免疫组化

• 1.4．透明 • 透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料 透明，增记折光系数；同时便于下步的浸蜡和 包埋等程序。 • 常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是 逐级进行，可减少材料收缩。 • 步骤为：纯酒精、二甲苯等量混合液15min， 二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明为止）。
• 注意事项 • （1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空 气中的水分进入。 • （2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为 了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 • （3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾 状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精 中重新脱水，然后再透明。
免疫组化实验
4.封闭特异性蛋白
组织切片上有些剩余的位点可以与一 抗非特异性结合，造成后续结果的假 阳性。 封闭血清一般是和二抗同一来源的，血 清中有一些动物自身的抗体，预先能和 组织中有交叉反应的位点发生结合。
免疫组化原理及流程介绍
具体操作：
将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化 笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊 血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 ( 约30℃)下10～30min。 大一点
• 1.8.切片
• 用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连续的蜡带。切片时先 把切片刀夹在刀架上，再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装 切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调整好所 需厚度，一般可在7~14微米，视材料和所需观察对象而定，转 动切片机切片。
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具体步骤如下： ①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。 ②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 ③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 ④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 ⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。 ⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左 手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。 • ⑦切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷 曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一 面朝上。 • ⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜 下观察切片是否良好。 • ⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机 擦拭干净妥为保存。
• 1.3. 脱水 • 脱水的目的是除去组织中的水分，便于透 明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些 程序中所用的药品都不能与水混合，所以 必须脱水。常用的脱水剂为酒精。 • 材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 • 材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶 液脱水，各30min，再放入95%、100%各 2次，每次各20min。
• 1.2．固定
• 将切好的组织用生理盐水组织洗一下，立即投 入中性福尔马林固定液中固定，固定30－ 50min。
• 注意事项： • （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不 宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 • （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要 在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 • （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍， 有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 • （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时 在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免 相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的 文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
酶消化方法 一般用于细 胞内抗原 应用高频电磁波 打开蛋白质间的 交联键
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具体操作（微波修复）：
1) 将 切 片 放 入 0.01 M 柠 檬 酸 钠 缓 冲 溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温， 再加热，约4次，每次间隔补足液体， 防止干片。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
• 石蜡制片操作程序如下： （一）材料的采集与分割 （二）固定 （三）脱水 （四）透明 （五）浸蜡 （六）包埋（埋蜡、沉床） （七）修块 （八）切片 （九）粘片
• 1.1 材料的采集与分割 • 采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料 要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察 病理解剖，则要取病斑、病症部位。 • 采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带 回实验室进行分割固定。
• 石蜡制片是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里 面进行切片。 • 此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可 切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难 以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种 方法。 • 除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不 能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制 作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。该 法多采用旋转式切片机进行切片。
• 1.6. 包埋 • 包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质 地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从 温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。 再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面 朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒， 轻轻倒入熔蜡。
• 1.7.修块
• 将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块材料。然后按 照所需的切面，用单面刀片将小蜡块切成梯形，并可粗视到材 料切面。然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘接在载蜡器上。
• 1.5.透蜡 • 透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯 等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以 便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应 在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左 右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般 置于恒温箱0.5h。 • 放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放 入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。
