未知病原菌的分离鉴定
微生物菌种分离和鉴定技术
在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
液体培养基分离
不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液 体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
单细胞（孢子）分离
Technology
Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany
微生物菌种鉴定技术
1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、 1974(8)、1994(9)
伯杰氏鉴定细菌学手册
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1925–1932
图: Rep-PCR条码系统发育树(DiversiLab平台) Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) . 注：图片来源于Reclassification of ATCC® 16404TM and ATCC® 9642TM as Aspergillus brasiliensis.
Sequence Analysis (MLSA)
基因型鉴定技术水平
不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平
多相鉴定实例 ATCC16404黑曲霉 Aspergillus niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
标本中未知细菌的分离和鉴定
结论：现象与论点、 结论：现象与论点、论据
浓汁标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论： 结论：
咽拭子
分离培养 血平板） （血平板）
革兰染色
革兰染色
胆汁溶菌试验 奥普托辛试验
荚膜染色 石炭酸复红单染） （石炭酸复红单染）
？
粪便标本
SS平板 SS平板
结果观察
1、菌落观察 2、形态学观察
（二）生化反应 触酶试验： 触酶试验： H2o2
氧化氢酶
H2o + o2
(-) (+)
菌种：可疑菌落 菌种： 试剂：3%过氧化氢 试剂：3%过氧化氢 方法： 方法：见右图 结果： 结果：见右图
甘露醇实验
甘露醇生化反应管
药敏实验
浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果 观察
玻片凝集试验
粪便标本可疑菌生长现象及生化、 粪便标本可疑菌生长现象及生化、血清反 应结果观察
SS平板 SS平板 生长现象 形态学 特 征 单糖发酵试验 血清学试验
葡萄糖 乳糖
结论：现象与论点、 结论：现象与论点、论据
粪便标本可疑菌药敏实验结果
药品名称
抑菌圈直径
结论： 结论：
二、标本中未知肠道感染细菌 的分离鉴定程序
脓血便、 脓血便、肛拭子
标本 SS平板,EMB平板 SS平板,EMB平板 平板 选择/ 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质动力-靛基质-尿素 半固体琼脂培养基
血清学鉴定 生化反应
玻片凝 集试验
设计性实验
临床标本中病原菌的分离与鉴定
3.尿 3.尿 标本： 标本：尿液 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等 其他：革兰染液、靛基质试剂、 4.粪便 4.粪便 标本：肛门拭子 标本： 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、 动力-靛基质动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺 菌多价血清、玻片等 菌多价血清、
