第04讲 基因克隆的载体与受体
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基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
基因工程的载体和受体
应用基因工程中的载体和受体的案例
农业领域
利用基因工程技术，将抗虫基因或抗病基因导入植 物中，提高作物的抗病虫性能。
医学领域
基因治疗将健康基因导入病人细胞，以治疗某些遗 传性疾病，如囊性纤维化。
能源领域
利用基因工程技术，改良微生物使其能够生产更廉 价和环保的生物燃料。
科研领域
通过转基因技术，制造出可用于疾病研究和药物试 验的转基因动物模型。
基因工程中的受体选择
细胞
选择适合基因表达和工程的稳定的细胞株，如HEK293、CHO等。
整个生物体
适用于转基因植物和转基因动物的技术，如CRISPR/Cas9。载体和受体的功来自和作用1载体功能
载体提供了抗生素抗性基因，方便筛选带有目标基因的细胞。同时，载体还可以调控外源基 因的表达。
2
受体作用
受体接受外源基因并使其能够在细胞中进行复制和表达，从而影响细胞的功能和性状。
基因工程的载体和受体
基因工程涉及使用载体和受体来传递和表达外源基因。这些载体和受体在基 因工程中起着至关重要的作用。
什么是载体和受体
载体
载体是用来携带和传递特定DNA片段的工具。它 可以是DNA分子或病毒。
受体
受体是接收和承载植入的DNA片段的细胞或组织。 它提供了一个环境，使外源基因能够发挥作用。
载体种类和特点
1
质粒
小型DNA分子，可通过复制进入细胞。
病毒
2
广泛用于基因工程研究。
具有感染细胞和携带外源基因的能力。
常用的病毒载体包括腺病毒和逆转录病
3
人工染色体
毒。
人工合成的染色体，可以载入大量基因。
主要用于基因治疗和合成生物学。
受体种类和特点
基因工程4-1 基因工程的载体
pBR 322质粒共有4363个核苷酸，规定核苷 酸的计数由EcoR I的靶序列开始，以GAATTC 中的第一个T记为核苷酸1，按顺时针方向计数。
3. pBR 325质粒载体 由于在质粒pBR 322中，基因工程最常用的限 制酶EcoR I位点不具有插入失活效应，因而对其 进行改进得到了质粒pBR 325，大小为5.4 kb。
多克隆位点：由克隆实验中常用的限制酶所识 别的序列组成，多数情况下这些酶切位点都是 单一的，即在质粒载体的其他部位无此切点。 这种人工合成的密集排列的系列克隆位点称为
“多克隆位点”，也叫 “多接头”，又叫“限
制酶切位点库”。
β-半乳糖苷酶能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖
该编码区位于诱导型启动子Plac的下游，用安慰性诱 导物IPTG（异丙基--D-硫代半乳糖苷）能够诱导该片 段的合成。而该片段（ α-肽链）能与宿主细胞所编码 的缺陷型－半乳糖苷酶（缺失N端部分序列）实现互 补，形成具有功能活性的－半乳糖苷酶蛋白质分子。
(2) R质粒：也称抗药性因子。 R 质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因， 此中抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞， 使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
(3) Col质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合 成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。
3. 质粒的分类 根据质粒能否自己转移，可分为：
(1) 接合型质粒：自我转移的质粒，除含有自我 复制基因外，还带有一套控制细菌配对和质 粒结合转移的基因。 (2) 非接合型质粒：不能自我转移的质粒，此类 质粒能够自我复制，但不含转移基因组。从 基因工程的安全角度讲，非接合型质粒用作 克隆载体更为合适。
4.1.2 几种常见的质粒 1. Col EI质粒载体 属于大肠杆菌Col类质粒中的一种，是一种天 然质粒。大小为6.3 kb，含有EcoR I的单一酶切 位点，具有松弛型复制子。 在培养基中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成， 宿主染色体 DNA 的复制便被抑制，细胞的生长 也随之停止；而质粒 DNA 仍可继续进行数小时 的复制，这样每个宿主细胞所累积的Col EI质粒 的拷贝数可达1000~3000个。 Col EI 质粒除了具有可以编码大肠杆菌素 EI 的基因外，还可以编码使宿主细胞对大肠杆菌素 EI产生免疫性的基因。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
第六章 基因克隆的载体与受体_
N端的11-41aaFra bibliotekC端大部分 受体菌lacZ∆
pUC lacZ’
4）互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS) 区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源 基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
5’
MCS
lacZ’ 3’
5’ 外源DNA lacZ’ 肽移码突变 不互补
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳 迁移率不同：
scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L SC
二、质粒的类型
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
1. 接合型质粒：
三、质粒的复制类型
1. 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1—3份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。 （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（4）克隆位点
6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位于选择 标记Tetr的内部）
抗菌素选择原理
含有抗菌素的培养基（选择培养基）中能够生 长抗菌素抗性基因的受体菌
在含抗菌素 和X-gal的培 养基上培养
无菌斑 生长
质粒转化 的受体菌
在含抗菌素 和X-gal的培 养基上培养
基因工程原理基因克隆载体讲课文档
e：寄主细胞溶菌；
f：噬菌体DNA从寄主染色体 DNA上删除下来；
