗传分析，以验证杂交子代的基因遗传方式。
可以使用多种遗传分析方法，例如基因重组实验、基因敲除实验等。
8. 结果分析：对杂交子代的遗传方式和相互作用进行统计和分析。
根据结果可以推断出酵母菌株A和B的基因遗传方式和相互作用。
实验注意事项：1. 实验过程中要保持无菌操作，避免外源性污染。
2. 实验室应保持干净整洁，设备要经过正确的消毒和清洗。
3. 实验过程中要注意安全，避免接触有害物质和操作过程中的伤害风险。
4. 实验结果应进行统计分析，并与控制组进行比较，以确保结果的准确性和可靠性。
总结：酵母单杂交实验是一种重要的遗传研究方法，通过将两个不同的酵母菌株进行杂交，可以获得具有两个不同亲代特征的杂交子代。
酵母单杂交步骤
酵母单杂交步骤酵母单杂交是一种常用的遗传实验方法，通过将两个不同的酵母株进行杂交，可以研究它们的基因互作关系。
本文将详细介绍酵母单杂交的步骤。
一、准备工作1.选择合适的酵母株：选择两个不同的酵母株，一个为“诱饵”（bait）株，另一个为“猎物”（prey）株。
这两个株系需要有明显的表型差异，以便于筛选出杂交后产生的重组子代。
2.构建诱饵和猎物表达载体：将目标基因克隆到表达载体中，使其能够在酵母细胞中表达。
其中诱饵表达载体需要加入转录激活域（transcription activation domain），而猎物表达载体则需要加入DNA结合域（DNA binding domain）。
3.筛选适当的培养基：选择适当的培养基来培养诱饵和猎物细胞，并且要添加相应抗生素以确保只有带有目标表达载体的细胞能够生长。
二、进行单杂交实验1.将诱饵和猎物细胞分别培养到对数生长期，并收集细胞。
2.将诱饵和猎物细胞混合在一起，并进行共同培养。
在共同培养的过程中，两种细胞会发生杂交，形成重组子代。
3.收集重组子代，并进行筛选。
可以使用选择性培养基来筛选出带有目标表达载体的重组子代，进一步筛选出具有表型差异的重组子代。
4.验证重组子代中目标基因的相互作用关系。
可以使用多种方法来验证，如β-galactosidase报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。
三、结果分析通过对单杂交实验结果进行分析，可以得到两个不同酵母株之间的相互作用关系图谱。
这些相互作用关系图谱可以用于预测蛋白质相互作用网络，并进一步研究这些蛋白质在细胞内的功能和调控机制。
总结：酵母单杂交是一种常用的遗传实验方法，通过将两个不同的酵母株进行杂交，可以研究它们的基因互作关系。
该实验步骤包括准备工作、进行单杂交实验和结果分析。
在进行单杂交实验时，需要注意选择合适的酵母株、构建表达载体和筛选适当的培养基。
通过对单杂交实验结果进行分析，可以得到两个不同酵母株之间的相互作用关系图谱，为研究蛋白质相互作用网络提供了基础。
酵母单杂交-实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。
大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。
首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。
（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。
（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。
（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
酵母单杂交实验流程和原理
酵母单杂交实验流程和原理下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母单杂实验步骤
酵母单杂实验步骤酵母是一种微生物，常被用于食品发酵和酿酒过程中。
酵母单杂实验可以帮助我们更好地了解酵母的特性和行为。
下面是进行酵母单杂实验的步骤：第一步：准备所需要的实验器材和试剂。
包括培养皿、琼脂平板、酵母菌种、无菌的培养基、移液器等。
第二步：将培养皿和琼脂平板进行消毒处理。
使用高温和紫外线辐射等方法杀灭表面的微生物，保证实验的无菌环境。
第三步：准备酵母菌种。
从酒厂、面包店等地获取新鲜的酵母菌，用无菌的移液器将酵母悬液移到培养基的琼脂平板上。
第四步：将酵母菌培养在琼脂平板上。
将平板倒置放在恒温箱中，温度控制在30℃左右。
酵母菌在琼脂平板上生长，形成菌落。
第五步：观察菌落的形态和特征。
通过裸眼观察和放大镜观察菌落的大小、颜色、形状等，记录并比较不同菌落的特征。
第六步：选择出具有单一菌种的菌落。
用无菌的移液器将所选择的菌落转移到新鲜的琼脂平板上，以分离并纯化单一菌种。
第七步：进行酵母单杂实验。
在新鲜的琼脂平板上划线或者用无菌的吸管在培养基上进行划线，用已培养好的单一菌种接种。
第八步：观察和记录酵母菌的生长情况。
在指定的时间内，观察酵母菌在琼脂平板上的生长情况，包括生长速度和菌落的形态等，记录并分析实验结果。
第九步：对实验结果进行数据处理和分析。
根据实验结果，进行数据统计和图表绘制，比较不同菌落的差异。
酵母单杂实验是了解酵母菌的生长特性和行为的有效方法。
