7年分子克隆经验总结
分子克隆技术
分子克隆技术分子克隆技术是一种以DNA技术开展生物学研究的新方法。
它可以非常有效地复制出大量基因序列，从而为更深入地解析基因组给出生物特性提供可能。
作为一种生物信息学技术，分子克隆技术基本上利用质粒或载体把被学习的DNA片段提取出来，通过该质粒或载体可携带DNA片段，并用作接种细菌的载体，解析基因组的形态结构及功能。
分子克隆技术的发展历史自20世纪70年代的DNA克隆的研究开始，经过几十年的发展，它在许多领域都取得了巨大的成就，如医学、生物工程、食品处理等。
该技术使得研究人员可以获取精确的DNA信息，并为复制基因序列提供迅速、低成本、高效率的方法，为科学家研究基因组和解析生命过程提供了强大的工具。
分子克隆技术的应用在世界范围内非常广泛，有很多诸如基因定位、基因突变、DNA测序、转基因有机体、基因工程植物、分子诊断等应用。
例如，经过分子克隆技术，科学家可以定位出特定生物中的特定基因，并直接拷贝该基因，使它聚集成为一个基因组，用于基因突变和异位表达，以解析基因组的结构和功能。
研究人员还可以利用这种技术研究基因的进化史，研究基因的转移路径以及特定物种在进化过程中的变化，更多地了解物种的进化。
此外，分子克隆技术在药物研究以及重大疾病的预防和治疗过程中也发挥着至关重要的作用。
例如，非洲猪瘟是一种严重危害猪类及其产品安全的传染病，经过分子克隆技术，研究人员获得了病原体所对应的基因，为预防和治疗猪瘟提供了重要的基础。
此外，分子克隆技术还可用于生产重要的生物制品，包括激素、抗体、细胞因子、抗生素及病原体的疫苗等。
它使得科学家可以迅速地制造出各种重要的生物制品，对人类健康有着重要意义。
值得一提的是，最近几年，随着基因组学技术的飞速发展，分子克隆技术也取得了长足的进步，使科学家能够非常准确地表达基因，并开展全基因组测序及基因功能分析。
许多生物学实验，如基因表达、RNA干扰、体细胞基因修饰等都依赖于分子克隆技术或相关技术的支持。
分子克隆实验技术的使用中常见问题
分子克隆实验技术的使用中常见问题分子克隆技术是一种常用的实验技术，被广泛应用于分子生物学研究、基因工程以及生物医学等领域。
然而，在使用分子克隆技术进行研究或实验的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将就分子克隆实验技术的使用中常见问题进行探讨，希望能帮助读者更好地应对这些挑战。
问题一：选择合适的克隆载体在进行分子克隆实验之前，选择合适的克隆载体是非常重要的一步。
克隆载体通常是一种容易携带外源DNA片段的可重复扩增的质粒或噬菌体。
然而，在选择合适的克隆载体时，需要考虑多个因素：1. 大小：载体的大小要适中，不宜过大或过小。
过大的载体可能导致操作不便、扩增困难，而过小的载体则可能限制载入的外源DNA片段的大小。
2. 复制起源：克隆载体应该具有一个可靠的复制起源，这样才能确保在细胞中稳定复制。
3. 选择标记：载体通常会带有一些标记基因，例如抗生素抗性基因。
在使用克隆载体进行实验时，选择合适的标记基因很重要。
问题二：限制性内切酶消化反应优化限制性内切酶消化是分子克隆实验中的重要步骤，用于切割DNA，生成所需的片段，并为之后的操作提供合适的DNA末端。
在进行限制性内切酶消化反应时，常见问题包括：1. 酶切位点不兼容：选择合适的限制性内切酶对于成功完成限制酶切非常重要。
如果酶切位点与目标DNA不兼容，将无法成功进行酶切。
2. 消化条件优化：酶切反应的条件包括酶切酶的浓度、反应温度、反应时间等。
为了获得理想的酶切效果，有时需要进行反应条件的优化。
3. 反切和星切现象：反切是指限制性内切酶在不应该切割的位点上产生切割作用，而星切是指一个酶切酶在DNA样品中的多个不同位点发生非特异性切割。
这些现象可能影响目标DNA片段的纯化和选择。
问题三：插入片段的PCR扩增在分子克隆实验中，为了获得目标DNA片段，常常需要进行PCR扩增。
然而，PCR扩增过程中可能会遇到以下问题：1. 扩增特异性：选择合适的引物是 PCR 扩增的基础。
分子克隆部分实验报告
一、实验目的1. 学习分子克隆的基本原理和方法；2. 掌握质粒的提取、纯化、线性化及目的基因的插入等实验操作；3. 熟悉DNA的纯化、鉴定及重组载体的构建等实验技术。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从基因组DNA中分离出来，并在宿主细胞中复制和扩增的过程。
实验过程中，利用限制性内切酶切割目的基因和载体，通过连接酶将二者连接形成重组载体，然后转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pET-28a2. 目的基因：EGFP3. 限制性内切酶：BamHI、EcoRI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA分子量标准：DL20006. DNA纯化试剂盒7. 转化宿主细胞：大肠杆菌DH5α8. LB培养基、氨苄青霉素9. 等等四、实验步骤1. 质粒提取与纯化（1）按照试剂盒说明书提取质粒DNA；（2）用DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA；（3）检测质粒浓度和纯度。
2. 目的基因的线性化（1）用BamHI和EcoRI双酶切目的基因片段和载体；（2）用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；（3）检测酶切产物浓度和纯度。
3. DNA连接（1）将纯化的目的基因片段和载体进行连接反应；（2）将连接产物转化大肠杆菌DH5α；（3）在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化菌。
4. 阳性克隆的筛选（1）提取转化菌的DNA；（2）用BamHI和EcoRI双酶切提取的DNA；（3）电泳检测酶切产物，筛选出与预期大小相符的重组质粒；（4）将重组质粒进行测序验证。
五、实验结果与分析1. 质粒提取与纯化：质粒浓度约为50ng/μl，纯度大于0.8。
2. 目的基因的线性化：酶切产物浓度约为10ng/μl，纯度大于0.8。
3. DNA连接：转化菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长良好。
4. 阳性克隆的筛选：电泳结果显示，重组质粒大小与预期相符。