g：溶原性细胞按照正常速率分 裂。
第四十三页，共84页。
1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质
基因按功能相近性聚集成簇： •左侧区：A-J，合成头尾蛋白的 全部基因 •中间区：J-N，非必要区，与重 组有关
•右侧区：N-R，DNA合成及 调控。
构建克隆载体的一般是非接合型质粒
第十六页，共84页。
6. 显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。
如：
• 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、 抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等
• 育性质粒（F质粒） • 降解质粒：降解农药
• Ti质粒：形成冠瘿瘤
隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。
4. TA载体
T T
A
A
第三十三页，共84页。
第三十四页，共84页。
5. 质粒表达载体
——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在 受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。
第三十五页，共84页。
lac启动子表达系统
第三十六页，共84页。
质粒表达载体
融合型表达载体 非融合型表达载体
（c）不能提供复制能力
（d）不能为外源基因提供表达能力
• 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体 中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（a）pSCl01
（b）pBR322 （c）pUBll0
（d）pUCl8
第三十一页，共84页。
第七次课结束！
第三十二页，共84页。
——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要 基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。
f：噬菌体DNA从寄主染色体 DNA上删除下来；
g：溶原性细胞按照正常速率分 裂。
第四十三页，共84页。
1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质
基因按功能相近性聚集成簇： •左侧区：A-J，合成头尾蛋白的 全部基因 •中间区：J-N，非必要区，与重 组有关
•右侧区：N-R，DNA合成及 调控。
构建克隆载体的一般是非接合型质粒
第十六页，共84页。
6. 显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。
如：
• 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、 抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等
• 育性质粒（F质粒） • 降解质粒：降解农药
• Ti质粒：形成冠瘿瘤
隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。
4. TA载体
T T
A
A
第三十三页，共84页。
第三十四页，共84页。
5. 质粒表达载体
——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在 受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。
第三十五页，共84页。
lac启动子表达系统
第三十六页，共84页。
质粒表达载体
融合型表达载体 非融合型表达载体
（c）不能提供复制能力
（d）不能为外源基因提供表达能力
• 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体 中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（a）pSCl01
（b）pBR322 （c）pUBll0
（d）pUCl8
第三十一页，共84页。
第七次课结束！
第三十二页，共84页。
——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要 基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。
基因工程的载体和受体情况讲解
但这种对应关系不是绝对的，若细胞生长环境中存在蛋白质合成抑制剂（氯霉 素、壮观霉素等）时，细胞的染色体DNA的复制受阻，而质粒仍可扩增，使其 数量可达数千拷贝。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
（2）质粒的不相容性（incompatibility）
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质
（3）质粒的可转移性
据此，革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： ✓接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F质粒。 ✓非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R质粒的一些成员。
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质 粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定。
R因子（resistance factor）
✓最初发现于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），后来发现 还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和 Staphylococcus中。
✓R因子由相连的两个DNA片段组成，即抗性转移因子 （resistence transfor factor， RTF ）和抗性决定R因子（rdeterminant）。RTF为分子量约为11×106 Dalton，控制质粒拷 贝数及复制。抗性决定因子大小不固定，从几百万到100×106 Dalton以上，其上带有抗生素的抗性基因。
基因工程的载体和受 体情况讲解
一、用于基因克隆的载体
1.载体的概念