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
幼鹅感染鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏试验鸭疫是一种常见的传染病，主要感染家禽类动物，如鸭、鹅等。
其中，默氏杆菌是鸭疫的主要病原体之一，它具有强烈的毒力和传染性。
本文以幼鹅感染鸭疫的例子为出发点，从分离鉴定和药敏试验两个方面介绍默氏杆菌的特征及相关的治疗方法。
一、鉴定分离（一）样品收集和处理样品采集：选择幼鹅血液、皮肤等部位分泌物作为样品。
收集血液后，将其搅拌均匀，加入抗凝剂，防止凝固。
处理方法：将样品经过高速离心，过滤掉不需要的物质，然后将所得沉淀溶于PBS缓冲液中，使样品处于均质状态。
（二）细菌的分离与纯化将处理好的样品加入含有适量默氏增量寒天（MIA）的琼脂平板上，放置于温度适宜的培养箱中。
一般情况下，默氏杆菌的产生需要在38~40℃的条件下进行。
在24小时内，默氏杆菌会在琼脂平板上形成类似于针头的小型菌落，注意不要与其他类似的细菌混淆。
利用细胞化学方法，对被分离的细菌进行初步鉴定，了解其菌属、形态、颜色、大小等特征。
（三）生化试验生化试验是鉴定细菌种类及其属性的基础。
默氏杆菌具有产生氢气、蛋白质分解及黏稠素分泌等特点，因此，在此基础上，从细胞、营养及代谢方面考察其生化特征。
（四）分子生物学鉴定分子生物学技术可用来识别未知的病原菌。
通过基因扩增技术，对默氏杆菌进行检测，可以获得其基因序列及特征。
PCR、ELISA和AFLP等技术都可用于菌属鉴定，提高了细菌检测的准确度和灵敏度。
二、药敏试验药敏试验可以帮助医生选择最适合的药物治疗默氏杆菌引起的鸭疫。
尤其在临床治疗复杂的情况下，药敏试验成为治疗的重要手段。
目前，药敏试验的操作方法较为成熟，主要的步骤包括：（一）选择适宜的培养基不同的药物在不同的培养基上的敏感性存在差异。
因此，在选择药品之前，首先要选择适宜的培养基。
默氏杆菌对默氏增量寒天和含有血液的琼脂马铃薯培养基最为敏感。
（二）筛选敏感药物药敏试验可以同时检测多种药物对菌株的致死剂量，从而找到对特定细菌表现出高效杀灭作用的药物。
实验7标本中未知细菌的分离和鉴定
（三）实验方法与检验流程
直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性
标本
观察菌落性状、溶血性、色素
血琼脂平板
涂片、染色、镜检
挑取可疑菌落 生化反应测定
纯培养
致病性测定
血液
肉汤增
脑脊液 菌培养
（凝固酶、耐热核酸酶）
涂片染色镜检
（三）实验方法与检接涂片 革兰染色
动力 ± － ＋ ＋ ＋ ＋ －
H2S － － ＋ ＋ ± ＋ －
尿素 － － ＋ － － － －
埃希菌属 克雷伯菌属 变形杆菌
非致病 菌
乙型副伤寒
甲型副伤寒
伤寒杆菌
致病菌
痢疾杆菌
实验十
标本中未知细菌的分离和鉴定
致病菌的检验程序和常用项目
形态学检查
直接涂片 染色镜检
初步诊断
分离培养
形态特征
（常规培养或 生化试验
特殊培养）
血清学诊断
血清学试验 动物实验
药物敏感试验
明 确 诊
（沉淀反应、凝集试验、免疫标记技术等）
断
细菌的快速鉴定
(微生物数字编码分类鉴定法、血培养自动化检测系统、核 酸杂交技术、PCR技术、DNA芯片技术等）
＋/
－
＋/ － ＋
－
沙门菌
＋
－
＋
＋
－
变形杆菌 ⊕
－
＋/ － －
＋/－
肠道杆菌的血清学试验（玻片凝集试验）
材料
1. 菌种：伤寒杆菌培养物、痢疾杆菌培养物
2. 伤寒杆菌的诊断血清，志贺菌诊断血清、载玻片、生理盐水
方法
血清
生理盐水
肠道杆菌生化反应的结果
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
.
