拟南芥种子的消毒 - 360文档中心

[转载]拟南芥培养

[转载]拟南芥培养一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。

MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm 的培养皿用12.5ml。

加培养基时先将凝固的培养基用微波炉高温5分钟左右至全部解冻，然后慢慢冷却至不太烫手时倒板，如要加潮霉素等抗生素也是在此次加，加入后摇匀然后倒板。

倒板后至自然冷却即可铺种，如水分较多或板不够硬，亦可于倒板后将培养皿盖打开晾10分钟左右（此时超净台要关闭）。

种子的杀菌、清洗、铺板等过程在超净工作台上无菌操作，操作者进入超净工作台要用酒精棉球擦拭手、器具、超净台，防止感染细菌、真菌。

二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／LⅣA肌醇 20 000ⅣB烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

园艺-拟南芥侵染和筛选的流程

1摇菌（1）小摇：在超净工作台中取出无菌离心管，加入4ml纯净LB液体培养基，加入4ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入8ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入阳性菌菌液，摇匀；在摇床中28℃培养2天；（2）大摇：在250ml三角瓶中加入150ml纯净LB液体培养基，加入150ul 50mg/ml浓度的卡那霉素，加入300ul 10mg/ml浓度的利福霉素，加入1.5ml菌液，过夜摇菌。

2配侵染液（1）1L超纯水中加入10g蔗糖及40ul表面活性剂Silwet L-77，磁力加热搅拌器搅拌均匀；（2）大摇后的菌液用分光光度计测OD600，用离心后的上清液作为对照，菌液OD600在0.8~1.0之间时，可以进行下一步；（3）将菌液倒入50ml圆底离心管中，常温4000g离心10分钟，收集菌株；（4）倒掉上清，加入少许侵染液，用移液器把菌打散打匀，倒入侵染液中。

3农杆菌花序侵染（1）托盘垫上报纸，润湿，取八盆培养良好且适合侵染的拟南芥，每盆四株；（2）将全部的花全浸到侵染液中，全部的花均需浸湿，若花无法碰到侵染液，则用戴手套的手浸湿，每盆浸湿2分钟；（3）然后将植株迅速平躺放到托盘中，用黑塑料袋盖住；（4）暗处理24小时后正常培养；（5）用于摇菌的三角瓶，侵染用的瓶子、50ml插口圆底离心管及剩下的侵染液与菌液上清均需高温高压灭菌。

4收种子侵染后的拟南芥苗正常培养，30天时收取第一批种子，40天时收取第二批种子，晒干7~10天。

5 筛选T1代转基因阳性植株5.1 选择性培养基筛选（1）将种子倒入10ml离心管中，加满拟南芥种子消毒液（0.5%SDS、0.8%NaClO），均匀打散种子，手摇振荡15分钟；（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，将种子完全打散，振荡洗涤；（3）室温3000g离心2分钟，在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，重复进行五次洗涤过程；（4）加入0.2%琼脂糖悬浮种子，用移液器均匀涂在50ug/ml卡那霉素100ug/ml头孢菌素的MS固体培养基板上，每个板3ml，晾十五分钟，等水被板吸干后再封膜；（5）暗处理春化3d；（6）将选择性培养基上长出的T1代转基因阳性植株移到土中正常培养。

拟南芥种植方法.doc

培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。

拟南芥植物组织培养

拟南芥植物组织培养 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1 .5 ml eppendorf 管(微量离心管)中，加入1 ml 蒸馏水，4C春化3 d，70 %（v／v ）乙醇1mi n、7 %（v／v ）次氯酸钠10 mi n 浸泡消毒，并用无菌水冲洗5 次。

方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1 min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。

消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。

方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠溶液浸泡5—6 min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1 ml无菌水，用移液枪接种。

二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。

（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。

糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。

如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。

）也可以用MS+30 g／L蔗糖的固体培养基。

（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。

MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS 生长培养基的培养皿平板上滴落，并使之形成两条平行的直线。

（如不行，可适当添加琼脂）。

四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。

3天后即可取材用于器官离体再生实验。

萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2 MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。

