微生物实验4 芽孢观察
细菌的芽孢染色
3.在涂片上加2～3滴孔雀石绿染色液，然后在酒精灯上缓 缓加热（注意不能使染色液沸腾），必要时可再滴加少许 染色液。加热时间从冒蒸汽时开始计算2～3分钟。
4.倾掉染色液。等待玻片冷却后，用水冲洗至无染色液为止。
５.用番红复染１～２分钟，水洗至无染色液，用吸水纸除去 残留水分。
６.用油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
微生物学实验
实验四 细菌的芽孢染色
实验目的 1. 了解细菌的芽孢染色原理。 2. 掌握细菌的芽孢染色方法。
实验原理 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理， 用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。 芽孢壁厚，透性低、着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱 性染料如孔雀石绿在加热条件下进行染色时，弱碱性染料不仅可以 进入菌体，而且也可以进入芽孢。 进入菌体的染料通过水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。 用复染液（番红）染色，菌体和芽孢因呈现不同的颜色而易于 区别。
实验器材 （一） 显微镜，香柏油，二甲苯，载玻片，镊子，酒精灯，滴管，烧杯， 接种环，5%孔雀石绿染色液，番红染色液，吸水纸。 （二） 苏云金芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌
实验步骤
1. 取干净载玻片，加一滴单蒸水，然后用接种环挑取适量 苏云金芽孢杆菌涂片。
2. 将玻片反复在酒精灯上方通过几次（用手指触摸涂片反面， 以不汤手为宜），对标本进行干燥、固定。
蜡状芽孢杆菌
芽孢染色
注意事项
１.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢 仍保留在菌体上为宜。 ２.染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
实验思考
１.用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？为什么？ ２.芽孢染色为什么要加热?为什么芽孢和菌体能染成不同的颜色?
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.
实验4放线菌、酵母菌、霉菌形态观察.实验四放线菌、酵母菌、霉菌形态观察（一）放线菌的形态观察1 目的观察放线菌的基本形态特征掌握培养放线菌的几种方法2 原理放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。
放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。
孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。
孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。
它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。
放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。
3 材料3.1 菌种灰色链霉菌(Str. griseus),天蓝色链霉菌(Str. coelicolor),细黄链霉菌（Str.microflavus）。
3.2 培养基高氏1号培养基。
3.3 器皿培养皿，载玻片、盖玻片、无菌滴管、镊子、接种环、小刀(或刀片)、水浴锅，显微镜，超净工作台，恒温培养箱。
4 流程4.1插片法: 倒平板→插片→接种→培养→镜检→记录绘图4.2压印法: 倒平板→划线接种→挑取菌落→加盖玻片→镜检→记录绘图4.3埋片法: 倒琼脂→切槽→接种→培养→镜检→记录绘图5 步骤5.1插片法5.1.1倒平板将高氏1号培养基熔化后，倒10~12毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用.5.1.2插片将灭菌的盖玻片以45度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为1/2或1/3(图5-1)。
5.1.3接种与培养用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置28℃培养3～7天。
5.1.4观察培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。
直接在显微镜下观察。
5.2压印法5.2.1制备放线菌平板同5.1.1。
在凝固的高氏1号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线菌菌落。
芽孢杆菌糖酵解实验现象
芽孢杆菌糖酵解实验现象
芽孢杆菌产酶酵解葡萄糖为乳酸和乙酸的实验是一种经典的微生物学实验，该实验的
主要过程包括菌种接种、培养基制备、培养、振荡、取样等步骤。
其主要目的是了解芽孢
杆菌的生长特性、代谢途径和代谢产物，以及不同物质对其生长和代谢的影响。
在该实验中，首先将芽孢杆菌接种在含有葡萄糖的液体培养基中，经过一定时间的培养，芽孢杆菌开始进行糖酵解代谢，将葡萄糖分解为乳酸和乙酸。
此时，培养液的pH下降，并伴随着乳酸和乙酸等有机酸的产生，导致培养基呈现酸性反应。
接着，通过荧光显微镜观察芽孢杆菌的生长情况，可以发现芽孢杆菌呈现长杆状、不
具有明显的鞭毛和纤毛结构。
随着培养时间的延长，芽孢杆菌的生长速度逐渐加快，产生
的代谢产物也逐渐增加。
此外，通过对不同浓度的葡萄糖、不同时间、不同pH条件下菌群生长和糖酵解代谢的影响进行探究，可以进一步了解芽孢杆菌的生长特性和代谢途径。
例如，当葡萄糖浓度较
高时，菌群的生长速度明显加快，产生的代谢产物也相应增加，而当pH值过低或过高时，菌群的生长和代谢都会受到影响。