8
二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
项目10标本中未知细菌的分离和鉴定
项目10：标本中未知细菌的分离和鉴定【目的要求】熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法。
【实验内容】一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定（一）标本采集1．脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。
2．痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。
3．咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。
4．血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。
5．脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6．尿道、阴道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右；女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
（二）分离鉴定程序待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。
常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检（形态、排列、染色性）脓、痰、咽拭子分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板→↑挑取可疑菌落生化反应血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定↓药敏试验如培养液混浊时可涂片、染色、镜检（三）常见临床标本的检查方法1．脓拭子在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
【材料】（1）标本：脓拭子（2）培养基：血琼脂平板（3）兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片【方法】脓汁→革兰染色→镜检↓↑血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况↓致病力试验(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)。
牛多杀性巴氏杆菌未知型的分离鉴定及防治
现代农业科技2023年第6期动物科学牛多杀性巴氏杆菌未知型的分离鉴定及防治汪阳1马艳荣2仲荣3金映红4李威2薛晶4汪萍4陈古丽4颜成旭2马丽梅2夏俊4*（1新疆农业大学，新疆乌鲁木齐830000；2新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐830000；3阿勒泰地区畜牧工作站，新疆阿勒泰836500；4新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆乌鲁木齐830000）摘要以病死牛病变肺脏组织为研究对象，通过革兰氏染色和PCR鉴定确定多杀性巴氏杆菌分离株的血清型，进行分离菌株的小鼠致病性试验和药敏试验。
结果表明：该分离菌株为未知型多杀性巴氏杆菌，对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、乳酸环丙沙星高度敏感；小鼠多杀性巴氏杆菌最小致死量为1.2×108CFU/mL。
关键词牛；多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；防治中图分类号S858.23文献标识码A文章编号1007-5739（2023）06-0176-03DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.06.045开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Isolation,Identification and Control of Unknown Type of Pasteurella multocida in Cattle WANG Yang1MA Yanrong2ZHONG Rong3JIN Yinghong4LI Wei2XUE Jing4WANG Ping4CHEN Guli4YAN Chengxu2MA Limei2XIA Jun4*(1Xinjiang Agricultural University,Urumqi Xinjiang830000;2Xinjiang Uygur Autonomous Region Animal Health Supervision Institute,Urumqi Xinjiang830000;3Altay Prefecture Animal Husbandry Workstation,Altay Xinjiang836500;4Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy of Animal Science(Animal Clinical