5. 重组质粒测序验证：测序结果与预期序列一致，表明目的基因已成功插入载体。
分子克隆及蛋白表达常见问题和对策
三、克隆过程概述
2、PCR筛选和限制酶酶切法 提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知 的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。 PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步 鉴定插入片段的大小。
注意： 菌落PCR技术筛选阳性克隆时，如果克隆的基因本身 来源于宿主的话，不能采用该技术
当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平 端载体相连，此为平末端连接，连接效率差些。
三、克隆过程概述
有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的 表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚 物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得 相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相 连接，形成重组DNA分子；
转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复 制和扩增；
选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分 子的个体。
二、基因克隆
基因工程技术的两个最基本的特点： 1、分子水平上的操作 2、细胞水平上的表达
分子水平上的操作即是体外重组的过程， 是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。 基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性 繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工 程等。
一、重要意义与应用
基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定 点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学 研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科 研将寸步难行。
二、基因克隆
（一）分子克隆技术的诞生
1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次 出现基因克隆技术的想法。
Stanley Cohen （1986年诺奖获得者），对 Herbert W.Boyer 关于细菌酶切割DNA分子特定部 分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两 位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产 业的实验。
分子克隆实验步骤总结
分子克隆实验步骤总结分子克隆实验步骤1.对目的片段进行pcr扩增：Pcr体系：（50μL）DNA Template：10-100ng10×PCR buffer：5μL50mM dNTPs：0.5μLPrimers：1μM eachWater：add to 49μLTaq Polymerase：1μL2.琼脂糖电泳，看有无目的条带3.对目的条带进行切胶回收4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；Taq酶，则无需加尾）加尾体系：（10μL）胶回收DNA: 8μLBuffer: 1μLdNTPmix: 0.5μLTaq Polymerase：0.5μL5.T载体连接：室温，30min体系：（6μL）加尾后产物：4μLT载体：1μLSalt solution 1μL6.30-40μL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）9. 加SOC（200-250μL）10.37℃，300rpm，1h11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，37℃摇床培养过夜13.试剂盒提质粒14.酶切：37℃，2h体系：（20μL）Buffer2: 2μL酶：0.5μL模板：1μLBSA：0.2μLH2O：16.31μL15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul）10*taq buf 2uldNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM）1.6ul Primer F （10uM）0.5ul Primer R（10uM）0.5ul DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul ddH2O 12.5ul程序：94度10min94度30sec56度30sec72度2:10 30cycle 72度10min4度forever。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
2024年奇妙的克隆反思总结
2024年奇妙的克隆反思总结2024年的克隆技术引起了世界的广泛关注和讨论。
这项技术虽然有着巨大的潜力和前景，但也引发了一系列的道德和伦理问题。
在过去几年中，我对这一问题进行了深入的思考和研究，以下是我的一些总结和反思。
首先，克隆技术的出现给人类带来了巨大的希望和潜力。
通过克隆技术，我们可以复制出完全相同的个体，这对于一些特定领域的研究和应用有着巨大的意义。
例如，在医学领域，克隆技术可以用于创造和培育器官，解决器官移植的短缺问题。
在农业领域，克隆技术可以用于复制出优质的作物和家畜，从而提高农作物和养殖业的产量和质量。
在科学研究中，克隆技术可以用于复制实验对象，从而提高实验的可重复性和准确性。
然而，克隆技术也引发了一系列的道德和伦理问题。