通过该实验，我们可以了解不同菌落的差异，为研究酵母菌的应用提供依据。
同时，该实验还可以培养学生的实验操作能力和科学观察能力，对培养科学素养有重要意义。
酵母单杂交原理
酵母单杂交原理
酵母单杂交原理是一种用于确定两个菌株是否有性交配能力的实验方法。
该方法基于酵母细胞具有两个性态（a和α），分
别具有不同的补体性别。
酵母菌株通常分为两种性别，一种是补体型a，另一种是α型。
两个不同性别的酵母菌株可以繁殖，形成两性型细胞。
要进行酵母单杂交实验，首先需要准备两种不同性别的酵母菌株，分别称为a型和α型。
然后，将这两个菌株混合在一起，
使它们发生性交配。
在实验开始之前，先将a型酵母菌株接种到一块固体培养基上，形成一个小斑点。
接着，取α型酵母菌株的细胞液，加入到已经接种了a型细胞的培养基上。
接种后的培养皿放置在适当的条件下培养，使两个菌株可以进行性交配。
在性交配过程中，a型和α型酵母细胞会发生核融合，将它们
的细胞核合并成单一的细胞。
这个过程称为杂交。
经过一段时间的培养，培养皿中的细菌会繁殖产生大量的后代细胞。
这些后代细胞又被称为单杂合子，因为它们只具有一个性态。
为了确定是否发生了性交配，需要进行筛选。
一种常用的方法是在培养基中添加特定的选择标记物，如抗生素。
只有发生性交配的细胞能够生存下来，而未发生性交配的细胞会被选择标
记物杀死。
通过观察培养基上的生长情况，可以确定是否有单杂合子的出现。
如果有单杂合子的出现，证明两个菌株具有性交配能力；如果没有单杂合子的出现，证明两个菌株无法发生性交配。
酵母单杂交实验是分析酵母菌株性别和性交配能力的重要方法，对于理解酵母的遗传特性和研究基因功能具有重要意义。
酵母mating杂交实验步骤_概述及解释说明
酵母mating杂交实验步骤概述及解释说明1. 引言1.1 概述酵母mating杂交实验是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌的遗传性质和基因表达调控。
通过选择合适的酵母菌品种，在特定培养条件下将两个不同类型的酵母菌细胞进行配对杂交，以观察和分析它们在配子形成过程中所产生的遗传变异和交互作用。
这些研究可为我们进一步了解细胞遗传学、基因功能及其调控机制提供重要线索。
1.2 文章结构本文将介绍酵母mating杂交实验的整体步骤及详细说明，并从实验背景、酵母菌种类与选择、实验步骤简介等方面进行阐述。
随后，将对实验结果与数据进行观察和收集，并进行相应的数据分析与解释。
最后，将讨论相关问题并总结实验内容，提出进一步研究方向建议以及评述该实验的研究意义与应用前景。
1.3 目的本文旨在全面概述并详细解释酵母mating杂交实验的步骤，帮助读者对该实验有一个清晰的了解，为相关研究提供理论基础和实验依据。
通过本文的阐述，读者将能够理解并掌握酵母mating杂交实验的关键要点，从而在自己的科研工作中运用和探索该实验方法的潜力。
2. 酵母mating杂交实验步骤概述：2.1 实验背景在遗传学研究中，酵母(mating杂交)杂交实验是一种常用的技术手段。
酵母(mating杂交)指的是两个互补的性别型酵母细胞（通常为α型和a型）进行交配产生新的杂合子。
这一实验可以用于研究基因座位的排列、重组率以及基因与表现型之间的关系等。
2.2 酵母种类与选择在进行酵母(mating杂交)实验时，需要选择合适的酵母菌株作为实验对象。
常见的酵母物种如Saccharomyces cerevisiae（普通酿造酵母）、Schizosaccharomyces pombe（积参精致）等都可被用于此实验。
根据具体研究目的，选择不同类型的酵母菌株。
2.3 实验步骤简介下面将简要介绍酵母(mating杂交)实验的主要步骤：第一步：准备培养基和试剂首先，准备含有营养物质丰富、适合酵母生长的培养基。
酵母单杂交步骤
酵母单杂交步骤引言酵母单杂交是一种重要的遗传实验技术，用于研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
通过单杂交技术可以将两个不同的酵母菌株进行杂交，并产生新的杂交子代。
本文将详细介绍酵母单杂交的步骤及相关操作。
实验准备在进行酵母单杂交实验之前，需要准备以下实验材料和设备：1.不同的酵母菌株：至少选择两个不同的酵母菌株进行杂交。
2.酵母培养基：用于培养酵母菌的基础培养基，如YPD培养基。
3.酵母选择培养基：含有选择性抗生素的培养基，用于筛选杂交子代。
4.培养皿和试管：用于培养酵母菌和进行杂交操作。
5.离心机：用于离心培养酵母菌和分离细胞。
6.微量移液器和移液管：用于精确的液体传输操作。
实验步骤步骤一：制备酵母菌预培养液1.从酵母菌保存液中取出所需的酵母菌株，接种到含有YPD培养基的试管中。
2.在摇床上以30°C、200 rpm的条件下培养过夜。
步骤二：制备酵母菌重悬液1.将酵母菌预培养液离心10分钟，以1000 rpm离心速度。
2.弃掉上清液，留下酵母菌菌体沉淀。
3.加入适量的无菌蒸馏水，将菌体沉淀重悬均匀。
步骤三：制备酵母菌孢子悬液1.从酵母菌重悬液中取出适量的液体，转移到含有酵母孢子培养基的培养皿中。
2.在30°C下培养48小时，待看到大量孢子形成。