（1）携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 （2）能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞， 具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩 增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。 （3）实质：用来携带目的基因片段进入受体细胞。
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长
四、基因克隆载体(一)
把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并 在菌体内成功转录出相应的mRNA。 这是第一次成功的基因克隆实验。
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
2、pBR322
p—plasmid，BR分别为该质粒的两位主要构 建者F. Bolivar和R.L. Rodriguez姓氏的头一个字 母，“322”为实验编号。
含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始 子。
融合型蛋白表达载体：pET28a
非融合型蛋白表达载体：pKK223-3（强启动子Ptac）
（三）、质粒载体的构建
构建质粒克隆载体的基本策略如下：
① 构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行 有效的复制并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中 有较多的拷贝数。 * 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
克隆载体(cloning vector)： 指能够把外源DNA片段带入受体细胞，并进
行稳定遗传的DNA或RNA分子
穿梭载体(shuttle vector)： 带有两种不同的复制起始位点，可以在两种
不同的生物体中复制的质粒载体
表达载体(expression vector) 一种克隆载体，可以使插入的外源DNA片段
严紧型质粒(stringent plasmid)：拷贝数少，1－数个， 松弛型质粒(relaxed plasmid) ：拷贝数多，10个以上
（提取质粒时，可添加氯霉素）
4. 质粒的不亲和性(Incompatible):
两种类似的不同质粒不能存在于同一细胞中。 亲和质粒、不亲和质粒
5. 质粒的可转移性：
D） Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移
E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr， F） 产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒） G） 降解基因：降解重金属、有机物和农药等 H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒
基因克隆载体PPT幻灯片
二、基因克隆载体
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
（一）载体的功能及特征 （二）质粒 （三）噬菌体或病毒DNA （四）Cos质粒与噬菌粒 （五）人工染色体载体
（一）载体的功能及特征
载体(vector)：
在基因工程操作中，能携带外源DNA 进入受体细胞的DNA分子。
载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞； 为外源基因提供复制能力或整合能力； 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
2、不相容性(incompatibility)
指任何两种含相似复制子结构的不同 质粒，不能同时存在于一个细胞中。
分子机制：
两种含不同复制子结构的不同质粒，在 复制时受各自的拷贝数控制系统调节，致使 两种质粒的最终拷贝数恒定，经若干复制周 期和细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞 内。
两种含相似复制子结构的不同质粒，在 复制时受同一拷贝数控制系统的干扰，致使 两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多 的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。
1）接合型质粒：
除带有自我复制所必需的遗传信息外，还带 有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另 一个细胞，如F质粒。
2）非接合型质粒：
虽带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
不能在天然条件下独立地发生接合作用， 如ColE1质粒。
2）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
plasmid DNA
Genomic DNA
The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell
第四章 基因克隆的质粒载体(共118张PPT)
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法
(3)微量碱变性法
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；
2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量 的细菌染色体易断裂成线性片段，而质粒 DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态 ；
3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱 基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复
的一个重要特征。
正超螺旋(positive supercoil)
盘绕方向与DNA双螺旋方同相同
负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反
4. 作为克隆载体质粒的条件
适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必须包括
三种共同的组分： 复制子
选择性标记基因 克隆位点 基因克隆载体还需要满足具有较小的分子量和较高的拷贝数
菌中生存.