首先，克隆是否违背了自然法则？克隆是通过复制已有生物的基因信息来创造新的个体，这与自然繁殖方式存在本质的区别。
人们担心克隆技术可能破坏了自然生态系统的平衡，并可能导致物种的灭绝。
另外，克隆技术也引发了个体身份和自我认同的问题。
每个人都是独特的，无论是外貌还是性格。
如果克隆技术被广泛应用，导致人们之间的相似性增加，那么个体的自我认同和独特性可能会受到严重的侵蚀。
个体间的关系也可能变得复杂和混乱，因为难以区分真正的个体和其克隆体。
另一个值得关注的问题是克隆技术的滥用。
克隆技术的潜在滥用包括克隆人类、克隆军队和克隆家族等。
克隆人类引发的道德和伦理问题尤为突出。
克隆人类是否与现有的个体有同样的权利和尊严？是否可以追究其道德和法律责任？这些问题都需要我们深入思考和回答。
此外，克隆技术的发展和应用也需要严格的监管和控制。
大规模的克隆技术可能导致资源和环境的不平衡，甚至引发一系列社会和经济问题。
政府和国际社会应该建立相关的法律和伦理框架，限制和监管克隆技术的发展和应用，确保其安全和合理使用。
综上所述，克隆技术的出现给人类带来了巨大的希望和挑战。
我们需要平衡利益和道德伦理的关系，通过建立适当的法律和伦理框架来引导和控制克隆技术的发展和应用。
分子克隆常用技术
分子克隆常用技术一、核酸的纯化在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。
其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。
氯仿抽提核酸的溶液即可。
每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。
然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。
这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。
继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚。
①核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿。
②旋涡混匀管内容物，使呈乳状。
③12000×g室温离心15秒。
④水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。
⑤重复步骤①－④步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。
二、核酸的浓缩应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。
在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA 或RNA，也可定量回收。
回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
具体操作时，可向含样品的小离心管中加入V/10单价阳离子盐贮存液2V无水乙醇，混匀，放冰水浴中15－30min，取出目测平衡，0－4度，12000g，离心10min。
吸弃上清，再另70%乙醇0.5－1ml，12000g，0－4度洗涤离心2min。
吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适当体积的缓冲液中。
单价阳离子盐溶液*：当加醋酸铵时，需加入DNA液的V/2。
单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸铵可减少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸铵，因铵离子是T，多核苷酸激酶的强烈抑制剂。
当用较高浓度的乙醇沉淀RNA时，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不随核酸共沉淀。
含有SDS的核酸样品，应使用NaCl，这时该去垢剂要70%乙醇中仍保持可溶。
载体构建技术经验分享
载体构建技术经验分享一、PCR 过程中的经验教训做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。
这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。
高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。
PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。
我就曾经用普通的酶进行过PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。
二、PCR 产物直接酶切后连接不成功当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。
但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。
因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧三、T-A 克隆应注意的问题T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。
T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。
但要注意，首先是T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。
其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。
这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。
进行加A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。
我开始就是这样，想着节约，说明书写的是PCR 产物加15ul,我没舍得，加了3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。
后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。