步骤四：混合酵母菌孢子1.分别从两个不同的酵母菌孢子悬液中取一小部分液体，放入一个新的培养皿中。
2.轻轻拿起培养皿，并旋转使混合液均匀混合。
步骤五：涂布混合孢子液1.将涂布液均匀涂布在含有选择性酵母菌培养基的培养皿上。
2.使用无菌的拇指或涂布棒将混合孢子液均匀涂布在培养皿表面。
步骤六：培养筛选杂交子代1.将涂布好的培养皿置于30°C下培养数天。
2.观察培养皿上是否有酵母菌子代出现，根据不同的选择标记进行筛选。
结论通过以上步骤，我们成功进行了酵母单杂交实验，并产生了新的杂交子代。
这些杂交子代可以用于进一步研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
酵母单杂交原理及步骤
酵母单杂交原理及步骤
嘿，你问酵母单杂交原理及步骤呀，那咱就来唠唠。
先说这酵母单杂交的原理哈。
简单来说呢，就是利用酵母这种小生物来帮忙找能和特定DNA 序列结合的蛋白质。
就像在一堆人里找和某个明星关系好的人一样。
酵母就像是个中间人，帮我们找出那个特定的蛋白质。
那步骤呢，首先得准备好各种东西。
要有酵母细胞啦，还有要研究的DNA 序列啦，还有可能和这个DNA 序列结合的蛋白质库啥的。
就像做饭得先准备好食材一样。
接着呢，把那个要研究的DNA 序列放到酵母细胞里，让它在酵母细胞里待着。
就像给这个DNA 序列找了个小房间。
然后呢，把那个蛋白质库也放到酵母细胞里。
让这些蛋白质在酵母细胞里到处逛逛，看看有没有能和那个DNA 序列结合的。
这就像在一个大商场里找自己喜欢的东西一样。
如果有蛋白质和那个DNA 序列结合了，酵母细胞就会有一些变化。
比如说会发出一种特殊的信号啦，或者长得不
一样啦。
我们就可以通过这些变化来判断哪个蛋白质和DNA 序列结合了。
我给你举个例子哈。
我有个朋友在实验室做酵母单杂交实验。
他们想找能和一个特定的植物基因结合的蛋白质。
他们就按照这些步骤，认真地准备材料，小心地操作。
经过一段时间的努力，他们终于找到了几个可能和那个基因结合的蛋白质。
这就为他们进一步研究这个基因的功能提供了重要线索。
所以啊，酵母单杂交虽然有点复杂，但是只要掌握好原理和步骤，就能发挥很大的作用哦。
酵母单杂交实验dna载体构建流程
酵母单杂交实验DNA载体构建流程1.引言酵母单杂交实验是一种常用的研究基因互作或蛋白相互作用的方法。
在酵母单杂交实验中，需要构建适合该实验的DN A载体。
本文将详细介绍酵母单杂交实验DN A载体的构建流程。
2.实验原理在酵母单杂交实验中，需要构建包含目标基因的D NA载体。
DN A载体的构建通常由以下几个步骤组成：2.1D N A提取首先，从参与实验的酵母菌株中提取D NA。
可以使用商业D NA提取试剂盒或自制D NA提取方法。
确保提取的D NA质量和纯度满足实验要求。
2.2扩增目标基因利用聚合酶链反应（P C R）方法，从酵母菌株的基因组DN A中扩增目标基因。
设计合适的引物，使扩增出的目标基因片段与DN A载体连接所需的限制性内切酶切位点相匹配。
2.3D N A片段连接将扩增出的目标基因片段与适当的DN A载体进行连接。
使用限制性内切酶切割目标基因片段和DN A载体，使它们产生互补的粘性末端，在适当的缓冲液中对其进行连接。
使用DN A连接酶催化连接反应，形成目标基因片段与D NA载体的连接产物。
2.4转化酵母菌将连接产物转化到酵母菌中。
通过电击法或化学法将连接产物导入酵母菌细胞中。
待酵母菌细胞经过恢复和选择后，转化出的菌落中将含有目标基因的DN A载体。
2.5验证构建成功进行酵母单杂交实验前，需要对构建的DN A载体进行验证。
可以通过限制性内切酶切、PC R扩增、测序等方法验证目标基因的正确连接和插入。
3.实验步骤根据上述原理，下面给出酵母单杂交实验D NA载体构建的详细步骤：3.1D N A提取-从酵母菌培养物中收集菌落。
-使用D NA提取试剂盒或自制方法提取DN A。
-检测D NA的质量和纯度，确保满足实验要求。
3.2目标基因扩增-根据目标基因序列设计引物。
-进行P CR反应，扩增目标基因片段。
3.3D N A片段连接-利用限制性内切酶切割扩增出的目标基因片段和DN A载体。
-在相关缓冲液中进行D NA片段连接反应。
酵母单杂交技术原理和步骤
酵母单杂交技术原理和步骤
酵母单杂交技术是一种用于研究基因功能和相互作用的实验方法。
其原理是通过将感兴趣的基因从一个酵母菌株转移到另一个酵母菌株中，然后观察基因在新环境中的表现，以了解基因的功能和相互作用。
酵母单杂交技术的步骤如下：
1. 选择两个不同的酵母菌株，一个作为“饮食菌株”，另一个作为“背景菌株”。
饮食菌株中含有一种特殊的酵母菌株，称为“杂交酵母菌株”，它能提供必需的营养物质和其他辅助元件。
2. 将感兴趣的基因从待测菌株（称为“探针菌株”）中与载体DNA分离。
载体DNA是一种DNA片段，具有选择性标记，用于将基因转移到杂交酵母菌株中。
3. 将载体DNA与杂交酵母菌株进行转化，使杂交酵母菌株携带待测基因。
4. 将探针菌株和杂交酵母菌株接种到含有饮食菌株的培养基中。
培养基中含有缺少特定营养物质的成分，仅探针菌株和杂交酵母菌株能在该培养基中生长。
5. 培养一段时间后，观察哪些菌株能在培养基中生长。