总之，芽孢杆菌糖酵解实验是一种常用的微生物实验，通过该实验可以深入了解微生
物的生长特性、代谢途径和代谢产物，为探究微生物的生命活动提供了实验基础。
实验四-微生物的菌落形态观察、平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)
四、菌种衰退的原因
▪ 基因突变－－主要原因 ▪ 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退 ▪ 2、表型延迟造成菌种衰退 ▪ 3、质粒脱落导致菌种衰退 ▪ 连续传代－－加速衰退 ▪ 不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退
五、菌种衰退的防止
▪ 控制传代次数 ▪ 创造良好的培养条件 ▪ 利用不易衰退的细胞移种传代 ▪ 采用有效的菌种保藏方法 ▪ 讲究菌种选育技术 ▪ 定期进行分离纯化，测试性能
干燥或较干燥 小而紧密
丝状交织，紧密 细而均匀
干燥 大而疏松或大而致密
丝状交织 粗而分化
菌落透明度
菌落与培养 基结合程度
菌落颜色 参 考 菌落正反面 特 颜色的差别 征
菌落边缘
细胞生长速度
气味
透明或稍透明 不结合 多样 相同
一般看不到细胞 一般很快
一般有臭味
稍透明
不透明
不结合
牢固结合
单调，一般呈乳脂或矿 烛色，少数红色或黑色
实验四 微生物的菌落形态观察、 平板菌落计数及菌种保藏
目的要求
1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态 特征，并加以区分。
2、掌握平板菌落计数的原则和方法。 3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，
并接种于斜面，进一步加强无菌操作技 术。 4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见 方法。
实验内容
▪ 微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、 霉菌、酵母菌——放在后面介绍）
做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 （4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产
品。
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
螺旋平板原理
接种针往外移
动同时自动将 样品稀释1000 倍。
第四组微生物大实验实验报告
微生物大实验——土壤中芽孢杆菌的分离及鉴定实验报告学院：生命科学学院专业：生物技术班级：组数:学号:姓名:前言芽孢杆菌是能形成芽孢(内生孢子)的杆菌。
芽孢是休眠体，不是繁殖体。
绝大多数是一个菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内,由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。
核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。
芽孢杆菌属是大的(4–10um), 革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。
该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。
芽孢杆菌属可分为以下亚群：多粘芽孢杆菌、枯草杆菌（包括蜡样杆菌和地衣芽孢杆菌）、短芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌。
芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低PH值的有益微生物，本实验从土壤中分离出15株芽孢杆菌，从中挑选出一株芽孢杆菌进行生理生化鉴定，以及分子鉴定。
通过进一步的实验，了解到其生理生化特点。
一、实验目的：掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。
将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。
二、实验原理：芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。
，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。
三、实验仪器材料：1、仪器：显微镜、培养皿、试管、三角瓶、烧杯、移液管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱、电泳仪、PCR仪、提取DNA 试剂盒2、材料：培养基：LB培养基、淀粉培养基、孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH 溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇、硝酸盐、葡萄糖、甘露醇、阿拉伯糖、木糖四、实验步骤：（一）、菌种的分离和纯化1、取样2、LB培养基的配制：1L水、10g蛋白胨、5g牛肉膏、10g Nacl、15g琼脂、120℃灭菌30分钟待用3、平板及斜面的制备4、制备土壤菌悬液：称取土样约1g土壤放入盛有9ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上150r/min,振荡10min。
实验报告2-细菌的荚膜染色、芽孢染色及其运动性观察实验报告
细菌的荚膜染色、芽孢染色及其运动性观察实验报告马子午生命科学学院食品科学与工程专业 14101班 02号1.引言1.1实验目的学习荚膜染色技术，观察和分辨细菌的荚膜形态，进一步理解细菌细胞的特殊结构；了解细菌芽孢染色的原理意义，掌握芽孢染色的方法。
学习水浸片的制作方法，观察细菌的运动。