2.质粒的生物学特征
只能在在寄主细胞内独立增殖，随寄主分裂而遗传。
自然界中，无论是真核生物还是原核生物细胞，甚至真菌的
线粒体中都发现有质粒的存在。
质粒绝大多数是环形双链的DNA
但也存在有线形质粒 、RNA质粒（酵母的杀伤质粒）
质粒DNA分子可以稳定存在于染色体外，呈游离状态,有一些 质粒在一定条件下能可逆地整合到寄主染色体上，随染色体 的复制而复制,称为附加体。
乎都带有一个来源于pMB1的复制子，可使每个细菌细胞中维持
１５－２０个拷贝。
质粒就其复制方式而言分为两类：
严紧型（stringent plasmid) 每个寄主细胞中仅有１－３份的拷贝。
松弛型（relaxed plasmid) 每个寄主细胞中仅有１０－６０ 份的拷贝。
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b）细菌抗性原理 Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环 素通过细胞膜进入细菌细胞内。
（2）抗菌素选择原理
不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基 （选择培养基）中生长。
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生 长。
抗性基因
死
抗菌素
活
4. 人工构建的质粒载体的类型
呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： 超螺旋（sc)最快、线形（l ）次之、开环（oc）最慢。
原核表达载体的重要调控元件
1．启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成 的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动 子，基因就不能转录。 由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核 表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动 子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、 T7噬菌体启动子等。
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1） 具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 是筛选的标志。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（1）选择标记 ① 抗菌素抗性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）
通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽 键的形成。杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理 Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
a）杀菌原理
通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。
b）细菌抗性原理 Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻 断其与核糖体结合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str）
a）杀菌原理 通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。
b）细菌抗性原理 Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其 与核糖体30S亚基结合作用。
v）四环素（Tetracycline，Tet）
a）抑菌原理 通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽 键的形成。杀死生长的细菌。
（1）高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点，达到每个细胞 的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。
（2）低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。 pLG338、pLG339、pHSG415等 不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途: 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的 正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。
常用抗菌素的抗性工作原理
i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp） 青霉素的衍生物。 a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。 b）细菌抗性原理
Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺 环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理
脱离
整合
F因子的四种细胞形式：
a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接 收 F因子而变成雄性菌株（F+）；
b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子整合到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。 细胞表面同样有性菌毛。
F+×F-杂交
b、抗性因子（Resistance factor，R因子）
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗 性性状（resistance）。
c、产细菌素的质粒
细菌素一般根据产生菌的种类进行命名： 大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素）， 而质粒被称为Col质粒。 一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不 携带该质粒的菌株。
3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid）
是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构 建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比 Lac和trp都强。 Tac启动子受IPTG的诱导。
（4）T7噬菌体启动子：它是来自T7噬菌体的启动子，具有高 度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克 隆化基因独自得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许 多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些 不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。这个系统可以 高效表达其他系统不能有效表达的基因。
f、隐秘质粒（cryptic plasmid）
隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方 法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。
在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体 （一般加上抗性基因）
三、大肠杆菌中质粒的类型
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒 能自我转移
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。 如pDF41、pDF42、pBR329。 外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体
直接选择转化后的细胞。
Direct selection vectors
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。 目前通用的runaway plasmid vectors
这是一类温度敏感型复制控制质粒。 1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。 温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
（1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。 有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。
（2）筛选标志不理想
ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。 colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌 斑”。 唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。
四、质粒的复制类型
1. 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1—3份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 2. 松弛型质粒（relaxed plasmid） 拷贝数多，有10—60份拷贝。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
五、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性
（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子 上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基 因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构 所组成。乳糖及某些类似物如IPTG可诱导转录发生。
（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏 蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动 子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯 酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的 活性，促使trp启动子转录。
a、致育因子(Fertility factor，F因子)
又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌 的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。 F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于 细胞中，所以又称之为附加体(episome)。 携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株 称为F-菌株（相当于雌性）。
OC L SC
二、质粒的主要种类
致育因子（Fertility factor，F因子） 抗性因子（Resistance factor，R因子） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 毒性质粒（Virulence plasmid） 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（Cryptic plasmid）
大肠杆菌的质粒
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小： 1—200 kb （2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。 如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必 须）。
（3）环形状：
双链环状DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于 大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。