如果杂交酵母菌株能够在缺少特定营养物质的培养基中存活和生长，说明转移的基因在酵母菌株中是功能性的。
通过比较不同探针菌株转移到杂交酵母菌株中的生长情况和表型，可以研究基因功能和相互作用。
通过引入其他基于选择性标记的载体DNA，可以进一步筛选和鉴定与转移基因相互作用的蛋白质或其他分子。
这种基于酵母单杂交的技术被广泛用于研究蛋白质相互作用，功能组学和基因调控网络。
酵母单杂交实验流程和原理
酵母单杂交实验流程和原理嘿，咱们今天得聊聊这酵母单杂交实验。
说起来，这可是个高大上的实验，但听我给你一讲，保管你也能明白个大概。
首先，咱得知道酵母单杂交实验是干啥的。
这实验主要是用来研究基因和蛋白质之间的关系。
简单说，就是想知道一个基因编码的蛋白质具体是啥样，是啥功能。
这就像你去查一个人的身份，得先找到身份证，然后才能知道他的详细信息。
好，说回实验。
这酵母单杂交实验啊，关键得有几个东西：酵母菌、待测基因的DNA、已知基因的DNA和报告基因。
别看这东西多，操作起来还挺简单。
首先，咱得准备好酵母菌。
这酵母菌啊，就像个小工厂，能按照咱的要求合成蛋白质。
然后，把待测基因的DNA和已知基因的DNA分别切成一小段，就像裁缝裁剪布料一样。
接下来，把这俩小段DNA接在一起，就像两个零件组装在一起。
这俩零件啊，就是待测基因和已知基因的DNA。
然后，把这组装好的DNA送到酵母菌工厂里去，让酵母菌来加工。
这时，如果待测基因和已知基因是同源基因，那么酵母菌就能合成出报告基因编码的蛋白质。
这报告基因啊，就像个小灯泡，能发出光来。
如果合成了蛋白质，小灯泡就亮了，这就是我们想要的。
可要是待测基因和已知基因不是同源基因，那酵母菌就加工不出来报告基因编码的蛋白质，小灯泡就不会亮。
这样一来，我们就能通过观察小灯泡的亮与不亮，来判断待测基因和已知基因是否同源。
好啦，这酵母单杂交实验的流程和原理就介绍到这里。
其实，这个实验说复杂也复杂，说简单也简单。
关键是要掌握好操作步骤，还有耐心。
就像咱们做菜一样，得一步一步来，才能做出美味的佳肴。
嘿，说起来，这实验还真是挺有趣的，不妨自己也试试看吧！。
酵母单杂交实验原理
酵母单杂交实验原理是基于酵母细胞中的转录因子Gal4和对应的启动子GAL1/10，将目标DNA片段插入到GAL1/10启动子上游，在酵母细胞中表达成融合蛋白，与BD-融合蛋白结合形成一个复合物，从而实现对DNA靶点的筛选。
酵母单杂交实验的具体步骤如下：
1.构建两个重组质粒，其中一个含有待测核酸序列、
GAL1/10启动子和选择性标记；另一个质粒含有
BD-Gal4融合蛋白。
2.在酵母细胞中转化这两个质粒，使其在同一细胞中表达。
3.在选择性培养基上筛选转化后的酵母细胞，筛选出可生
长的克隆，这些克隆代表了BD-Gal4蛋白和目标DNA
片段的相互作用。
4.对筛选出来的克隆进行进一步验证，如确认目标DNA
片段是否真正结合到BD-Gal4蛋白上，以及进一步鉴
定筛选出来的DNA靶点。
生化复习资料：酵母单杂交技术
酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method）一、原理酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。
该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。
将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。
进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。
根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
二、实验步骤①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因；②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度；③提取总RNA，合成c DNA双链；④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆；⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆；⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。
如可进一步分析DNA确切的结合位点。
三、图片分析1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。
故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。
2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。
取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。
证实15mM[3-AT]的选择是正确的。
酵母单杂交 实验步骤总结