1.2实验原理芽孢染色法：芽孢具有厚而致密的壁，通透性低，对各种不利因素如高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。
因此，当用一般染色方法染色时，只能使菌体着色，芽孢不易着色（芽孢呈透明）或仅显很淡的颜色。
威力使芽孢着色便于观察，需采用特殊染色法——芽孢染色法。
先用一弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件在进行长时间染色，此染料不仅可以进入菌体，也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经睡洗脱掉，而进入芽孢的染料则难以透出。
若再用复染液（如番红染液）或衬托染液（如黑色素液）处理，芽孢和菌体就呈现不同的颜色，借此将芽孢与菌体区别开。
荚膜染色法：荚膜的主要成分是多糖，多糖与染料亲和力差，不易着色，但荚膜通透性较好，某些染料可通过荚膜使菌体着色，正因如此，染色后呈浅色或无色的菌体就形成了一个明显的色差，荚膜染色常采用负染法，即将背景染成淡蓝色，此法使菌体和背景显色以衬托无色的荚膜。
细菌的运动性观察：细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的主要特征之一，因鞭毛较细，在普通光学显微镜下不易观察，但有鞭毛的细菌在液体中能借助鞭毛的旋转和摆动使菌体能定向的运动，可以借此判断细菌是否有鞭毛。
2.材料与方法2.1材料与试剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），孔雀绿，番红染液，无菌水，6%的葡萄糖，胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus），黑色素液，甲醇，甲基紫染液，香柏油，二甲苯。
2.2仪器与设备显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，接种环，镊子，试管，凹玻片，擦镜纸，吸水纸。
2.3方法与步骤2.3.1细菌的芽孢染色法取一支试管，滴一滴无菌水，用接种环取2~3环枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）充分混合成菌悬液，再滴加两滴孔雀绿，沸水浴15~20分钟后用接种环取3~5环菌悬液涂抹在载玻片上，自然干燥，固定，冷却后水洗至水流无色，用吸水纸吸干后滴加番红染液复染5分钟，用吸水纸吸干多余染料，在显微镜下镜检。
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
芽孢染色及酵母菌的观察
芽孢染色及酵母菌的观察作者：喻曙光学号：。
生院10级生命基地班组别：生北308周五第四组同组者：。
实验目的1、学习芽孢染色法，了解芽孢的形态特征。
2、观察酵母菌的形态及出芽方式，区分死酵母及活酵母细胞。
3、学习酵母子囊孢子的观察方法。
实验材料菌种枯草芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物,梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，酿酒酵母。
溶液和试剂孔雀绿水溶液美蓝染液番红染液95%乙醇。
仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，载玻片夹子，滴管，无菌水，显微镜，接种环等。
实验原理（一）细菌芽孢的染色及观察简单染色法适用于一般的微生物菌体染色，而某些微生物具有一些特殊的结构，如芽孢、荚膜和鞭毛，对它们进行观察前需要进行针对性染色。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。
是否产生芽孢及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈现不同的颜色而便于区别。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低而不易着色，但是，芽孢一旦着色就难以被脱色。
利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿或石炭酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍然保留。
再用对比度大的复染剂染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。
（二）酵母菌的观察单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数采取出芽方式进行无性生殖，也可以通过结合产生子囊孢子进行有性生殖。
由于细胞个体大，采取涂片的方法制片可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。
同时采用美兰染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴别。
微生物实验：酵母菌与霉菌的形态观察
微生物实验：酵母菌与霉菌的形态观察实验四酵母菌与霉菌的形态观察一. 实验目的1. 2. 3. 4.观察酵母菌的形态与结构并掌握其特征。
观察霉菌的菌落特征，学会霉菌的一般制作方法。
观察并掌握各种霉菌的个体形态及生长繁殖方式。
进一步熟悉显微镜的使用。
二. 实验原理酵母菌是一类单细胞真菌，一般呈圆形、椭圆形，无性繁殖以芽孢为主，也有少数是裂殖，有些酵母菌能产生囊孢子，有的能形成假菌丝。
酵母菌的菌落似细菌菌落，但较大且厚，多呈白色，少数为红色。
酵母菌在液体中生长可形成菌膜、菌环、沉淀和浑浊。
酵母菌的细菌结构较完善，即有壁、膜、质、核等结构。
酵母菌的细胞形态、繁殖方式和培养特征均为菌种鉴定的依据。
酵母活细胞新陈代谢旺盛，活力强，复原力也强，假设无毒的染料进入细胞，既被复原脱色，但死细胞及代谢作用缓慢的老弱细胞无此复原力。
美兰是无毒染料，且能被活细胞复原成无色，故可用来区别细胞的死活。
霉菌是一些小型丝状真菌、单细胞〔根霉、毛霉〕或多细胞〔曲霉、青霉〕，其细胞结构与酵母类似，同属真核细胞。