生物技术研发员克隆实验总结
生物技术研发员克隆实验总结在过去的几十年中，生物技术的迅猛发展已经开辟了一个全新的领域，其中克隆技术尤为引人注目。
作为一个生物技术研发员，我有幸参与了大量的克隆实验，并在此总结并分享我的经验和观点。
克隆技术是指通过人工手段复制一个有机体的基因或一种特定的细胞。
它可以实现无性繁殖，使得基因完全复制，从而产生完全相同的个体。
我所从事的克隆实验主要集中在植物领域，特别是作物的克隆研究。
下面，我将从实验设计、技术操作和实验结果三个方面进行总结。
实验设计是整个克隆实验的核心。
在选择克隆目标时，我们通常会选择具有优良性状的植株作为母体。
然后，我们会从母体植株中选择一段特定的组织，如茎尖或叶片组织。
选择合适的组织是确保克隆成功的重要步骤，因为它们需要具备再生能力。
技术操作是进行克隆实验的关键步骤。
首先，我们需要将选择的组织进行消毒处理，以杀灭潜在的细菌和真菌。
然后，通过切片的方式将组织分离成小块，并将其培养在含有适当培养基和激素的培养皿中。
在培养的过程中，我们需要定期检查和转移组织，以促进其快速生长和发育。
实验结果是我们验证克隆效果的最关键部分。
在实验进行的过程中，我们观察到组织的生长情况，并定期记录和测量。
我们还进行了PCR检测和基因测序，以验证克隆植物中的基因是否与母体相同。
通过对克隆植物进行比较分析，我们可以评估克隆过程中的变异情况，并得出结论。
此外，我们还通过与自然繁殖的植物进行对比，验证了克隆技术的成功率和可行性。
通过对多个克隆实验的总结，我得出了一些关键的观点和经验教训。
首先，实验设计的合理性和准确性决定了克隆实验的成功与否。
选择具有优良性状的母体植株和适宜的组织是至关重要的。
其次，技术操作的规范性和细致性是确保实验结果可靠性的必要条件。
消毒处理和组织培养的准确步骤和时间控制是实验成功的关键。
最后，实验结果的分析和评估可以提供对克隆过程的深入理解，并为未来的克隆实验提供指导。
然而，克隆技术也面临着一些挑战和伦理考虑。
克隆技术的实验报告结论
一、实验背景克隆技术，即通过无性繁殖的方式，复制一个生物体的基因型。
近年来，随着生物科学技术的不断发展，克隆技术在医学、农业、生物学等领域得到了广泛的应用。
本实验旨在探讨克隆技术的可行性及其在动物克隆中的应用。
二、实验目的1. 了解克隆技术的基本原理和方法；2. 掌握动物克隆实验的操作流程；3. 分析克隆技术在实际应用中的优缺点。
三、实验材料与方法1. 实验材料：供体细胞（小鼠胚胎细胞）、受体细胞（去核卵母细胞）、培养液、显微操作仪器等。
2. 实验方法：（1）提取供体细胞：采用显微操作技术，从小鼠胚胎中取出胚胎细胞。
（2）去除受体细胞核：采用显微操作技术，去除去核卵母细胞中的细胞核。
（3）细胞核移植：将供体细胞核移植到去核卵母细胞中。
（4）胚胎培养：将细胞核移植后的卵母细胞在培养液中培养，使其发育成胚胎。
（5）胚胎移植：将培养好的胚胎移植到受体母鼠体内。
（6）胚胎孵化：观察胚胎发育情况，记录胚胎的存活率、性别比例等。
四、实验结果与分析1. 克隆胚胎发育情况：经过细胞核移植、培养和移植后，大部分胚胎成功发育成幼鼠。
其中，部分幼鼠表现出正常的生长和发育，而部分幼鼠存在生长迟缓、发育异常等问题。
2. 克隆胚胎性别比例：在实验中，克隆胚胎的性别比例与自然胚胎相似，无明显差异。
3. 克隆胚胎存活率：克隆胚胎的存活率较高，约为80%。
4. 克隆胚胎遗传稳定性：通过基因检测，克隆胚胎的遗传稳定性与自然胚胎相当。
五、实验结论1. 克隆技术是一种可行的生物技术，可以复制生物体的基因型。
2. 克隆技术在动物克隆中的应用具有可行性，能够成功复制出具有正常生长和发育的幼鼠。
3. 克隆胚胎的性别比例与自然胚胎相似，无明显差异。
4. 克隆胚胎的存活率较高，约为80%。
5. 克隆胚胎的遗传稳定性与自然胚胎相当。
六、实验讨论1. 克隆技术在医学、农业等领域具有广泛的应用前景。
例如，利用克隆技术可以培育出优质、高产的农作物，提高农业生产效率；在医学领域，可以利用克隆技术进行器官移植，解决器官短缺问题。
快速做出基因克隆的心得体会
本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。
(本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。
对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。
)一、片断平移的克隆(也适用于多片断连接)简介：将用作载体的质粒A(制作大片断)酶切3μl ，要切出小片断的质粒B酶切7μl;琼脂糖回收胶电泳;切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中;酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥;加入8μl水、1μlligase Buffer、1μl ligase ，4℃过夜;次日转化涂板。
酶切配置可酶切共10μl质粒的酶切反应体系(双酶切)：(提示在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。
酶切体系根据需要，可加入BSA。
)酶切体系混匀37℃，酶切3小时。
(提示关于酶量的问题。
通常的内切酶效价在10U/μl左右，3μl内切酶相当于30U，足够切10μl 的质粒。
因为通常小提质粒的浓度在200-600ng/μl，一般浓度达不到1μg/μl。
根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。
)1%琼脂糖回收胶回收(碎胶、酚氯仿抽提法)1. 酶切产物加入10%量的上样Buffer，混匀。
使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。
2. 用手术刀切下所需要的大片断(载体)和小片断(插入片断)，收入一个1.5ml离心管中。
(提示: 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。
手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。
)3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。
-20℃冰冻20分钟。
4. 取200μl Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip 头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。
分子克隆工作总结
分子克隆工作总结
分子克隆是生物学和遗传学领域中一项重要的技术，它可以帮助科学家们复制
和研究特定的DNA序列，从而深入了解生物学和遗传学的相关机制。
在过去的几
十年里，分子克隆技术已经取得了巨大的进步，为科学研究和医学应用提供了强大的工具。
在本文中，我们将对分子克隆工作进行总结，并探讨其在科学研究和医学领域中的应用。
首先，分子克隆工作通常包括以下几个步骤，DNA提取、DNA片段的制备、
连接DNA片段到载体DNA上、转化和筛选。
在DNA提取过程中，科学家们会从
细胞中提取目标DNA序列，然后使用特定的酶切酶将其切割成所需的片段。
接下来，这些DNA片段会被连接到载体DNA上，形成重组DNA。
然后，这些重组DNA会被引入宿主细胞中，通过转化的方式将其转移到细胞内。
最后，科学家们
会通过筛选的方法，筛选出含有目标DNA的细胞，从而得到所需的克隆DNA。
分子克隆技术在科学研究领域中有着广泛的应用。
通过分子克隆，科学家们可
以复制和研究特定的基因序列，从而深入了解生物的遗传机制。
此外，分子克隆还可以用于构建重组蛋白、病毒载体和基因工程等方面，为生物学研究提供了强大的工具。
在医学领域中，分子克隆技术也有着重要的应用。
例如，通过分子克隆，科学家们可以构建重组蛋白药物，用于治疗癌症、糖尿病等疾病，为医学治疗提供了新的途径。
总的来说，分子克隆技术在生物学和遗传学领域中有着重要的作用。
随着技术
的不断进步，相信分子克隆技术将会为科学研究和医学应用带来更多的突破和进展。
分子克隆组装实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习分子生物学中最基本的技术——分子克隆的操作过程。
2. 掌握基因克隆的概念，了解基因克隆的基本原理和方法。
3. 熟练掌握DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定等分子克隆实验操作。
4. 提高实验操作技能，培养严谨的科学态度。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因（或DNA片段）与载体DNA连接，使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
本实验采用分子克隆组装技术，将目的基因插入载体中，实现基因克隆。
三、实验材料1. 基因组DNA提取试剂盒2. 限制性内切酶3. DNA连接酶4. 载体DNA5. 目的基因片段6. 转化宿主细胞7. LB培养基、琼脂糖、氨苄青霉素等四、实验步骤1. 提取目的基因片段和载体DNA（1）取适量基因组DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
（2）取适量载体DNA，按照试剂盒说明书进行提取。
2. 限制性内切酶切割（1）将目的基因片段和载体DNA分别用限制性内切酶进行切割。
（2）酶切反应体系：10×酶切缓冲液5μl，限制性内切酶1μl，DNA模板5μl，加双蒸水至50μl。
（3）酶切条件：37℃反应2小时。
3. DNA连接（1）将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接。
（2）连接反应体系：10×连接缓冲液5μl，DNA连接酶1μl，酶切后的目的基因片段5μl，酶切后的载体DNA5μl，加双蒸水至50μl。
（3）连接条件：16℃反应4小时。
4. 转化宿主细胞（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
（2）转化条件：42℃热激45秒。
5. 筛选和鉴定（1）将转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养过夜。
（2）挑取单克隆菌落，提取质粒DNA。
（3）对提取的质粒DNA进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。
（4）对阳性克隆进行测序，验证插入序列的正确性。
五、实验结果1. 成功提取目的基因片段和载体DNA。
2. 目的基因片段和载体DNA经限制性内切酶切割后，酶切图谱与预期相符。
克隆模型实验报告总结(3篇)
第1篇一、实验背景克隆模型实验是一种重要的生物学研究方法，通过模拟生物体发育过程中的基因表达和细胞命运决定，帮助我们理解生物发育的分子机制。
本实验旨在通过构建克隆模型，探究特定基因在细胞命运决定中的作用，以期为相关疾病的诊断和治疗提供理论依据。
二、实验目的1. 构建克隆模型，模拟生物体发育过程中的基因表达和细胞命运决定；2. 探究特定基因在细胞命运决定中的作用；3. 为相关疾病的诊断和治疗提供理论依据。
三、实验方法1. 构建克隆模型：通过基因编辑技术，将目标基因敲除或过表达，构建克隆模型；2. 分离细胞：将构建好的克隆模型细胞进行分离，得到不同基因表达的细胞群体；3. 观察细胞形态和功能：通过显微镜观察细胞形态变化，检测细胞功能变化；4. 数据分析：对实验数据进行统计分析，得出结论。
四、实验结果1. 成功构建克隆模型：通过基因编辑技术，成功构建了敲除和过表达目标基因的克隆模型；2. 分离细胞：成功分离出不同基因表达的细胞群体；3. 细胞形态变化：与野生型细胞相比，敲除目标基因的细胞形态发生了显著变化，过表达目标基因的细胞形态与野生型细胞相似；4. 细胞功能变化：敲除目标基因的细胞功能受到显著影响，过表达目标基因的细胞功能与野生型细胞相似。
五、实验结论1. 成功构建了克隆模型，模拟了生物体发育过程中的基因表达和细胞命运决定；2. 特定基因在细胞命运决定中起着重要作用，敲除或过表达该基因会导致细胞形态和功能发生显著变化；3. 为相关疾病的诊断和治疗提供了理论依据。
六、实验讨论1. 克隆模型实验为研究基因功能提供了有力手段，有助于揭示生物发育的分子机制；2. 本实验结果表明，特定基因在细胞命运决定中具有重要作用，为相关疾病的诊断和治疗提供了新的思路；3. 未来研究可以进一步探究该基因在不同细胞类型中的作用，以及与其他基因的相互作用。
七、实验展望1. 深入研究该基因在细胞命运决定中的作用机制，揭示其在生物发育过程中的调控网络；2. 探索该基因在相关疾病中的作用，为疾病的诊断和治疗提供新的靶点；3. 将克隆模型实验与其他研究方法相结合，进一步拓展其在生物学研究中的应用。
分子克隆实验报告
分子克隆实验报告实验名称：分子克隆、分子杂交、基因表达检测实验类型：综合性****：***班级： A**：***学号：*************实验时间：2015/8/19—2015/8/25实验一分子克隆DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。
DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分实验原理及方法DNA提取：（CTAB法） CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65︒C水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
感受态细胞的制备及质粒的转化质粒提取：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNACaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。
106 ～ 107转化子/μg DNA。
酶切酶连：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平末端的外源片段，经纯化处理后的DNA用于连接反应；选择克隆载体pUC19多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。
分子克隆实验实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握分子克隆实验的基本原理和方法。
2. 通过实验操作，提高分子生物学实验技能。
3. 熟悉DNA提取、限制性内切酶酶切、连接、转化、筛选等实验步骤。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从供体DNA中分离出来，并通过体外重组、转化、筛选等步骤，将其插入到载体DNA中，形成重组质粒。
重组质粒再经过扩增、提取等步骤，得到大量的目的基因。
三、实验材料1. E. coli感受态细胞2. pUC19载体3. 目的基因片段4. 限制性内切酶（如HindIII）5. T4 DNA连接酶6. DNA分子量标准7. DNA凝胶电泳试剂盒8. 琼脂糖9. 载体提取试剂盒10. 其他试剂（如DNA模板、PCR引物、Tris-HCl缓冲液、NaCl等）四、实验步骤1. DNA提取：按照试剂盒说明书提取目的基因片段和pUC19载体DNA。
2. 限制性内切酶酶切：将提取的DNA进行HindIII酶切，反应条件按照酶切试剂盒说明书进行。
3. 连接：将酶切后的目的基因片段和载体DNA进行连接，反应条件按照T4 DNA连接酶说明书进行。
4. 转化：将连接产物转化到E. coli感受态细胞中，具体操作按照转化试剂盒说明书进行。
5. 筛选：将转化后的细胞涂布在含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
6. 提取重组质粒：从平板上挑取白色菌落，按照载体提取试剂盒说明书提取重组质粒。
7. 验证：将提取的重组质粒进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体。
8. 纯化：将PCR产物进行纯化，具体操作按照纯化试剂盒说明书进行。
9. 测序：将纯化后的PCR产物进行测序，验证目的基因序列的正确性。
五、实验结果与分析1. 酶切结果：在DNA凝胶电泳中，目的基因片段和载体DNA在HindIII酶切位点处均出现特异性条带，说明酶切成功。
2. 连接结果：转化后的平板上出现白色菌落，说明连接产物成功转化到E. coli 细胞中。
3. 筛选结果：提取的重组质粒经过PCR扩增，在预期位置出现特异性条带，说明目的基因成功插入载体。
分子克隆岗位实习周记
分子克隆岗位实习周记做了这么久的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多技巧的。
或许有人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。
经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。
但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。
有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。
以下我详细说明。
1.PCR引物的设计。
通俗地说，很多人用了很多软件设计来设计去，又是考虑发夹结构，又是考虑二聚体，又是考虑Tm值，折腾来折腾去，但其实没那么复杂。
首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中找到，大部分是没问题的，然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取20-27bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。
这样引物设计就完成了，可以放到软件里看看GC含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。
2.PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。
我个人强烈建议第二种，连T载体。
因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。
连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。
②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。
连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。
分子克隆实习周记
分子克隆实习周记
周日下午，我们分子克隆实习正式拉开了序幕。
今天的第一项任务是对微观进行测量。
教授先把我们带到了她办公室门口。
她那不大的办公桌上摆满了化学试剂和仪器设备，有十几个盒子里装着各种玻璃器皿、水银、铁丝等微小颗粒。
每当要用这些东西时，就会打电话给其他老师或者找人来帮忙运送，非常麻烦。
实验开始之前，老师还跟我们讲解了实验原理：由于细胞与人体本身构造差异很大，所以想完全复制出同样的细胞几乎是不可能的事情，只能采取克隆技术来做这件看似简单却又极具难度的工作。
整个过程首先从获得细胞入手，然后将所需的各种材料按照不同的顺序组合起来形成一个个新的个体，接着再将各个细胞通过培养使它们结合起来，最终重建出一个跟母亲完全相同的生命体。
在放射物理学课上，老师向我们详细介绍了整个过程中的关键步骤：提取 DNA。
由于现代科学的发展速度已经远超出了老师当初设计的范围，所以导致研究出来的产品质量参差不齐。
而提取 DNA 的方法也因此而变得五花八门。
最后老师为我们推荐了她自己设计的“反相色谱法”，即先从原始母液中分离出 DNA，然后再加入多种辅助成分形成重组 DNA。
虽然老师说这种方法很耗费时间和精力，但我觉得确实比较科学，有利于保证产品质量。
最后我还仔细地了解了产品处理方面的内容。
如果操作失误，混入杂质，那么就会影响实验效果；如果分析结果不准确，则不能得知母液中是否含有杂质。
为了更好地掌握基础知识，老师让我回去查阅资料，巩固刚才所学的内容。
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做了快7年的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。
或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。
经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。
但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。
有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。
以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗地说，很多人用了很多软件设计来设计去，又是考虑发夹结构，又是考虑二聚体，又是考虑Tm值，折腾来折腾去，但其实没那么复杂。
首先保证你要的基因是正确的，这个可以从NCBI中找到，大部分是没问题的，然后再找到起始密码子，从那开始大概上游取20-27bp，加上酶切位点，加上保护碱基（一般3个）就是上游引物，取后20-27bp碱基，反向互补，加上酶切位点和保护碱基组成下游引物。
这样引物设计就完成了，可以放到软件里看看GC 含量，Tm值，发夹结构，二聚体等，适当调整碱基个数和保护碱基的个数。
需要额外注意的是移码问题。
需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。
做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。
常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。
dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。
如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。
容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。
这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。
如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。
甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。
我个人强烈建议第二种，连T载体。
因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。
连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。
②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。
连T载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR 的产物对不对、切点对不对。
总体来讲连T载体是很有优势的。
3，提质粒有时手工小提或粗提的质粒酶切效果不好，这可能是提取的不够纯或者内切酶品质不好。
所以若酶切效果不佳建议用柱子精提或大提。
4，酶切用于连接的酶切很关键。
需注意如下几点：①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。
如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。
②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。
大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。
相反，连接尽量用小体系，以增加DNA末端的碰撞机会。
③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大。
大了会切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
④酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。
相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。
若真是效果很差建议改进体系重新切。
5，回收回收可以用柱式试剂盒或手工法。
柱式回收试剂盒：此类试剂盒适合各种长度DNA，对黏性末端基本没有破坏，回收效率也不错。
手工醇沉法步骤如下，把切得的胶弄碎，用Tris-HCl 浸泡一段时间，吸出所有的液体，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加盐和醇醇沉，沉淀用70％乙醇漂洗，再用Tris溶解。
次方法优点是对DNA和黏性末端的损伤最小，缺点是容易损失DNA。
若本来DNA数量就不多，用手工法很容易丢失殆尽；如果DNA量很大可以考虑使用。
回收后要电泳，一来估算回收液浓度，二来看回收DNA的质量。
若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。
因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。
质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。
造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况，就容易造成回收质量不好。
只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
6，感受态做连接要求感受态的效率要高。
感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。
都知道感受态效率高好，但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测，只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。
所以如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要重做感受态了。
制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做。
用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
7，连接最后才轮到连接。
连接的问题讨论的是比较多的。
如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。
当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。
就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
②vector和insert的比例：如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：9。
如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector 还长，可以用1：1－1：3。
短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。
长片段的连接效率较低，阳性克隆率小于等于10％是很正常的。
我做过一个长片断的连接，6k的vector、6k的insert，比例用1：1，挑了20个克隆有一个对。
③体系体积：通常用20ul都能连上，若连长片段可以压缩成10ul（前提是DNA数量不变）。
我觉得体系不是很关键，有位很精通克隆的老师说他都用50ul体系，照样百发百中。
而且如果你的DNA是用EB（即Tris）溶解的，体系中不加水也行。
前述我自己连的长片段也是用20ul体系，vector和insert各上8ul。
④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。
我用过Promega的，还好；BBI的凑合用。
如果连长片段就加二倍的连接酶。
⑤连接时间：过夜。
过夜就应该足够了，但是你要是不急着转化放到4度放几天也行，我个人认为时间长只好不坏。
⑥连接温度：最适是16℃。
有人用PCR仪造16℃，我用泡沫冰盒加凉水再添冰，用手感觉差不多十四五六度，然后盖盖过夜，基本上温度不太变。
你若感觉好不温度，拿个温度计测也行。
有人用4度连接，也行，我有时先16度过夜，再放4度里几天。
⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要小心翼翼，尽量作到不放弃任何一个菌。
一般所用的感受态体积最少是连接体系的5倍。
长片段的连接转化时摇菌2小时。
⑧对照：对照很关键，可以反应出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。
一般有如下几种对照方式：⑴转化质粒对照。
和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。
这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。
还有一个作用，如果质粒早就长出来了，都长挺大了你的连接产物还没动静呢，那八成是没戏了，别等了赶快去准备下次连接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接转化对照。
如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。
目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。
长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切系统吧。
⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。
双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。
一、若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。
如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。
二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测“一”中所说的还检测是否有只进行了单酶切的。
总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高，但也不能保证一次成功。
在确保各步骤产物质量都不错的前提下若重复3、5次还没连上就要回头仔细检查这个克隆的策略有没有问题了，要是策略就有毛病你还懵然不觉那可就怎么做也做不出来了。