酵母单杂交实验步骤总结酵母单杂交实验步骤总结1pbait-abai载体的构建（酵母报道子的构建）备注：酵母报导子（pbait-abai）涵盖目的双键促进作用元件的一个或多个拷贝，且填入至pabai载体abair报告基因的上游。
大量研究说明最有效率的构筑应当涵盖目的dna三个以上的首尾相连接的拷贝。
首尾相连接的拷贝产生方式很多，但对于长度大于20bp的调控元件，人工合成寡核苷酸就是最便利可信的途径。
（1）设计并制备涵盖目的序列的两条逆向平行的寡核苷酸序列，且两端加之与pabai载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用tebuffer熔化寡核苷酸至终浓度100?mol/l。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50?mol/l）。
（4）95?c保温30s，去除二级结构。
（5）72?c保温2min，37?c保温2min，25?c保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20?c冰箱备用。
（7）酶乌1?lpabai载体，用凝胶废旧提纯或柱提纯的方式提纯酶乌产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5?mol/l。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pabai载体（50ng/?l）1.0?lannealedoligonucleotide（0.5?mol/l）1.0?l10×t4dnaligasebuffer1.5?lbsa（10mg/ml）0.5?lnuclease-freeh2o10.5?lt4dnaligase（400u/?l）0.5?l总体积15?l注：如果有必要，可用1?lnuclease-freeh2o代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温置放相连接3h，转变ecoli，使用常规方法检测阳性克隆。
酵母单杂交（Y1H）试验
酵母单杂交（Y1H）试验1.叶绿素荧光参数：Fv/Fm反映植物的潜在最⼤光合能⼒2. 酵母单杂交：是研究DNA与蛋⽩质之间的关系将编码待测蛋⽩和AD的融合载体导⼊细胞，如果靶蛋⽩与顺势作⽤元件结合，那么报告基因表达。
诱饵是启动⼦，想找上游调控蛋⽩，猎物是蛋⽩将编码待测蛋⽩和AD的融合载体导⼊细胞，如果靶蛋⽩与诱饵结合，那么报告基因表达。
3.motif：真核⽣物基因在⽆转录因⼦时处于不表达状态，只有转录因⼦结合到识别DNA序列上后，基因表达。
转录因⼦结合在基因的启动⼦区域，启动转录。
转录因⼦的结合位点：与转录因⼦结合的DNA（motif）4.单杂交筛选应⽤（pAbAi 体系）单杂原理：诱饵序列克隆到pAbAi 载体形成pBait-AbAi，通过同源重组整合到Y1Hgold 基因组上，当猎物蛋⽩与诱饵发⽣互作后，会激活重组酵母菌AbAr基因的表达，使酵母菌对⾦担⼦素产⽣抗性，以此来筛选互作蛋⽩。
⾦担⼦素A（AureobasidinA，AbA）是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No.R106 中分离出来的环酯肽类抗⽣素，具有很强的抗真菌能⼒。
5.酵母选择性营养缺陷型培养基缺陷培养基（SD⼀缺⼆缺三缺四缺五缺培养基）的配⽅，就是在完全培养基的配⽅上去除对应的缺陷型组分。
6.凝胶迁移或电泳迁移率实验 (EMSA)研究核酸与蛋⽩质相互作⽤的技术。
当蛋⽩与特异性DNA或RNA结合后，其在凝胶中的迁移率将⼩于未结合蛋⽩的核酸。
7.染⾊质免疫沉淀 (ChIP) 测定在体内研究核酸与蛋⽩质相互作⽤的技术。
8.双荧光素酶荧光素酶与底物结合发⽣化学发光反应。
9.修改图⽚中的字AI10双荧光素酶 (LUC) 测定酶的亮度与基因的表达⽔平有关。
荧光素酶（Luciferase）是⽣物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的⼀类酶的总称。
荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引⼊了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞⽣长状况、细胞数⽬以及转染效率带来的⼲扰，起到校正的作⽤，从⽽使实验结果更为可靠两者可催化各⾃的底物发⽣氧化作⽤产⽣⽣物荧光，产⽣的荧光数值⼤⼩即表⽰了两种酶的表达量多少。
酵母单杂交 实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。
大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。
首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。
（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。
（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。