霉菌形态较复杂，个体较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。
其菌丝分为气生菌丝与营养菌丝〔菌丝比放线菌粗得多〕观察时请注意菌丝是否具有横膈膜、有无假根、无性繁殖时形成何种孢子，孢子着生方式以及孢子头的构造等，以区别各种不同霉菌的形态。
霉菌菌落由分枝状菌丝组成，较疏松，呈毛状、棉絮状、绒毛状或毡状。
由于不同霉菌形成的孢子均有不同颜色、构造、性状，故菌落外表呈现出不同的结构和色泽特征。
菌丝一般呈白色或灰白色，菌落中心的菌丝较老，先产生孢子，故常形成同心圆。
三. 实验器材1. 菌种：面包酵母、根霉、曲霉、青霉。
2. 仪器：显微镜。
3. 其它：生理盐水、乳酸酚棉兰染液、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、美兰、镊子、大头针。
四. 步骤与方法1. 酵母菌细胞形态观察〔1〕制片：用接种环挑取一环面包酵母菌种于载玻片上的一滴美兰染液中混匀，盖上盖玻片静置4~5分钟。
芽孢染色法实验报告
芽孢染色法实验报告芽孢染色法实验报告引言：芽孢染色法是一种常用的微生物实验方法，用于鉴定和观察细菌的芽孢形态和结构。
本实验通过对芽孢的染色和显微镜观察，旨在了解芽孢的特征和鉴定微生物。
实验材料和方法：材料：培养基、细菌液、石蜡刀、石蜡、石蜡刷、显微镜等。
方法：1. 取一片培养基，加入细菌液并充分混合。
2. 将混合液倒入培养皿中，并在培养皿中心划出一条刀口。
3. 将培养皿置于恒温箱中，在适当的温度下培养一段时间，使菌落生长并形成芽孢。
4. 取一片玻片，将石蜡刀预热至适当温度，刮取培养皿中的芽孢。
5. 将刮取的芽孢涂在玻片上，并用石蜡刷均匀涂抹。
6. 将玻片放入石蜡中，使其固定。
7. 将固定的玻片放入显微镜下观察和拍摄。
结果与讨论：通过芽孢染色法，我们观察到了芽孢的形态和结构，并进行了鉴定。
芽孢的形态：芽孢是一种细菌的生殖结构，通常呈椭圆形或圆柱形。
在显微镜下观察，芽孢的外部有一个坚硬的壳，内部则是细胞质和核酸物质。
芽孢的大小和形状可能因不同的细菌而异。
芽孢的结构：芽孢的结构包括中心小体、核心区、内外壳等部分。
中心小体是芽孢的核心，含有DNA和其他重要的细胞质成分。
核心区是由中心小体周围的细胞质组成，其中包含了细胞的各种酶和营养物质。
内外壳是芽孢的保护层，能够抵抗外界环境的压力和不良条件。
鉴定微生物：通过观察芽孢的形态和结构，可以初步鉴定微生物的种类。
不同种类的微生物芽孢在形态和结构上可能存在差异，因此可以通过对比已知的芽孢特征，来判断未知微生物的种类。
此外，芽孢染色法还可以帮助鉴定微生物的生长条件和适应性。
实验中的注意事项：在进行芽孢染色实验时，需要注意以下几点：1. 实验操作要严格遵守无菌操作规范，以避免外界细菌的污染。
2. 实验过程中要注意安全，避免接触有害物质和高温设备。
3. 实验前要熟悉显微镜的使用方法，并保持显微镜的清洁和调试。
4. 实验后要及时清洗和消毒实验器材，以防止细菌的传播和感染。
芽孢染色法,实验报告(共4篇)
芽孢染色法,实验报告(共4篇)第一篇：芽孢染色法的介绍芽孢染色法是一种常见的微生物学实验方法，用来鉴定芽孢菌属的微生物。
芽孢是一种耐热、抗干燥的微生物，具有高度的抵抗力。
芽孢染色法是通过对芽孢进行特定的染色方法，将其区分出来。
整个过程需要一定的技术和经验，但是准确性较高，具有广泛的应用价值。
芽孢染色法通常采用的是后盖玫瑰染色法，这种方法可以使芽孢显现为紫色或红色，而其他细胞则呈现粉红色。
这种异染色效应可以清晰地区分出芽孢与其他微生物。
整个实验流程需要先将样品制备，然后进行固定、染色、脱色和显微观察等过程。
其中，脱色工作至关重要，需要根据样品类型和染色结果进行不同程度的脱色处理。
芽孢染色法在微生物学研究、食品卫生监测、化学工业、制药、农业等领域都有广泛的应用，并被广泛视为一种可靠的检测手段。
芽孢染色法是鉴定芽孢菌的常用方法之一，样品制备是整个实验流程的关键步骤之一。
样品采集需要注意无菌操作，以免在采集、贮存、传递过程中造成样品的污染。
通常采集的样品包括饮用水、土壤、食品、医院等具有可能存在芽孢菌属的环境。
样品制备主要分为前处理和后处理两个环节。
前处理通常包括样品的筛选、洗涤和杀菌处理。
样品筛选的过程中需要去除杂质和不易筛选的部分。
洗涤过程是为了去除样品表面的污垢、腐殖质和防止其他细菌的污染。
杀菌处理时，要选择合适的杀菌方法，同时对杀菌剂的用量和时间进行控制。
后处理通常包括提取和处理芽孢。
提取芽孢的方法通常采用加热和化学处理的方法，让其他微生物死亡，而芽孢则不受影响。
具体的处理方法根据实验需要和样品类型进行定制。
整个样品制备过程需要注意的是，要保持严谨的无菌操作，避免在制备过程中引入其他细菌，影响实验结果。
芽孢染色法是一种特殊的染色方法，需要严格控制每一个步骤。
对于不同的样品类型和设备要求，具体的操作步骤可能会有所不同。
一般而言，芽孢染色法的操作流程包括：准备工作、固定样品、染色、脱色和显微观察。
准备工作：包括准备好所需试剂和设备，做好垃圾清理和无菌操作。
芽胞染色及的观察照片
细菌芽孢染色及酵母菌观察标准实验结果1.细菌芽孢染色:①涂片、加热干燥及固定；②向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用木夹子夹住载玻片在微火上加热染液冒蒸气计时并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸；③待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；④用0.5%番红水溶液复染2min；⑤用缓流自来水冲洗至流出水无色为止；⑥将载玻片晾干后油镜镜检。
2.酵母菌观察:（1）美兰染液水浸片法：①在载玻片中央加一滴美蓝染色液，用接种环挑取少量酵母菌液，混合均匀；②用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，避免产生气泡；③将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞；④染色30min后再次观察，注意死活细胞比例是否发生变化。