拟南芥培养Protocol

拟南芥培养Protocol拟南芥生长的适宜温度白天为22℃-24℃,夜温最好比日温低2℃,适宜的湿度为60-70%,生长期适宜的光强为150μmol·s-1·m-2(6支36W日光灯下35cm处测得)。

幼苗期不耐高光强,可适当遮荫.光质也较重要,应选用植物生长专用的日光灯(如荷兰产TLD型Philip豪华直管荧光灯).拟南芥在日照长于12小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳1.准备发苗培养基:1/2 MS,Sucrose:10g/L,pH5.7,agar:0.7-0.8%.灭菌后,在超净台上分装入培养皿.2.种子消毒:种子放在1.5ml试管中, 加入1ml10%NaClo,混匀,消毒5min,用无菌水洗5次以上(用移液枪吸).3.播种:用移液枪将种子吸到培养皿上,可多加些水,将种子铺均匀(不要太密,太密根缠在一起不好移苗),用移液枪吸干水,在超净台上让培养皿干了,密封盖子,4℃暗处理两天后,移到光照培养箱(22℃,光周期12h),若种子较密,则在光照培养箱中生长1周后即可移苗,否则根长太长后易缠在一起,但太小的苗移栽后,需适当遮荫.最好是在每皿<30株这样的密度下,让其生长两周后再移苗.4.移苗:将蛭石与珍珠岩按(3:1)的比例混好,装入花盆,将花盆放入有水的塑料周转框中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来,待花盆中的基质湿透后即可移苗.小心轻轻用镊子从培养皿中连根拉出小苗,把根平放在蛭石表面,用镊子把根轻轻压下.移苗结束后,用保鲜膜覆盖3-4天后揭膜.从苗期直至开花,可在塑料周转框中始终保持1-3cm的水层,在开始收籽期,不再需要过多的水分,可保持塑料周转框干燥,此时每隔2-3天浇一次水即可.整个生长期可浇3-4次拟南芥营养液.5.收籽:在种荚变黄,变干时可以收籽.将种子抖落在纸上,用金属滤网过一下以除去杂质,将种子装入写了标记的小纸袋中,放于干燥的环境中让种子进一步干燥后,封存于1.5ml试管中.附拟南芥营养液配方nutrient solution containing:5mM KNO3, 2.5mM KH2PO4, 2mM MgSO4, 2mM Ca(NO3)2, 50µM Fe-EDTA, 70µM H3BO4,14µM MnCl2, 0.5µM CuSO4, 1µM ZnSO4, 0.2µM Na2MoO4, 10µM NaCl, 0.01µM CoCl2, adjusted to PH 5.7具体配法（药品刚好50L水培液用）:1)大量元素（包括25.25gKNO3，24.65gMgSO4·7H2O ,）：溶解，加水至500ml,配制成100倍母液Ⅰ。

拟南芥种子使用说明

用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培养。
细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h（必
要时，可适当延长培养时间）。
菌株传代：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大
在生物实验中拟南芥经常被选择作为模式植物，原因有三：首先，拟南芥
只有 5 对染色体，数目很小；其次，拟南芥发育生长周期极快，在短期内
就能繁育很多代，满足变异和进化的要求，最后拟南芥每次生产数千枚种
子满足遗传上统计的要求。拟南芥无菌培养，最普遍使用的是 1 倍或 0.5
倍浓度的 MS 培养基，也有使用 GamborgB5 培养基。
对和 5 对染色体。拟南芥是二年生草本植物，优点是植株小、结籽多。拟
南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。拟南芥是自花授粉植物，
基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高容易获得各种代谢功能的缺陷
型。正是这些优点，让拟南芥成为遗传学研究的好材料，“植物中的果蝇 ”。
华越洋生生物提供 QQ: 1733351176
接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。注意事项： 1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。保藏条件： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存）保藏时间： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接

拟南芥种植方法

培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。

拟南芥种植

拟南芥种植方法
一．拟南芥生长条件
拟南芥生长的适宜温度白天为22-24℃左右，夜温最好比日温低2℃。

拟南芥在日照长于12小时下才会开花，一般拟南芥生长室的日照长度定于14-16h为佳，土壤湿度70%—80%，营养土：蛭石=1：1，3—4天浇一次营养液，从底盘浸入。