（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
酵母单杂交的原理与应用实例
酵母单杂交的原理与应用实例一、本文概述酵母单杂交（Yeast One-Hybrid）是一种强大的分子生物学技术，它利用酵母细胞的转录调控机制来研究DNA与蛋白质之间的相互作用。
这种技术基于酵母细胞的转录因子与DNA结合的特性，通过将感兴趣的蛋白质（如转录因子）与报告基因（如抗性基因或荧光蛋白基因）连接，可以在酵母细胞内筛选出与目标DNA结合的蛋白质。
酵母单杂交不仅具有高灵敏度和高通量筛选的优势，还可以用于研究基因表达调控、蛋白质与DNA相互作用机制、以及新药物和新材料的发现等领域。
本文将详细介绍酵母单杂交的原理、实验操作及应用实例，以期为相关领域的研究人员提供有益的参考。
二、酵母单杂交技术的原理酵母单杂交技术是一种基于酵母转录因子和DNA相互作用的遗传学方法，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用，以及筛选和鉴定与特定DNA序列结合的蛋白质。
其基本原理是将待研究的DNA序列（如启动子、增强子等）与报告基因（如荧光素酶、抗性基因等）融合，构建成报告质粒。
然后，将报告质粒与表达特定转录因子的表达质粒共转化到酵母细胞中。
如果转录因子能够与报告质粒中的DNA序列结合，就会激活报告基因的表达，从而通过检测报告基因的表达情况来判断转录因子与DNA序列的相互作用。
酵母单杂交技术的关键在于利用了酵母细胞内的转录调控机制。
在酵母细胞中，转录因子的作用是通过与DNA序列结合，调控基因的转录水平。
当转录因子与DNA序列结合时，它会与RNA聚合酶II等转录相关蛋白形成转录起始复合物，从而启动基因的转录。
因此，通过构建包含特定DNA序列的报告质粒，并在酵母细胞中共表达转录因子，就可以观察到转录因子对报告基因表达的调控作用。
酵母单杂交技术具有灵敏度高、操作简便、高通量等优点，因此在基因表达调控、蛋白质与DNA相互作用研究等领域得到了广泛应用。
通过酵母单杂交技术，可以筛选出与特定DNA序列结合的转录因子，研究其调控机制，也可以用于基因功能注释、基因表达调控网络构建等方面。
最新酵母单杂交-实验步骤总结
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。
大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。
首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。
（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。
（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。
（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
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1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。
大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。
首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。
（1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。
（2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。
（4）95 ︒C保温30 s，去除二级结构。
（5）72 ︒C保温2 min，37 ︒C保温2 min，25 ︒C保温2min。
注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。
退火后的产物可贮存在-20 ︒C冰箱备用。
（7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。
注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。
（8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。
（9）在连接反应管中加入如下成分：pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μLannealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μLBSA（10 mg/mL）0.5 μLNuclease-free H2O 10.5 μLT4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL总体积15 μL注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