（2）子囊孢子的观察：①取经产孢培养的酵母斜面培养物，在洁净载玻片上按常规涂片、干燥固定；②滴加孔雀绿染液染色 1min~1.5min，水洗；③用 95% 的乙醇脱色 30s，水洗；④用番红复染 30s~1min，水洗，干燥；⑤干后用油镜观察子囊孢子的形态。
五、【实验结果】1.细菌芽胞染色②枯草芽孢杆菌和梭形芽胞杆菌芽孢形态对比：（A）枯草芽孢杆菌芽孢（B）梭形芽胞杆菌芽孢2.酵母菌观察：（1）美兰浸片观察：①酵母菌出芽生殖图酵母菌出芽生殖的过程：菌体的一端冒出一个小芽，渐渐变大，最终脱离母体。
②染色3min和染色30min后酵母菌死活细菌对比：(A)染色3min (B)染色30min结果分析：2.染色3min后酵母菌存活比例为1/7；染色30min后酵母菌存活比例明显下降，仅为1/36。
由此可见，染色时间越长，酵母菌存活比例越低。
（2）酵母菌子囊孢子观察：1.经过染色后，显微镜下菌体有蓝色和无色两种，其中蓝色是死菌，无色为活菌。
结果分析：在酵母菌子囊孢子观察中，在视野中几乎观察不到绿色的芽孢，经过三次制片后，只能观察到几个子囊（如上图）。
实验四微生物形态、菌落的观察(精)
实验四：微生物形态、菌落的观察一、实验目的1．学习在油镜下观察微生物的个体形态2．了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步二、实验材料1．菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2．器材：显微镜，载玻片，染色缸等3．染色液：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液三、实验内容和方法1.涂片将培养14 —16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。
固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色（1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30分钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检干燥后，置油镜观察。
革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌于枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。
此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
四、注意事项1．革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。
因此必须严格把握脱色时间。
2．选用培养18—24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
五、作业要求1．不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？2．当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？。
芽孢杆菌筛选实验报告
一、实验目的1. 了解芽孢杆菌的基本特性。
2. 掌握从土壤中筛选芽孢杆菌的方法。
3. 学习微生物的纯化与鉴定技术。
二、实验原理芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，具有较强的抗逆性和生存能力。
在土壤中，芽孢杆菌广泛分布，具有丰富的种类。
本实验通过选择含有淀粉的培养基，利用芽孢杆菌产生淀粉酶的特性，从土壤中筛选出芽孢杆菌，并对筛选出的菌株进行纯化和鉴定。
三、实验材料1. 实验仪器：培养皿、移液枪、玻璃棒、天平、酒精灯、高压灭菌锅、恒温培养箱等。
2. 实验试剂：淀粉、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、碘液等。
3. 实验土壤：采集于校园周边土壤。
四、实验步骤1. 土壤样品的处理：将采集的土壤样品进行充分混匀，称取1g土壤置于无菌烧杯中，加入10ml无菌水，用玻璃棒搅拌后静置30分钟，取上清液备用。
2. 稀释涂布：将土壤样品上清液进行10倍梯度稀释，取适量稀释液分别涂布于含淀粉的培养基平板上。
3. 培养与观察：将涂布好的平板倒置，置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况。
4. 初步筛选：挑选生长良好的菌落进行纯化培养，采用平板划线法进行纯化。
5. 菌株鉴定：对纯化后的菌株进行形态观察、革兰氏染色、生化试验等鉴定。
6. 淀粉酶活性测定：采用淀粉酶活力测定试剂盒对筛选出的菌株进行淀粉酶活性测定。
五、实验结果与分析1. 土壤样品处理：经过充分混匀和搅拌，土壤样品上清液呈现浑浊状态，表明土壤中存在大量微生物。
2. 稀释涂布：涂布后的平板在培养箱中培养24小时后，观察到菌落生长良好，表明土壤中存在大量芽孢杆菌。
3. 初步筛选：通过平板划线法，成功纯化出多个菌落。
4. 菌株鉴定：经过形态观察、革兰氏染色、生化试验等鉴定，初步确定筛选出的菌株为芽孢杆菌。
5. 淀粉酶活性测定：对筛选出的菌株进行淀粉酶活性测定，结果显示其中一株菌株的淀粉酶活性较高。
六、实验结论1. 成功从土壤中筛选出芽孢杆菌。
2. 通过形态观察、革兰氏染色、生化试验等鉴定，初步确定筛选出的菌株为芽孢杆菌。
芽孢染色实验报告
1. 掌握芽孢染色的原理和方法。
2. 观察和区分芽孢与菌体的形态结构。
3. 理解芽孢在细菌生存过程中的重要性。
二、实验原理芽孢是细菌在恶劣环境下形成的一种特殊休眠体，具有厚而致密的壁，通透性低，对高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。
因此，在常规染色方法中，芽孢不易着色或仅显淡色。