二．种子处理
1.取适量种子置于标记好的1.5ml离心管中，加入1 ml 70％乙醇轻微振1 min；
2.去乙醇，加入1 ml体积分数为10％的NaClO (次氯酸钠), 消毒5~10 min；
3.吸去NaClO, 用无菌水冲洗种子5次后, 加入600μl无菌水；
4.取适量拟南芥种子至10 ml 离心管中，加入0.05%的琼脂悬浮，置于4℃冰箱低温春化处理2-3 天。

三．土壤培养
将已春化处理的拟南芥种子，用消过毒的牙签或者移液枪将种子，点播在土壤中，一盆2—3颗即可，将花盆放入有水的底盘中,框中的水就会通过花盆底部的孔渗上来，待花盆中的基质湿透后即可点播。

用保鲜膜覆盖1-2天后揭膜，如果苗很弱，则在此基础上还需多覆盖1天。

当到4叶期时，要适当移苗，每盆一株。

小心轻轻用镊子拨开周围土壤，连根取出小苗（注意不要伤害根部）。

苗期不使用营养液，移栽后3-4天使用一次营养液，期间视情况浇水，但不要在底盘中始终保持水层。

在开始收籽期,不再需要过多的水分，可保持底盘干燥，此时每隔7-10天加一次水即可。

在种荚变黄，变干时可以收籽。

将种子抖落在纸上，用金属滤网过一下以除去杂质，将种子装入写了标记的小纸袋中，放于干燥的环境中让种子进一步干燥后，封存于1.5ml试管中，切记越干越好，长期保存的种子必需要干燥保存到4℃。

预实验一：拟南芥的萌发实验

预实验一：拟南芥种子的接种和春化1.实验品种：拟南芥Arabidopsis thaliana种子2.仪器工具与药品表1 实验用仪器、工具、药品名称数量名称数量磁力搅拌器1套烧杯（500ml），量筒（50ml）各1个PH计1支玻璃棒1个微波炉1台称量纸、滤纸各1套湿热灭菌锅1台蓝盖瓶（200ml）蓝盖瓶（100ml）三角烧瓶（1000ml）1个2个1个紫外线超净台1台小镊子3个冰箱、纯水机各1台报纸、麻绳少许电子天平（）1台培养皿2套移液枪（20ul）移液枪（1ml）灭菌枪头（20ul）灭菌枪头（1ml）1只1只1套1套1/2MS培养基蔗糖NaOH、HCl琼脂75%乙醇超纯水2.5%NaClO纳米TiO21.24g15g适量5g100ml1000ml100ml0.75g宽口生态瓶（空）1个方形培养皿（10个）1套3.方法与步骤3.1拟南芥种子的接种（1）称量：称取1/2MS培养基1.24g，蔗糖15g，琼脂5g；量取无水乙醇75ml，NaClO 2.5ml，超纯水200ml和500ml两份。

（2）培养基的制备：将有500ml超纯水的烧杯放入磁力搅拌机上，放入磁石，打开开关；先后加入1/2MS培养基1.24g，蔗糖15g。

（3）调节PH：打开PH计，待其PH稳定后，先用纯水润洗后用纸巾擦干，在放入烧杯中测定，期间用NaOH和HCl调节PH至5.7-5.8。

（4）配置杀菌消毒剂：用超纯水配置75 %乙醇100ml，2.5 %NaClO100ml和200ml超纯水，放入对应的蓝盖瓶中。

（5）转移：将溶解好的培养基倒入1000ml三角烧瓶中。

（6）包扎：将三角烧瓶用塑料纸和麻绳包扎好，将生态瓶中放入少许滤纸，也按上述方法包扎好；将2套培养皿和镊子用报纸和麻绳包扎好，放入湿热灭菌锅中121℃30min。