免疫组化实验
免疫组化实验
• 主要内容
一.免疫组化原理及应用 二.免疫组化的基本流程 三.免疫组化的试剂及仪器 四.免疫组化的结果分析
免疫组化实验
一 免疫组化的原理
免疫组织化学又称免疫细胞化学， 是指带显色剂标记的特异性抗体在组 织细胞原位通过抗原抗体反应和组织 化学的呈色反应，对相应抗原进行定 性、定位、定量测定的一项新技术。
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它把免疫反应的特异性、组织化学的 可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包 括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放 大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗 原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病 原体以及受体等)。
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免疫组化的应用 免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面： ⑴恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； ⑵确定转移性恶性肿瘤的原发部位； ⑶对某类肿瘤进行进一步的病理分型； ⑷软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类 多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志 进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的； • ⑸发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范 围的确定。 • ⑹为临床提供治疗方案的选择。
• 1.9.粘片
• 切下来的切片经过镜检（根据情况也可不检），将符合要求的 切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘 片剂（可用蛋青和甘油各50ml，加1g 水杨酸混合而成），加几 滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用 拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。 • 切片前对洗净的载玻片用粘附剂进行处理是防止免疫组化过程 中组织掉片的关键：洗净的载玻片于1:50丙酮稀释的APES中浸 泡10～30s，取出后再放入纯丙酮中10～20s，涮去未与载玻片 结合的APES，取出晾干备用。
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二 免疫组化的基本流程
1.石蜡制片 2.脱蜡与水化 3.细胞通透、封 2.细胞通透、封 闭内源性过氧化 闭内源性过氧化 物酶 物酶 4.抗原修复、暴 露抗原决定簇 5.封闭非特异性 蛋白 6.一抗孵育 7.二抗孵育 8.SP 反应 9.显色 10.复染、脱水、 透明、封片
• 1.石蜡制片
1.防止脱片；2.使抗原 抗体结合更稳定。
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具体做法： 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周 围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，冰箱中取出后需37 ℃复温 45 min。
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6.二抗孵育
二抗:可以和一抗结合，并带有可以被 检测出的标记(如带荧光、放射性、化 学发光或显色基团），作用是检测一抗。
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5.一抗孵育
一抗:可以特异结合底物，就是识别出 我们想要检测的东西。一抗和底物结 合与否用肉眼是看不出来的。
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一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要， 包括孵育时间和抗体浓度。 • 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度， 其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗 体浓度有关，一般37度1-2h，然后4度过夜和 从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要 摸索。
• 注意事项： • （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 • （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏， 可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液， 然后于皿中加入高一级脱水剂。 • （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软， 助长材料的解体。 • （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则 会使组织变脆，影响切片。 • （5）如需过夜，应停留在70%酒精中。 • （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色 混浊现象。
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具体操作:
1)用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用预热 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加热几分钟，在临用前加 400 ul的30％H2O2。 2)PBS 溶液洗 3 次×3 min。
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抗原修复的主要方法:
常用的修复方法从强到弱一般 分为三种，高压修复、微波修复、 胰酶修复。
•为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进 行分割。分割时动作要迅速，以防材料萎 蔫。 •分割块的大小，宜小不宜大，切取的组织 块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以 组织块大小：1.5×1.5×0.2 cm为主，分 割后立即进行固定。
• 注意事项： • （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免 组织细胞的成分、结构等发生变化。 • （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择， 尽可能不要损伤所需要的部分。
2)100% 无水酒精： 2 次/5 min；
3)95% 酒精 2 min；
4)80% 酒精 2 min；
5)70% 酒精 2 min；
6)蒸馏水:5 min；
具 体 操 作
7)PBS 洗 3 ×3 min。
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2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶
(1)细胞通透
目的是使抗体能够充分地进入胞内 进行结合反应。一般用Triton X-100、 蛋白酶k等通透液。
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(2)封闭内源性过氧化酶
其主要目的是降低内源性过氧 化物酶的活性。在传统的ABC法和SP 法中，免疫组化反应结果容易受到 内源性过氧化物酶的干扰，必须用 过氧化氢等进行灭活。
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3. 抗原修复 暴露抗原决定簇
由于组织中部分抗原在甲醛或多 聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间 交联及醛基的封闭作用，从而失去抗 原性；通过抗原修复，使得细胞内抗 原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
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2.脱蜡与水化
脱蜡与水化的目的是确保抗体等其 他试剂能够充分与组织中抗原等结合发 生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶 性反应和浸洗不全，而产生非特异性背 景着色。 二甲苯和各级乙醇必须保持一定纯 度，不能混入其他杂质成分，而使染色 受到影响。
1)60 ℃×20 min→二甲苯：2次/10 min；