芽孢染色法利用芽孢与菌体对染料的亲和力不同，采用特殊染色方法，使芽孢和菌体呈现不同的颜色，便于区分。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 染料：孔雀绿染液、番红染液、复染液（如石炭酸复红液和吕氏美蓝液）3. 仪器：显微镜、载波片、接种环、酒精灯、滴管等四、实验步骤1. 将枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂平板，培养24小时。
2. 将培养好的菌落挑取少许，制作成涂片。
3. 将涂片用火焰固定。
4. 将涂片滴加孔雀绿染液，染色5-10分钟。
5. 水洗涂片，去除多余的染料。
6. 将涂片滴加番红染液，复染1-2分钟。
7. 水洗涂片，去除多余的染料。
8. 将涂片滴加复染液，染色1-2分钟。
9. 水洗涂片，去除多余的染料。
10. 将涂片晾干，用显微镜观察。
在显微镜下观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色。
芽孢直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状。
六、实验分析1. 芽孢染色法是一种特殊的染色方法，可以有效地观察和区分芽孢与菌体的形态结构。
2. 芽孢是细菌在恶劣环境下形成的一种特殊休眠体，具有厚而致密的壁，对各种不利因素具有很强的抵抗力。
3. 芽孢在细菌的生存过程中具有重要意义，可以保护细菌度过恶劣环境。
七、实验讨论1. 在实验过程中，染色时间和染液浓度对实验结果有一定影响，需要根据实际情况进行调整。
2. 芽孢染色法可以应用于多种细菌的芽孢观察，如枯草芽孢杆菌、梭菌等。
3. 芽孢染色法是一种基础实验技术，对于微生物学学习和研究具有重要意义。
八、实验总结通过本次实验，我们掌握了芽孢染色的原理和方法，观察了芽孢与菌体的形态结构，了解了芽孢在细菌生存过程中的重要性。
食品微生物实验技术--实验四食品中常见霉菌形态特征观察4
菌落呈圆形、湿润具有粘性、不透明、表面光滑、有油脂状光 泽，多数白色或乳白色，少数红色。与培养基结合不紧，易被挑取。
当培养时间较长时，菌落颜色变暗，有特殊的酒香味。
观察放线菌菌落的外形、大小、表面形状、表面及背面颜色， 与培养基结合情况等(即不易被接种环挑取菌体)
三、操作方法
3.1 霉菌菌落特征的观察 观察并描述根霉与毛霉、青霉与曲霉的菌落形态，菌落大小，局限生长 或蔓延生长；菌落表面和反面颜色，基质的颜色变化；菌落的组织状态， 棉毛状、网状或毡状，疏松或紧密，有无同心环纹或放射状绉褶。 3.2 霉菌个体形态的观察 3.2.1 水浸片法 在于净载玻片上加棉兰一滴，用解剖针挑取少许菌体(或在培养皿盖上 挑取少许霉菌体)，放于载玻片上棉兰染色液中，并将菌丝体分开，勿让它 成团，加盖玻片，(注意不要产生气泡)。用滤纸吸去多余棉兰液，在低倍 镜或高倍镜下观察。 3.2.2毛霉和根霉的观察 用上述水浸片法，剪取毛霉及根霉玻璃纸，分别制片后在低倍和高倍 镜下观察，注意菌丝有无分隔，孢子囊梗有无分枝，有无假根和葡萄枝， 孢子囊及子囊孢子的形状等。 3.2.3 青霉与曲霉的观察 同用上述水浸片法，抽取青霉及曲霉插片，分别制片后在低倍镜和高 倍镜下观察菌丝有无分隔，分生孢子梗有无分枝；帚状枝的形状，小梗， 梗基的分枝和排列特点；顶囊的形状与小梗的列数；分生孢子的形状，大 小与颜色。观察顶囊时，可用酒精反复冲洗，去掉复盖的大量孢子，使顶 囊显示出来。
青霉
毛霉
黄曲霉
青霉
黑曲霉
黄曲霉
红霉
黑曲霉
黄曲霉
构巢曲霉
烟曲霉
杂色曲霉
绳状青霉
桔青霉
兰色梨 头毛霉
少根根霉
可从长出菌落的形状，大小、颜色、光泽、表面状况、边缘、隆起度、 透光性、质地以及是否分泌色素等方面的特征来描述。一般讲，有 鞭毛的菌落平，呈不规则的边缘，有荚膜的菌落看上去特别光滑， 呈透明的水珠状，有芽孢的菌落常因芽孢折光率变化而粗糙，不透 明，多皱折，表面似乎干燥等，同时细菌菌落易被接种环挑取。
微生物实验芽孢观察
微生物实验报告细菌的芽孢染色观察实验刘欣怡2生命科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验时间：2012年10月22号一、实验目的1、学习并掌握芽孢染色法2、了解芽孢杆菌的形态特征3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验器材1、菌种枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。
2、溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。
3、仪器和其他用品酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。
三、实验原理1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
2、芽孢菌体的特点：a.芽孢的含水率低，38%～40%。
b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。
中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。
内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。
芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。
c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。
吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。
在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。
芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。
d.含有耐热性酶。
芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。