注：可用酶切或测序进行检测。
2 质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图（1）用BstB I或者Bbs I酶切2 μL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。
（2）按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用1 μl酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。
（3）稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。
3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCR检测阳性克隆，用Y1HGold的单克隆做阴性对照。
（4）在PCR管中加25 μl PCR-grade H2O。
（5）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。
将枪头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。
注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的进行。
如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。
（6）向每个管中加入25 μl Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。
每个PCR管中现已含有如下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 μlH2O/yeast 25 μl总体积50 μl（7）按下述程序进行PCR反应；95 ︒C 1 min98 ︒C 10 s55 ︒C 30 s 30 cycles68 ︒C 2 min（8）取5 μl PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析。
注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb。
图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是：阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35 kb+insert size（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。
30 ︒C孵育3 d后，将平板置于4 ︒C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。
（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用 1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 ︒C保存。
3 检测诱饵菌株AbA r基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达水平也不相同。
例如：p53-AbAi对照的最低aureobasidin A抑制浓度为100 ng/ml。
注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。
因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbA r基因的表达情况十分重要。
所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。
（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（大约2000个细胞/100 μl）。
（2）在下述培养基上分别涂布100 μl重悬后的菌液，30 ︒C培养2-3 d。
SD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）预期结果如下所示：表1 AbA r基因预期本底表达结果[AbA]/（ng/mL）Y1HGold[p53-AbAi]克隆数Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数0 约2000 约2000100 0 Bait dependent150 0 Bait dependent200 0 Bait dependent（3）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的生长。
注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mL。