Medical Research Center,Xinjiang Academy of Animal Science),Urumqi Xinjiang830000)Abstract In this paper,diseased lung tissue of dead cattle was taken as the research object.The serotype of Pas-teurella multocida isolated strain was determined by Gram′s stain and PCR identification,and then pathogenicity test and drug sensitivity test of the isolated strain were carried out in mice.The results showed that the isolated strain was Pasteurella multocida of unknown type,which was highly sensitive to amikacin sulfate,levofloxacin,gentamycin sulfate and ciprofloxacin lactate.The minimum lethal dose of Pasteurella multocida in mice was1.2×108CFU/mL.Keywords cattle;Pasteurella multocida;isolation and identification;control基金项目新疆维吾尔自治区区域协同创新专项（科技援疆计划）（2021E02032）；2022年新疆维吾尔自治区中央引导地方项目（ZYYD2022B16）；新疆维吾尔自治区重大科技专项“新疆畜禽疫病防控体系质量提升工程”（2022273334）；新疆维吾尔自治区天山英才青年科技拔尖人才项目（青年科技创新人才培养）“牛羊幼畜群发病防控关键技术研究”（2022196128）。
病料中可疑病原菌的分离
病料中可疑病原菌的分离、培养与鉴定病料：怀疑为大肠杆菌、沙门氏菌或葡萄球菌感染的鸡或鸭画线方法2.细菌的移植挑取平板中的单个菌落制菌片作G染色镜检确定单菌落接种普通琼脂和麦康凯斜面37℃ 24-48h生化鉴定细菌纯培养划线方法3.生化鉴定纯培养接种生理生化培养基37℃ 24-48h鉴定1.单糖发酵管接种：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖2. 生理生化培养基接种：(1)普通肉汤37℃ 24-48h生长观察及Indole试验(2)蛋白胨水37℃ 24-48h Indole 试验(3)葡萄糖蛋白胨水37℃ 24-48h MR/VP(4)三糖铁培养基37℃ 24-48h 观察底层/斜面是产酸,还是产碱，底层是否产气/H2S附:葡萄球菌形态染色：球形或稍呈椭圆形，直径1.0um左右，排列成葡萄状。
葡萄球菌无鞭毛，不能运动。
无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。
易被常用的碱性染料着色，革兰氏染色为阳性。
其衰老、死亡或被白细胞吞噬后，以及耐药的某些菌株可被染成革兰氏阴性。
培养特性：营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和葡萄糖的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧。
28~38℃均能生长，致病菌最适温度为37℃，PH为4.5~9.8，最适为7.4。
在肉汤培养基中24小时后呈均匀混浊生长，在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。
不同种的菌标产生不同的色素，如金黄色、白色、柠檬色。
色素为脂溶性。
葡萄球菌在血琼脂平板上形成的菌落较大，有的菌株菌落周围形成明显的完全透明溶血环（β溶血），也有不发生溶血者。
凡溶血性菌株大多具有致病性。
生物学反应：多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气。
致病性菌株能分解甘露醇。
大肠杆菌大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周生鞭毛，能运动，无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气。
《医学微生物学》临床常见病原菌的培养与鉴定
《医学微生物学》临床常见病原菌的培养与鉴定病原菌的鉴定是将一个未知菌株按其生物学特征，经过与所有已知菌种进行比较后到一个已知菌种的分析过程。
根据感染特性选择合适的培养基，首先要明确被鉴定菌种已获得纯培养。
然后确定革兰氏染色性、形态，再按科、属、种逐步鉴定下来。
应该利用已具备的条件，尽可能地缩小鉴定范围，这是在作实验设计时必须想到的，要用最小数量的试验方法作出鉴定。
基于鉴定菌的特点，选用合适的鉴定体系，力求方法学简单，反应判断明确，价廉的方法。
血清学鉴定由于操作简便、快速、特异性高，给细菌学鉴定提供了快速诊断方法。
对培养困难的病原菌，可考虑应用基因水平的鉴定技术。
最后还要提示，对检测人员应把知识和经验运用到每一鉴定步骤。
【球菌】球菌主要引起化脓性炎症，故又称化脓性球菌。