细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。
3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
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微生物实验报告细菌的芽孢染色观察实验刘欣怡201100140057生命科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验时间：2012年10月22号一、实验目的1、学习并掌握芽孢染色法2、了解芽孢杆菌的形态特征3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验器材1、菌种枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。
2、溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。
3、仪器和其他用品酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。
三、实验原理1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
2、芽孢菌体的特点：a.芽孢的含水率低，38%～40%。
b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。
中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。
内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。
芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。
c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。
吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。
在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。
芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。
d.含有耐热性酶。
芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。
细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。
3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
4、芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节。
芽孢可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据、在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。
5、产生芽孢的几个属：芽孢杆菌属(Bacillus) 、梭状芽孢杆菌属(Clostridium) 、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)，四、实验内容根据实验提供的两种细菌，即枯草芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌，然选一种或者两者都选，进行制片，进而染色观察细菌芽孢的形态特征。
若选择两种菌，可以再制作在同一个载玻片上。
五、实验步骤1、涂片取一块洗净并自然晾干的载玻片，分别滴两小滴蒸馏水于载玻片靠近中央处；用接种环无菌操作，先将接种环在酒精灯上烧2遍，从酒精灯旁用稍冷却的接种环从枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面或梭状芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面挑取适量菌苔（接触一或两下），在载玻片上的两滴蒸馏水中分别涂抹（接触三到四下），使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜或观察到小水滴有些浑浊。
记录两者相对位置，不要弄混。
并且还要记清载玻片真反面，可以做标记。
2、干燥固定可以有酒精灯进行加热干燥，用夹子夹住载玻片在火焰上过1到2遍就放到手背上试一下玻片温度，一不烫手为原则，一直重复操作直至液滴完全干燥固定。
3、染色向干燥固定好的片子上加数滴孔雀绿染液，使菌完全被覆盖，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热（可以在酒精灯上过几下，稍停一下再在酒精灯上过几下根据染液冒蒸汽的实际情况自行判断做法）至染料稍冒蒸汽并开始计时，维持5min。
加热过程中及时补充染液。
切勿让涂片干涸。
4、冷却后水洗染色结束后，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
5、复染水洗好后，用番红水覆盖菌，染色2min 。
6、水洗干燥复染结束后，用缓流水洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。
然后自然风干。
7、镜检将制好的玻片放在显微镜下，先低倍镜，再高倍镜，最后滴加香柏油用油镜观察芽孢形态，并记录。
8、实验结束实验结束后，整理实验台，仪器归位，电器拔下电源，擦净染液。
六、实验结果及记录照片1、芽孢染色观察结果：显微镜视野中，芽孢呈现绿色，菌体呈现淡淡的红色或者无色透明（番红水复染不成功），亦或者视野中仅有几个番红水复染上了红色的菌。
枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或末端，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。
