微生物实验4 芽孢观察

微生物实验报告

细菌的芽孢染色观察实验

刘欣怡201100140057

生命科学基地班

组别：周一下午三组

同组者：曹平平，周楠，

刘艺，刘希伟

实验时间：2012年10月22号

一、实验目的

1、学习并掌握芽孢染色法

2、了解芽孢杆菌的形态特征

3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术

二、实验器材

1、菌种

枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。

2、溶液和试剂

5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。

3、仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。

三、实验原理

1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的

休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

2、芽孢菌体的特点：

a.芽孢的含水率低，38%～40%。

b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。

c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。

d.含有耐热性酶。

芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。

3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

4、芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节。芽孢可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据、在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只

有少数菌种可形成芽孢。

5、产生芽孢的几个属：

芽孢杆菌属(Bacillus) 、梭状芽孢杆菌属(Clostridium) 、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)，

四、实验内容

根据实验提供的两种细菌，即枯草芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌，然选一种或者两者都选，进行制片，进而染色观察细菌芽孢的形态特征。若选择两种菌，可以再制作在同一个载玻片上。

五、实验步骤

1、涂片

取一块洗净并自然晾干的载玻片，分别滴两小滴蒸馏水于载玻片靠近中央处；用接种环无菌操作，先将接种环在酒精灯上烧2遍，从酒精灯旁用稍冷却的接种环从枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面或梭状芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面挑取适量菌苔（接触一或两下），在载玻片上的两滴蒸馏水中分别涂抹（接触三到四下），使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜或观察到小水滴有些浑浊。记录两者相对位置，不要弄混。并且还要记清载玻片真反面，可以做标记。

2、干燥固定

可以有酒精灯进行加热干燥，用夹子夹住载玻片在火焰上过1到2遍就放到手背上试一下玻片温度，一不烫手为原则，一直重复操作直至液滴完全干燥固定。

3、染色

向干燥固定好的片子上加数滴孔雀绿染液，使菌完全被覆盖，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热（可以在酒精灯上过几下，稍停一下再在酒精灯上过几下根据染液冒蒸汽的实际情况自行判断做法）至染料稍冒蒸汽并开始计时，维持5min。加热过程中及时补充染液。切勿让涂片干涸。

4、冷却后水洗

染色结束后，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。

5、复染

水洗好后，用番红水覆盖菌，染色2min 。

6、水洗干燥

复染结束后，用缓流水洗载玻片背面，直至流出的水无色为止。然后自然风干。

7、镜检

将制好的玻片放在显微镜下，先低倍镜，再高倍镜，最后滴加香柏油用油镜观察芽孢形态，并记录。

8、实验结束

实验结束后，整理实验台，仪器归位，电器拔下电源，擦净染液。

六、实验结果及记录照片

1、芽孢染色观察结果：

显微镜视野中，芽孢呈现绿色，菌体呈现淡淡的红色或者无色透明（番红水复染不成功），亦或者视野中仅有几个番红水复染上了红色的菌。

枯草芽孢杆菌芽孢呈椭圆到柱状，位于菌体中央或末端，菌体基本无大变化；梭状芽孢杆菌芽胞呈圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状。

综合来看，视野中，能看到有的菌中间有较亮且染为绿色的部分，即为芽孢。有的芽孢在菌的中间出现，即中生芽孢；有的芽孢在菌的末端出现，即端生芽孢；有的芽孢向外膨胀；有的芽孢不向外膨胀；有的芽孢游离在菌体之外，估计是操作中动作较大使得芽孢脱落下来。

2、芽孢染色观察记录图：

该图为梭状芽孢杆菌的观察视野。从图中可以看到第一次孔雀绿染色较好，但是水洗脱色以及复染色有点失败，大部分菌体没能染上红色，菌体大部分是绿色或无色。该图中能看到几个染色较好的细菌，菌体为红色，内含绿色的芽孢，为中生芽孢。

该图为枯草芽孢杆菌的观察视野。图中可以看到染色较好的绿色芽孢，但是菌体