核酸含量测定(精)
核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握核酸含量测定的原理和方法。
2. 熟悉紫外分光光度法和定磷法在核酸含量测定中的应用。
3. 通过实验操作，提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理核酸是一类重要的生物大分子，包括DNA和RNA。
核酸含量的测定对于生物学研究具有重要意义。
本实验采用紫外分光光度法和定磷法两种方法测定核酸含量。
1. 紫外分光光度法核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统，在紫外光照射下具有特定的吸收峰。
通过测定核酸溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出核酸含量。
2. 定磷法核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为5%，DNA中含磷量为9%。
通过测定核酸溶液中磷的含量，可以推算出核酸含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料核酸样品、标准核酸溶液、标准磷溶液、定磷试剂、浓硫酸、蒸馏水、移液管、容量瓶、试管、紫外分光光度计、电炉、水浴锅等。
2. 实验仪器紫外分光光度计、电子天平、移液器、试管架、试管、烧杯、滴定管、酒精灯、玻璃棒等。
四、实验步骤1. 紫外分光光度法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：准确称取一定量的核酸样品，用蒸馏水溶解并定容至一定体积。
（2）测定吸光度：取一定量的核酸溶液，在特定波长下测定吸光度。
（3）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量（1）配制核酸溶液：同紫外分光光度法。
（2）消化：将核酸溶液加入浓硫酸，在电炉上加热至有机物分解，冷却后定容。
（3）测定磷含量：取一定量的消化液，加入定磷试剂，在特定波长下测定吸光度。
（4）计算核酸含量：根据吸光度值和标准曲线，计算核酸含量。
五、实验结果与分析1. 紫外分光光度法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
2. 定磷法测定核酸含量根据实验数据，绘制标准曲线，计算样品中核酸含量。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意避免核酸样品的污染，保证实验结果的准确性。
2. 紫外分光光度法和定磷法各有优缺点，在实际应用中可根据具体情况选择合适的方法。
实验十三动物组织核酸的分离鉴定和含量测定(精)
实验目的：
学习并掌握紫外分光光度法和定糖二苯胺显色法பைடு நூலகம்
测定DNA含量和纯度的基本原理
DNA测定的方法原理
紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs 相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可 进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为 1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。） 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖， 分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）
二苯胺显色法原理
DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷 酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基 -γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光 吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛， 可以提高反应灵敏度。
实验内容
DNA：1ml SC溶液溶解上次提取的DNA样品，然后转移到 50ml离心管中，用9ml0.01M NaOH溶液溶解。 A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释 倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为 100ug/ml。（由于二苯胺法的测定范围是40400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） 核酸含量（ug/ml）=样品A260X稀释倍数/0.02 (0.022) A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为 2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中 混有蛋白质，则比值小于1.8。
测定核酸含量实验报告
一、实验目的1. 掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法。
2. 学习核酸提取、纯化及定量测定的基本操作。
3. 了解实验数据的处理与分析方法。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，由核苷酸单元组成。
本实验采用定磷法测定核酸含量，其原理如下：1. 核酸分子中含有一定比例的磷，RNA中含磷量为10%，DNA中含磷量为8%。
2. 用强酸将核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
3. 在还原剂存在的情况下，Mo6+被还原成Mo4+，与试剂中的其他MoO42-结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8，形成蓝色化合物，称为钼蓝。
4. 在一定浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，可通过比色法测定核酸含量。
三、实验器材与试剂1. 实验器材：- 粗核酸- 克氏烧瓶（50ml）- 小漏斗（4cm）- 容量瓶（100ml、50ml）- 吸管- 试管（X18cm）- 722型或XX型分光光度计- 电炉- 水浴锅2. 实验试剂：- 标准磷溶液：将磷酸二氢钾于100℃烘至恒重，准确称取溶于少量蒸馏水中，转移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol/L硫酸溶液及氯仿数滴，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升含磷400μg。
临用时准确稀释20倍。
- 定磷试剂：17%硫酸：17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中。
2%钼酸铵溶液。
四、实验步骤1. 核酸提取：取一定量的粗核酸，加入适量的水，用玻璃棒搅拌，使核酸充分溶解。
然后加入一定量的强酸，使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷。
2. 核酸纯化：将消化后的核酸溶液通过离心、沉淀等方法进行纯化。
3. 核酸定量测定：a. 准备标准曲线：取一定量的标准磷溶液，分别加入定磷试剂，制备标准曲线。
b. 样品测定：取一定量的纯化后的核酸溶液，加入定磷试剂，制备样品溶液。
在分光光度计上测定样品溶液的吸光度，通过标准曲线计算出样品中核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：根据标准磷溶液的浓度和吸光度，绘制标准曲线。
核酸含量的测定——紫外吸收法
核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。
常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。
核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。
RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。
小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。
测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。
当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。
蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。
若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。
不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。
从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。
纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。
当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。
RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。
pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。
本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。
[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。
3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。
实验八核酸的定量测定——定磷法(精)
钼兰（Mo4+）兰色
钼兰在一定浓度范围内(无机磷含量在1—25μg范围内)。兰色的深浅和磷酸的含 量成正比（660nm），可用比色法测定其光吸收值。 1、标准曲线的制作 2、总磷的测定 3、无机磷的测定
▪用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
▪无机磷再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。
PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O↓(黄色)+6H2O
实验八 核酸的定量测定 ——定磷法
Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧 啶由于其共轭双键系统，都具有吸收紫外线的性质，最大吸 收峰在260nm波长处。
一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般为9.5%左右(RNA含 磷量约9.0%，DNA含磷量约为9.2%)，若测得某一核酸样品中有 机磷的含量，即可推算其核酸的含量。
核酸的消化：用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷
强酸消化
钼酸铵
核酸中的有机无机磷酸
无机磷酸
磷钼酸铵（Mo6+）
还原剂（抗坏血酸等）
3. 苔黑酚（地衣酚）法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为
糠醛，后者与地衣酚（3,5-二羟甲苯）作用生成 绿色化合物，在670nm处有最大吸收，RNA浓 度在10~100微克/毫升范围内，光密度与RNA的 浓度成正比关系。
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。
17
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿
中。 将实验台面擦干净。
18
1
2
34
5
6
标准磷溶液/mL
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
dH2O/mL 定磷试剂/mL
1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值
A660(1)
A660(2)
回收率 0.15 100%
1000
(2) 计算样品总磷量：
x 50
RNA总磷量(g
/ mL)
1.5 回收率
(3) 计算RNA量：
RNA质量浓度（g / mL) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9%） 10.5
总磷量 10.5
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度(g / mL) 100% 2000(g / mL)
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水
实验四、定磷法测定核酸含量(精)
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
9
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
吸取核酸样品液1ml于凯氏烧瓶中，另吸取蒸馏水 1ml做空白试验。各加入2 ml 5M硫酸。置于140160℃烘箱内消化2-4h，待溶液呈黄褐色后，取出 冷却，加入1-2滴30%过氧化氢，继续消化，到溶液 透明为止。取出冷却后加入1ml 蒸馏水，于沸水浴 中加热10min，以分解消化过程中形成的焦磷酸。 然后将消化液用蒸馏水转移至100ml容量瓶中定容 到刻度。
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消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL
1 0 0 1
2 1 0 0
3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
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2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定——定磷法
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
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操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
核酸含量的测定方法
核酸含量的测定方法
1. 哇塞，核酸含量的测定方法之一就是分光光度法呀！就像我们看东西，能清楚地知道它的多少一样。
比如说，通过特定的仪器去检测核酸溶液对光的吸收程度，这不就能知道核酸的含量大概有多少啦，是不是很神奇？
2. 嘿，还有一种叫荧光定量 PCR 的方法呢！它就好像一个超级侦探，
能精确地找出核酸的量。
就好比我们找东西，它能一下子就锁定目标，告诉我们这里有多少核酸存在，厉害吧！
3. 你知道吗，凝胶电泳法也是测定核酸含量的一种办法哦！这就像一场比赛，不同大小的核酸在凝胶上赛跑，我们就能看出它们的多少和情况了。
你想想看，是不是挺有意思的？
4. 哇哦，同位素标记法也可以呀！这就如同给核酸贴上了特别的标签，我们能通过追踪这些标签来搞清楚核酸的含量是多少。
就像给人做了记号一样，一下子就能认出它们来啦。