综合来看，视野中，能看到有的菌中间有较亮且染为绿色的部分，即为芽孢。
有的芽孢在菌的中间出现，即中生芽孢；有的芽孢在菌的末端出现，即端生芽孢；有的芽孢向外膨胀；有的芽孢不向外膨胀；有的芽孢游离在菌体之外，估计是操作中动作较大使得芽孢脱落下来。
2、芽孢染色观察记录图：该图为梭状芽孢杆菌的观察视野。
从图中可以看到第一次孔雀绿染色较好，但是水洗脱色以及复染色有点失败，大部分菌体没能染上红色，菌体大部分是绿色或无色。
该图中能看到几个染色较好的细菌，菌体为红色，内含绿色的芽孢，为中生芽孢。
该图为枯草芽孢杆菌的观察视野。
图中可以看到染色较好的绿色芽孢，但是菌体近乎都为无色的，说明水洗脱色较好但是复染色不成功。
对于菌体没能复染上红色，有两大可能原因：一是番红水浓度低，二是染色时间不够。
3、全班内搜寻好的实验玻片，进一步观察芽孢的形态特征本实验图片从其他组获得，观察视野中可以看到一些复染色较好、呈紫红色的菌体，当然还有一些菌体是绿色或者无色；芽孢染色较好，被染成了绿色，但是游离的芽孢很多，估计有较为严重的不当操作致使很多芽孢从菌体中脱落下来。
4、资料查找图：与自己的实验结果进行对比，更进一步了解芽孢形态特征。
中生芽孢端生芽孢游离芽孢七、实验结果分析1、本实验的观察结果：能较为清楚地观察到芽孢的存在，而且能观察到不同的芽孢着生方式。
观察到不少的芽孢游离在菌体之外，估计和自己的操作有较大关系，分析此现象发生的原因可能有如下三种：a.由于芽孢较厚，耐压力细胞体强，可能由于在图片时用力过大，将细胞体的细胞壁压碎从而使的芽孢脱落出来； b.可能是由于菌体培养时间过久，芽孢正处于复苏阶段，所以大多数芽孢都从菌体中游离出来；c.可能在干燥固定和染色两个步骤中，加热的温度太高使得芽孢从菌体中裂出。
芽孢染色较好，均为绿色或浅绿色，但是外面的菌体基本上没染上番红水的红色，但是外面的菌体水洗脱色不错，在观察视野中成无色透明状。
没能复染上番红水的红色的原因可能有：番红水是番红染液的稀释液，浓度小不易使菌体染上色；番红水复染的时间较短，不足老师要求的2min；水洗后直接进行复染，或略了载玻片上的残余水，没有先用番红水冲载玻片而是直接覆盖，使得染液浓度又降低。
2、绿色芽孢及红色菌体的观察现象分析：由于芽孢壁厚、透性低上不易着色，当用番红、结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圈。
但是用着色力强的染色剂孔雀绿，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经染色便难以被水洗脱。
当用对比度大的复染色剂番红染色后，芽孢仍保留初染剂孔雀绿的绿色，而菌体和芽孢囊被染成复染色剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
3、要保证本实验获得成功，必须要注意以下几点a.选用适当菌龄的菌种，幼龄的尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已破裂。
b.加热染色时必须维持在染液微冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，如热不够则难以着色。
c.脱色必须等玻片冷却后进行，否则骤然用冷水冲洗会导致玻片破裂。
八、实验注意事项1、加热时使用载玻片夹子或试管夹，以免烫伤。
2、使用染料时一定要注意避免沾到衣物上。
3、载玻片一定要洗净，自然晾干。
4、向载玻片上滴加两滴蒸馏水时一定要注意水滴要小。
5、载玻片未干燥固定前，注意水平放置玻片，以防载玻片上的两滴水滴混合以至于制片失败。
6、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。
7、制片的干燥固定操作中，注意加热程度及载玻片温度，以免加热温度太高使得菌和芽孢裂开。
8、孔雀绿染色计时是从加热覆盖了染液的载玻片、看到有蒸汽冒出开始的。
9、孔雀绿染液染色过程中，需加热，但是不要一直放在酒精灯火焰上加热，以防载玻片加热断裂，可以在火焰上多过几下后移开稍稍冷却。
10、孔雀绿染液染色加热过程要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
11、补充染液，需要先将载玻片从酒精灯火焰上移开，等待稍稍冷却后再向载玻片上滴加孔雀绿染液，以防冷的染液遇到热的载玻片使得载玻片断裂。
12、本次实验中，水洗均冲洗载玻片无菌面。
13、实验中，图片时要动作轻缓，以防因动作太大而使得芽孢从菌体上脱落下来。
14、孔雀绿染液染色过程中，要注意不能持久加热，会使得载玻片温度很高，温度很高容易使得芽孢和菌体裂开。
15、孔雀绿染液加热染色后，需要将载玻片冷却一小段时间后再水洗，以防热的载玻片突然遇到冷的水流发生断裂。
16、注意两次染色的时间。
17、番红水复染并水洗干净后，一定要自然晾干载玻片。
18、镜检时，先低倍镜，再高倍镜，最后滴加香柏油换为油镜。
19、实验后洗干净手再离开。
九、实验思考题1、用简单染色法能否观察到细菌的芽孢?说明原因。
答：不能。
细菌的芽孢具有厚而致密的壁。
透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
2、为什么芽孢染色需要进行加热？答：芽孢壁厚，透性低，不易着色。
加热条件下染色，染料可以进入菌体内，也可以进入芽孢。
3、用孔雀绿初染芽孢后，为什么必须等载玻片冷却后再用水冲洗？答：若玻片不冷却就直接冲洗，会因为突然遇冷而炸裂。
4、细菌芽孢用孔雀绿染色并加热时，为什么不能蒸干染液？答：加热染色都不能把染料蒸干,染料被蒸干后积聚在玻片以及菌体上,干扰光线穿透影响镜下观察菌体结构情况。
5、若在视野中多看到游离的芽孢，而很少看到芽孢囊和营养细胞，试分析原因。
答：a.由于芽孢较厚，耐压力细胞体强，可能由于在图片时用力过大，将细胞体的细胞壁压碎从而使的芽孢脱落出来。
b.可能是由于菌体培养时间过久，芽孢正处于复苏阶段，所以大多数芽孢都从菌体中游离出来。
c.可能在干燥固定和染色两个步骤中，加热的温度太高使得芽孢从菌体中裂出。