包括葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌及淋病奈瑟菌等，根据革兰氏染色可将其分为两类，均无鞭毛和芽孢，少数可形成荚膜。
本实验要求了解化脓性球菌的形态特征及染色性、链球菌溶血素“O”试验；葡萄球菌、链球菌及奈瑟球菌的检验程序和主要的鉴定方法；肺炎链球菌Op—tochin敏感试验。
一、葡萄球菌属葡萄球菌属(Staphylococcus)的细菌常堆聚成葡萄串状。
能引起皮肤粘膜、多种组织器官的化脓性炎症，是最常见的化脓性球菌。
有的菌株还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征、毒性休克综合征等，又是医院内交叉感染的重要传染源。
近年来，耐药性菌株逐年增多。
临床上首先要与其他革兰氏阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定及致病性的检测。
[材料]1．菌种：葡萄球菌培养物。
2．培养基：血琼脂平板，普通琼脂平板，甘露醇发酵管，氧化、发酵(OF)管，甲苯胺蓝核酸琼脂。
3．试剂：兔血浆、3％H2O2、致敏胶乳／红细胞制剂。
4．其他：革兰氏染液、玻片、一次性卡片。
[方法]1．形态学观察：取普通琼脂平板上葡萄球菌培养物少许，涂片，革兰氏染色，镜检。
可见到葡萄状排列的革兰氏阳性球菌。
实验7标本中未知细菌的分离和鉴定资料
(-)
(+)
（甘—露）醇发（酵+试）验
二、标本中未知肠道感染细菌 的分离和鉴定
（一）实验目的
1、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤 2、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应
（二）实验器材
1、待检的粪便标本； 2、培养基：SS平板，生化反应管；普通
琼脂平板； 3、试剂：革兰染色液，生理盐水；药敏纸
箱、显微镜、载玻片等
（三）实验方法与检验流程
直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性
标本
观察菌落性状、溶血性、色素
血琼脂平板
涂片、染色、镜检
挑取可疑菌落 生化反应测定
纯培养
致病性测定
血液
肉汤增
脑脊液 菌培养
（凝固酶、耐热核酸酶）
涂片染色镜检
（三）实验方法与检验流程
脓拭子
分离培养 （血平板）
直接涂片 革兰染色
一、标本中未知病原性球菌 的分离和鉴定
（一）实验目的
1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方 法
2、掌握药物敏感试验
（二）实验器材
1、待检的脓汁标本； 2、培养基：血琼脂平板，生化反应管；普
通琼脂平板； 3、试剂：革兰染色液，生理盐水；药敏纸
片，3%过氧化氢； 4、其它：接种环、接种针、酒精灯、培养
＋/
－
＋/ － ＋
－
沙门菌
＋
－
＋
＋
－
变形杆菌 ⊕
－
＋/ － －
＋/－
肠道杆菌的血清学试验（玻片凝集试验）
材料
1. 菌种：伤寒杆菌培养物、痢疾杆菌培养物
2. 伤寒杆菌的诊断血清，志贺菌诊断血清、载玻片、生理盐水
病虫害防治中的病原菌分离与鉴定技术
病虫害防治中的病原菌分离与鉴定技术随着农业的发展和气候变化的影响，病虫害对作物的危害日益突出，给农民朋友们带来了巨大的损失。
为了高效地防治病虫害，病原菌的分离与鉴定技术在农业生产中变得至关重要。
本文将介绍病虫害防治中的病原菌分离与鉴定技术及其应用。
1. 病原菌分离技术病原菌分离技术是研究病原菌特性和分类的重要手段，其过程包括取样、分离纯种和培养等步骤。
首先，我们需要在病害的田间表现明显的部位进行采样。
采样时我们要选择健康的、有一定病害程度的植株，避免受到其他病原菌的干扰。
在采样完成后，我们需要将样品送至实验室进行分离纯种。
分离纯种的过程主要包括从样品中挑选病原菌进行单菌落培养、培养基的制备和菌落转接等步骤。
这些步骤旨在确保分离到的病原菌是单一的纯种，以便进行后续的鉴定工作。
2. 病原菌鉴定技术病原菌鉴定技术是通过对分离纯种进行一系列的实验和分析，确定病原菌的分类、形态特征、生理特性和分子标记等信息。
常用的鉴定方法包括形态学观察、生理生化试验和分子生物学技术。
在形态学观察中，我们可以通过放大镜或显微镜观察病原菌的菌落形态、菌丝特征和孢子形态等，从而对其进行初步的分类。
生理生化试验可以通过菌落特征、生长速度、营养需求和代谢产物等进行分析，以进一步确定病原菌的种属归属。
分子生物学技术在病原菌鉴定中得到了广泛应用。
其中，PCR (聚合酶链式反应) 和DNA测序是常用的方法。
通过PCR技术，我们可以扩增特定的基因片段，从而得到病原菌的特异性DNA序列。
而DNA 测序则可以对PCR扩增产物进行测序分析，从而确定病原菌的属种和亲缘关系。
3. 病原菌分离与鉴定技术的应用病原菌分离与鉴定技术广泛应用于病虫害防治领域。
通过对病害样品进行病原菌分离与鉴定，可以及时准确地判断病害的病原菌，并针对性地制定防治策略。
除了在农作物病虫害的防治中应用，病原菌分离与鉴定技术还可以用于果树、蔬菜和花卉等园艺作物的病害防治。
此外，病原菌分离与鉴定技术还在新品种选育、抗病育种和病原菌演化等方面发挥着重要作用。
病原体分离与鉴定实验技术
病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定1. 样本采集与处理首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定1. 细胞培养法病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进行病毒的鉴定。