然而，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbA r基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。
4 文库cDNA的合成提取试材总RNA，进行反转录合成cDNA。
合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。
（1）cDNA第一链的合成①准备高质量的poly A和/或总RNA，用human placenta poly A+RNA作为阳性对照。
注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。
②在微量离心管中加入如下反应物：RNA模板（0.025-1.0 μg poly A和/或0.10-2.0 μg总RNA）1-2 μl CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物 1.0 μl Deionized H2O （使总体积达到4.0 μl）1-2 μl 总体积 4.0 μl在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 μl（1 μg）control poly A+RNA。
③72 ︒C孵育2 min。
④冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤⑤中的试剂。
⑤每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。
5×first-strand buffer 2.0 μlDTT（100 mmol/L） 1.0 μldNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 μlSMART M-MLV RT 1.0 μl总体积 5.0 μl注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。
此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。
⑥如果用的是CDS III/6随机引物，25-30 ︒C保温10 min。
如果用的是CDS III 引物，省略此步，进行步骤⑦。
⑦42 ︒C保温10 min。
⑧加入1 μl SMART III oligo，充分混合，42 ︒C保温1 h。
⑨75 ︒C保温10 min终止第一链的合成。
⑩降至室温，加入1 μl RNase H（2 U）。
11 37 ︒C保温20 min。
12 cDNA第一链合成产物应于-20 ︒C保存，可用3个月。
（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热循环数。
使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。
表2 RNA量与最佳热循环数总RNA/μg Poly A+RNA/μg 循环数1.0-2.0 0.5-1.0 15-200.5-1.0 0.25-0.5 20-220.25-0.5 0.125-0.25 22-240.05-0.25 0.025-0.125 24-26⑴LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做2个100 μl体系，对照做1个100 μl体系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 μlDeionized H2O 70 μl10×advantage 2 PCR buffer 10 μl50×dNTP mix 2 μl5’RACE引物 2 μl3’RACE引物 2 μlMelting solution 10 μl50×advantage 2 polymerase mix 2 μl总体积100 μl⑵按照以下程序进行PCR反应：1个循环95 ︒C 30 sX个循环95 ︒C 10 s68 ︒C 6 min1个循环68 ︒C 5 min⑶取7 μl PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA ladder。
（2）使用CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA⑴为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。
⑵将纯化柱翻转几次，充分悬浮gel matrix。
⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。
⑷将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。
⑸将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。
注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA。