检验医学专业实验IV 临床生物化学检验部分(同名44567)

检验医学专业实验IV 临床生物化学检验部分(同名44567)

自动生化分析仪实际K值测定

实际K值：理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε的影响。ε在波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用户所用分析仪的实际ε，再计算K值，此为~。

一、340nm波长实际K值测定

【实验原理】：通过有NAD+（NADP+）参与的反应途径，用NADH或NADPH标准液来校正仪器。用己糖激酶（HK）方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系。葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH 的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。在需要校正的仪器上测其A即可求得实际摩尔吸光系数，计算出实际K值。

【注意事项】

1．减少偶然误差重复测定10次，当CV>5％时，则重新测定10次。

2．减少系统误差使用实际K值计算酶活性。3．如果实际ε值与理论ε值偏差过大，需对仪器检修和校正。

二、405nm波长实际K值测定

【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色

素原”为底物，经酶作用后可释放出在405nm 波长具有吸收峰有色的反应产物，如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基苯甲酸(ANBA)。他们在405nm波长时的理论ε分别为18 700、9 870、9 490。可使用其相应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A即可求得实际ε，计算出实际K值。以ALP实验(产物为4-NP) 为例测定实际K值。

【注意事项】

1．4-NP标准品纯度要求较高，必要时需纯化。2．其他注意事项参见340nm K值校正。

三、如何校正K值

在理论K值或实际K值得情况下，测定某标准品的含量，若测得的结果偏低，则需要把测得的结果调整至原标准品的含量，此时调整的数值称为校正因子，则校正K值=理论（实际）K值×校正因子=理论（实际）K值×校准值÷实测值

NADH正负向反应测定酶活性

一、血清乳酸脱氢酶测定

LD催化反应式为：L-乳酸+ NAD+（LD）→丙

酮酸+ NADH + H+

在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH。因NADH在340nm处有吸收峰，反应会引起340nm吸光度的增高。吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比关系。NADH正向反应的最适pH偏碱性，可使反应平衡偏向产生丙酮酸的方向。

【参考范围】成人血清LD ：109 U/L ~245 U/L 【临床意义】

1. LD活性增高：目前临床测定LD活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。

2. LD活性降低：目前没有发现重要的临床意义。

3. LD的特异性差，几乎存在各种组织中，如：心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾患时均致此酶增高。

【注意事项】

1. LD活性测定可用抗凝血浆，肝素的影响不大，而草酸盐抗凝剂、EDTA都是LD的竞争性抑制剂，能抑制LD活性。

2. 不同的LD同工酶对温度的敏感性有差异。组织提取液若放于-20℃过夜，LD4和LD5会丧失全部的活性。

3. 严禁使用溶血标本，红细胞、血小板中含有大量的LD。

4. 比色应在5~15min内完成，否则吸光值会降低。

【评价】

LD能可逆地催化乳酸（lactate, L）和丙酮酸（pyruvate, P）之间的氧化还原反应。

1. 正向反应最适pH是8.8~9.8，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。

其优点是乳酸和NAD+稳定性好。且NAD+纯品价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较宽,重复性较好，特异性高。

缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。

2. 逆向反应的最适pH为7.4~7.8，与生理性pH 相同。

其显著的优点是NADH用量少，仅为正向反应的3%，且反应速度比正向快3倍，灵敏度高。缺点是但丙酮酸与NADH的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。

二、连续监测法测定血清ALT

【实验原理】

L-丙氨酸+ α-酮戊二酸（ALT）→α-丙酮

酸+ L-谷氨酸

α-丙酮酸+ NADH （LD）→乳酸+ NAD+ 在340nm处连续监测到NADH的消耗量，从而计算出ALT活性浓度。

在双试剂测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5min，将样品中所含的α-酮酸（如丙酮酸）消耗完，然后加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应，在波长340nm处连续监测吸光度下降速率。

【参考范围】：成人血清ALT 5U/L～40U/L。【临床意义】

1．ALT是肝细胞损伤的诊断指标

①急性肝细胞损伤的灵敏指标。②慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100U～200U），或在正常范围，且AST＞ALT。③肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。④其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高。

⑤某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。

2．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。

3．ALT活性降低见于磷酸吡哆醛缺乏症。

【注意事项】

1．试剂空白测定值以蒸馏水代替血清，测定ALT 活性单位，规定测定值应小于5U/L.

2．血清不宜反复冰冻保存，以免影响酶活性。3．ALT测定中存在着两个副反应。

4．在AACC(美国临床化学学会)或IFCC(国际临床化学学会)推荐的试剂盒中，含有磷酸吡哆醛(P- 5'-P)。国家卫生部临床检验中心的推荐方法试剂中不加P-5'-P。

5．NADH在Tris缓冲液中稳定性较高；P-5'-P 在Tris缓冲液中能显示有效的激活作用；磷酸盐缓冲液有延缓与脱辅基酶蛋白的结合作用。【评价】

本法由于测定上限在酶促反应的线性范围内，偏差小，准确性好；测定条件较赖氏法易于控制，CV值比赖氏法小，精确性好；标本测定中不需要标准对照，测定结果计算方便，操作简便。但实验条件要求严格，成本高。