3. 血清学检测病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定1. 样本采集与处理对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
7未知病原菌的分离鉴定
Widal test (5人/组)
材料： 病人未知血清：1#，2#，3# 菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag） 方法：每组1块多孔板/24支试管； 每人2支吸管；
方法
1
NS 菌液(摇匀)
(4种,1种/人)
弃0.5ml于消毒缸
2
0.5
3
0.5
4
0.5
5
未知病原菌的分离鉴定
病原菌检测程序
初步诊断
形态结构 直接涂片、染色、镜检 分离、鉴定 观察培养特征、形态特征
生化试验(书p17-18) 血清学试验(玻片凝集法) 动物试验(产毒性、分离) 药物敏感试验 病原菌抗原检测 分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片
核酸 )
其他检测技术
临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序
– 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等
实验方案
尿液
离心沉淀 1500转，10分钟
第1次
分离培养 （EMB平板）
革兰染色
第2次
革兰染色
克氏双糖铁斜 面培养基
动力-靛基质-尿素半 固体琼脂培养基
第3次
观察结果
观察结果
完成靛基质试验
实验材料
粪便
– 标本：肛拭子（1#、2#）
– 培养基：
• EMB平板 • 克氏双糖铁斜面培养基 • 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
进程安排
– 实验分3次进行
实验材料
脓汁 – 标本：脓拭子 – 培养基：血琼脂平板 – 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、 玻片等
实验方案
脓拭子
第1次课
分离培养 （血平板）
革兰染色
第2次课
革兰染色
病原菌的分离鉴定
竭诚为您提供优质文档/双击可除病原菌的分离鉴定篇一：常见病原菌采样分离过程金黄色葡萄球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）奶样的采集：采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。
（2）乳房皮肤拭子用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。
拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
（3）鼻腔拭子用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。
菌种的初步分离首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。
需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。
2、菌种的保存2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。
3、菌种的复苏如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。
肠球菌采样分离过程1、样本采集及初步分离（1）肛门拭子以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
（2）泄殖腔拭子以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。
粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定
实验十粪便标本中肠道致病菌的的分离鉴定实验目的和要求1、掌握脓汁标本中常见病原菌分离和鉴定方法2、掌握药物敏感试验3、掌握肠道杆菌分离和鉴定的一般步骤4、熟悉肠道杆菌鉴定生化反应和血清学反应实验内容一、脓汁标本中未知病原菌的分离和鉴定二、粪便标本中肠道致病菌的分离和鉴定一、标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序直接涂片染色镜检：观察细菌形态、排列、染色性观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板涂片、染色、镜检挑取可疑菌落生化反应测定纯培养致病性测定（甘露醇、凝固酶等）标本血液脑脊液肉汤增菌培养涂片染色镜检二、标本中未知肠道感染细菌的分离鉴定程序标本脓血便、肛拭子选择/鉴别培基生化反应血清学鉴定克氏双糖铁培养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基玻片凝集试验SS平板,EMB平板设计性实验临床标本中病原菌的分离与鉴定设计性实验1.脓汁标本：脓拭子培养基：血琼脂平板其他：3%H2O2、（兔血浆）、生理盐水、革兰染液、玻片等2.痰标本：咽拭子培养基：血琼脂平板其他：生理盐水、10%胆盐、革兰染液、玻片等3.尿标本：尿液培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等4.粪便标本：肛门拭子培养基：伊红美兰琼脂平板、克氏双糖铁斜面培养基、动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等脓拭子分离培养革兰染色（血平板）革兰染色触酶实验甘露醇实验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：浓汁标本，用分离划线方法接种血平板，37℃培养18-24h以后观察结果。