（7）紫外杀菌：将紫外线超净台的门关闭，开启紫外灯提前杀菌30min。

（8）接种种子：晾凉后（培养基除外），将灭菌锅中的用具放入紫外线超净台，再移入种子、20ul的枪（含枪头）和方形培养皿。

种拟南芥的步骤

种拟南芥的步骤
1、紫外线照实验台15-20分钟。

准备：1/2MS培养基；平皿；枪；灭菌水；
0.1%Agar溶液（高温高压灭菌）；灭菌枪头（黄枪头要剪）；marker笔；无
水乙醇；95%乙醇；封口膜。

2、数种子于1.5ml的EP管中，做好标记。

3、微波炉化1/2MS培养基，倒板。

需要加抗生素的要加抗生素（潮霉素：每
100ml培养基加56ul；卡纳：每100ml培养基加100ul），无菌操作。

4、洗种子：
A、向盛种子的EP管中加1ml 75%的乙醇（250ul的无菌水加750ul的无水
乙醇，现配现用，且要先加无菌水），剧烈晃动8分钟。

【或者洗两次，每次4分钟】
B、将上述酒精倒出后，加入95%的乙醇冲洗5遍。

【3遍也可以】
C、用无菌水清洗2遍，倒掉水。

【1遍也可以】
5、将种子悬起。

加入100—200ul的0.1%的Agar溶液，将种子用枪吹起。

【Agar
的量要视情况而定】
6、点种子。

用200ul的枪和剪过的黄枪头吸取种子，在培养基上依次点种，尽
量分散均匀，晾干。

7、封皿，并做好标记。

8、层化。

放于4度的冰箱处理3天。

9、将层化的种子置于光照培养箱中育苗一周，培养皿要倾斜放置。

10、移栽于土中。

拟南芥的种植

一、拟南芥播种种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。

MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。

二、MS固体培养基制备1．培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。

这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。

现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。

大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ，200×) mg／LKI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5 CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ，200×) mg／LFeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ，200×) mg／L ⅣA肌醇20 000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸400上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。

拟南芥种子消毒和播种流程

消毒
1、取适量种子于EP中，加入1ml水，放入4℃冰箱，春化4天（已经处理）。

春化的作用是种子中茎尖生长点感受低温，有利于发育。

2、用枪尽量吸尽EP中水。

3、加入75%酒精2ml 洗涤种子。

4、加入无菌水冲洗酒精。

5、用次氯酸钠消毒8分钟。

6、用枪吸尽次氯酸钠，用无菌水清洗5遍。

播种
2、用移液枪将EP中的种子转移到平板上。

2、将枪头灼烧成圆滑边缘，平推种子使其在平板上均匀分布。

3、封口膜封口，编号0，1,，2,，3.
4、将0号立即放置于培养室。

5、1,2,3号用报纸包裹严实，做暗处理，1号暗处理1天，2号暗处理2天，3号暗处理3天。

6、光照用可使发芽受到抑制，所以需要暗处理。

拟南芥转化

1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 µg/ml利福平(Rifampicin)，50 µg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 µg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 µl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 µl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。

2.质粒转化农杆菌GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；3) 液氮冷冻8 min；4) 37℃水浴热激5 min；5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。

经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。

（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。

拟南芥培养及遗传转化

拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。

二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。

三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。

⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。

⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。

在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。

⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。

当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。

表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。

②调节PH至5.7~5.8。

表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。

拟南芥模拟植物实验报告(3篇)

第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。

由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。

本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。

二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。

2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。

3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。

三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。

（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。

（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。

2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。

（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。

（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。

3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。

（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。

（3）记录生长数据，分析生长规律。

4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。

（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。

（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。

五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。

2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。

3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。

拟南芥种植方法

培养基上点种子：1.种子处理1.1 种子消毒处理在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10min，将种子放在超净台中吹干。

1.2 点样将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm培养皿上大约种30粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。

1.3 春化种子点样完毕后，将培养基密封，置于4℃冰箱里放置72h后，放回温室。

土培法：1.种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121℃灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。

2.将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。

（每个小盒子种5粒种子，每个大方盒子种9粒种子）3.将点了拟南芥种子的托盘置于22℃温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需求对植物的幼苗进行取舍。

4.植株生长条件的控制幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22℃，空气湿度70—80%，光照强度100—150μmol/m2/s，每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。

浇水注意事项：1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿；2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起；4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。

当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。

开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水；5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来；6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等；7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。