重点：色素和溶血现象•2、革兰染色、观察形态学特征：取可疑菌落少许涂片，革兰染色、镜检。
结果观察•1、菌落观察•2、形态学观察（二）生化反应•触酶试验：(-) (+)H 2o 2H 2o o 2氧化氢酶+菌种：可疑菌落试剂：3%过氧化氢方法：见右图结果：见右图甘露醇实验•甘露醇生化反应管药敏实验浓汁标本可疑菌生长现象及生化反应结果观察形态学特征血平板生长现象触酶试验甘露醇试验结论：现象与论点、论据浓汁标本可疑菌药敏实验结果药品名称抑菌圈直径结论：咽拭子革兰染色革兰染色胆汁溶菌试验奥普托辛试验荚膜染色（石炭酸复红单染）分离培养（血平板）？粪便标本SS平板克氏双糖铁斜面培养基动力-半固体培养基生化反应管观察结果糖发酵试验玻片凝集试验革兰染色H2S试验尿液离心沉淀1500转，10分钟分离培养（EMB平板）革兰染色革兰染色克氏双糖铁斜面培养基动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基观察结果观察结果观察结果完成靛基质试验方法：•1、分离培养、观察菌落特征：粪便标本，用分离划线方法接种SS平板培养基37℃培养18-24h以后观察结果。
病原菌分离培养与鉴定
细菌分离培养与鉴定
细菌学诊断的一般程序
脓/痰/尿
涂片、染色、镜检
标本
分离培养
纯培养
血、脑脊 液等
增菌
生化反应 血清学鉴定 药敏试验 动物实验
11
细 菌 专性厌氧菌
纯
培
养 兼性厌氧菌 物
鉴 定
的
鉴
需氧菌
定
形态和染色 菌落特征 生化试验 药物敏感试验 毒力试验 病原菌抗原 生物芯片检测
性能特点
自动化程度较高 、检测速度快、 可鉴定细菌种类 及药敏试验种类18
细 菌 专性厌氧菌
纯
培
养 兼性厌氧菌 物
鉴 定
的
鉴
需氧菌
定
形态和染色 菌落特征 生化试验 药物敏感试验 毒力试验 病原菌抗原 生物芯片检测
动物试验：细菌毒力的测定 * LD50 * ID50
小 鼠
豚鼠
家兔
细 菌 专性厌氧菌
细菌感
细 菌 专性厌氧菌
纯
培
养 兼性厌氧菌 物
鉴 定
的
鉴
需氧菌
定
形态和染色 菌落特征 生化试验 药物敏感试验 毒力试验 病原菌抗原 生物芯片检测
（四）生物芯片技术
将核酸片段、蛋白质或酶、抗原或抗体、细胞及组织 等生物样品有序地固定于硅片、尼龙膜等固相支持物上 在一定的条件下进行生化反应。 用化学荧光法、酶标法或同位素法显示反应结果， 通过特定的仪器读取与收集数据，并用软件进行数据 分析，从而判断样品中靶分子的种类和数量。
Staphylococcus aureus
G- Neisseria meningitidis Escherichia 7coli
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-
+
触酶实验
实验操作与结果
凝固酶实验：
1. 取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理 盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。
2. 向菌悬液中加1滴兔血浆并混合，观察结果。
-
+
血浆凝固酶实验
实验材料
痰
– 标本：咽拭子 – 培养基：血琼脂平板 – 其他：生理盐水、10%胆盐、Optochin纸片、
革兰染液、玻片等
血清学鉴定
生化反应
玻片凝 集试验
未知肠道杆菌的分离鉴定程序
伊红美蓝平板--- EMB
Eosin-methylene blue agar,EMB
克氏双糖铁试验
Double sugar iron slant
枸橼酸盐利用试验 Citrate slant
吲哚试验
Indole broth
玻片凝集
设计性实验
进程安排
– 实验分3次进行
实验材料
脓汁
– 标本：脓拭子 – 培养基：血琼脂平板 – 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、
玻片等
实验方案
脓拭子
第1次课
分离培养 （血平板）
革兰染色
第2次课 革兰染色
触酶实验 血浆凝固酶实验落置玻片上； 2. 滴加1～2滴3%H2O2，观察结果；
实验报临告床标本中病原菌的分离与鉴定
班级 ________ 组别 _________ 姓名 _________ 学号 _________ 日期 ________ 材料 1待. 检标本： 2.培养基： 3. 其他： 方法
结果
（包括讨对论结果的分析、结论以及尚需追加实验等）
肥达试验 (Widal test)
用已知的伤寒沙门菌O、H抗原 、甲型副伤寒沙门菌、肖氏、希 氏沙门菌H抗原的诊断菌液，与 患者血清作定量凝集试验，检测 患者血清中的相应抗体，辅助诊 断伤寒、副伤寒。
Georges Widal in 1896 (French)
Widal test
正常值： 诊断伤寒：O凝集效价>1:80, H凝集效价>1:160; 诊断副伤寒：O凝集效价>1:80, H凝集效价>1:80 才有诊断价值.
直接涂片、革兰染色、镜检(形态,排列,染色性) 临床标本
血琼脂平板/巧克力血琼脂平板(菌落性状,溶血性,色素)
可疑菌落
涂片,染色,镜检
纯培养
生化反应 致病性测定 药敏试验
思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？
查病原
脓血便、肛拭子
标本
SS平板,中国兰,EMB
选择/鉴别培基
双糖发酵, 橘橼酸 盐利用试验,尿素, 靛基质试验……
少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”: 早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下
Widal test (5人/组)
材料： 病人未知血清：1#，2#，3# 菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）
方法：每组1块多孔板/24支试管； 每人2支吸管；
方法
弃0.5ml于消毒缸
123456
NS
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml
动态观察：抗体效价随病程延长而上升； 双份血清升高4倍或以上；
O与H抗体的诊断意义： O↑，H↑---肠热症(伤寒或副伤寒)的可能性大 O↓，H↓---患病的可能性小 O不高，H↑---预防接种 / 非特异性回忆反应 O↑，H不高---感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有 交叉反应的其他沙门菌感染
二、方法 (实验程序)
三、结果
四、讨论
实验目的
– 熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序 – 学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法
实验要求
– 针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定 – 实验前制定方案，实验后写出实验报告
实验分组
– 5人/组 – 1套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便）
实验方案
咽拭子
第1次
分离培养 （血平板）
革兰染色
第2次 第3次
革兰染色 荚膜染色
胆汁溶菌实验
观察奥普托辛实验结果
奥普托辛实验
实验操作
奥普托辛实验：
1. 挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处； 2. 37℃培养18～24小时，观察结果。
实验操作
胆汁溶菌实验（平板法）：
1. 在血平板上标记单个菌落 2. 直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液 3. 将平板37℃孵育20～30分钟，观察结果
未知血清(1:10) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验操作
荚膜染色：石炭酸复红单染
1.涂片、自然干燥、火焰固定； 2.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。
实验材料
尿
– 标本：尿液 – 培养基：
• EMB平板 • 克氏双糖铁斜面培养基 • 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
– 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等
实验方案
尿液
离心沉淀 1500转，10分钟
第1次
分离培养 （EMB平板）
革兰染色
第2次 革兰染色
克氏双糖铁斜 面培养基
动力-靛基质-尿素半 固体琼脂培养基
第3次
观察结果
观察结果 完成靛基质试验
实验材料
粪便
– 标本：肛拭子（1#、2#） – 培养基：
• EMB平板 • 克氏双糖铁斜面培养基 • 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
– 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血 清、志贺菌多价血清、玻片等
实验方案
肛门拭子1、2
第1次
EMB平板
第2次
克氏双糖铁斜 面培养基
第3次
观察结果
动力- 靛基质- 尿素 半固体琼脂培养基
观察结果
完成靛基质试验
玻片凝集试验
讨论内容
针对实验步骤的讨论； 对结果的分析； 还需要进一步做哪些实验； 此次实验成功或需要改进的地方； 其他
预习：肥达反应
未知病原菌的分离鉴定
病原菌检测程序
初步诊断
直接涂片、染色、镜检 形态结构 分离、鉴定 观察培养特征、形态特征
生化试验(书p17-18) 血清学试验(玻片凝集法) 动物试验(产毒性、分离) 药物敏感试验
病原菌抗原检测
分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片 其他检测技术
核酸 )
临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序
临床标本中病原菌的分离与鉴定
一、材料： 5人/组
1.待检标本： 脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子2#
2.培养基：血平板
EMB平板 克氏双糖铁斜面 动力-靛基质-尿素半固体
3块/组 3块/组 3支/组 3支/组
3.其他：革兰染液、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、
3%H2O2、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清