5. 嘿呀，还有一种叫杂交法的呢！它就好像是拼图游戏，通过特定的核酸片段去寻找对应的部分，从而确定核酸的含量。
这得多巧妙呀！
6. 哎呀，化学分析法也能做到测定核酸含量呢！就像是一个精细的化学家，仔细地分析和计算，得出核酸的量。
这可真是让人大开眼界呀！
我觉得这些核酸含量的测定方法都好神奇，各有各的特点和用处，它们为我们了解和研究核酸提供了重要的手段呢！。
测核酸含量实验报告
1. 理解核酸含量测定的原理和方法。
2. 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的操作步骤。
3. 通过实验验证紫外分光光度法测定核酸含量的准确性。
二、实验原理核酸是生物体内重要的生物大分子，其含量直接影响细胞的生理功能。
核酸含量的测定对于研究基因表达、遗传变异等领域具有重要意义。
紫外分光光度法是测定核酸含量的常用方法，基于核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系，能够在紫外光区产生特征吸收峰。
实验原理如下：1. 核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基在紫外光区具有特征吸收峰，其最大吸收峰分别位于260nm和280nm。
2. 通过测定样品在260nm和280nm处的吸光度值，可以计算出核酸的浓度。
3. 根据核酸的纯度校正系数，对测定结果进行校正，得到准确的核酸含量。
三、实验器材1. 紫外分光光度计2. 核酸标准品3. 核酸样品4. 容量瓶（10ml、25ml、50ml）5. 移液器6. 烧杯7. 离心机8. 移液管9. 超纯水10. 标准试剂1. 标准曲线绘制（1）准确称取核酸标准品，用超纯水溶解，配制成不同浓度的标准溶液。
（2）分别将标准溶液在260nm和280nm波长下测定吸光度值。
（3）以浓度为横坐标，以260nm和280nm波长下的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品处理（1）准确称取核酸样品，用超纯水溶解。
（2）将样品在离心机中以3000r/min离心10分钟，取上清液。
（3）将上清液转移至容量瓶中，用超纯水定容至一定体积。
3. 样品测定（1）将标准溶液和样品溶液在260nm和280nm波长下测定吸光度值。
（2）根据标准曲线，计算样品在260nm和280nm波长下的核酸浓度。
（3）根据核酸纯度校正系数，对测定结果进行校正，得到准确的核酸含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制通过绘制标准曲线，可以看出在260nm和280nm波长下，核酸浓度与吸光度值呈线性关系。
2. 样品测定根据实验结果，样品在260nm和280nm波长下的核酸浓度分别为1.2mg/ml和0.8mg/ml。
核酸含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解核酸含量测定的原理和方法。
2. 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的基本操作步骤。
3. 学会使用紫外分光光度计进行定量分析。
二、实验原理核酸是生物细胞中最重要的生物大分子之一，由核苷酸单体聚合而成。
核酸含量是衡量细胞活性、基因表达水平等重要生物学指标的重要参数。
紫外分光光度法是一种常用的核酸含量测定方法，其原理基于核酸分子中碱基的共轭双键系统对紫外光的吸收特性。
在紫外光照射下，核酸分子中的碱基会吸收特定波长的紫外光，产生荧光。
通过测定荧光强度，可以计算出核酸的浓度。
紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于生物学、医学、分子生物学等领域。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 核酸样品2. 标准核酸溶液3. 0.1mol/L NaOH溶液4. 0.1mol/L HCl溶液5. 1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）6. 6mol/L Guanidine HCl溶液实验仪器：1. 紫外分光光度计2. 移液器3. 试管4. 烧杯5. 移液管6. 洗瓶四、实验步骤1. 样品制备：- 取一定量的核酸样品，用0.1mol/L NaOH溶液溶解，制备成一定浓度的核酸溶液。
- 将核酸溶液稀释至适当浓度，以便在紫外分光光度计的检测范围内。
2. 标准曲线制作：- 取标准核酸溶液，分别稀释成不同浓度，制备成标准系列。
- 在紫外分光光度计上，以6mol/L Guanidine HCl溶液为空白对照，测定标准系列在特定波长下的吸光度值。
- 以吸光度值为纵坐标，核酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3. 样品测定：- 按照样品制备步骤，制备待测核酸溶液。
- 在紫外分光光度计上，以6mol/L Guanidine HCl溶液为空白对照，测定待测核酸溶液在特定波长下的吸光度值。
- 根据标准曲线，计算待测核酸溶液的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线：- 标准曲线呈现良好的线性关系，相关系数R²大于0.99。
核酸含量测定——定磷法
12
思考题
1. 回收率的意义； 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 实验所用的水质、试剂质量、 酸度对测定结果的影响。 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上， 将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净， 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。 将实验台面擦干净。
10
(1) 计算回收率： 计算回收率：
y × 50 回收率 = 0.15 ×100% 1000
x × 50 RNA总磷量 g / mL) = 1.5 ( 回收率
(2) 计算样品总磷量： 计算样品总磷量：
(3) 计算 计算RNA量： 量
RNA质量浓度（ g / mL) = 总磷量 无机磷量 DNA含量× 9.9% ×10.5 质量浓度（ （ ） ≈ 总磷量×10.5
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量， 含量，反应灵敏。 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰 处有吸收高峰， 受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 地衣酚法：用于测定RNA的含量 RNA与浓盐酸共热 的含量， 与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为 中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω 酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应， -γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。 糖外其他糖类无此反应。
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定 - 定磷法
核酸含量测定是指通过一种叫做定磷法的方法来确定样品中
核酸的含量。
定磷法是一种常用的生化分析方法，通过测定
样品中含有的无机磷的量，来间接推测核酸的含量。
具体操作步骤如下：
1. 取少量待测样品。
2. 将样品加入到酸性溶液中，使细胞壁和膜完全破裂。
3. 加入含有机溶液的磷试剂，使形成可溶性的金黄色磷酸铵
铬(VI)盐。
4. 根据反应生成的黄色物质的吸收特性，在特定波长下用分
光光度计测量吸光度。
5. 根据构建的标准曲线，确定吸光度与磷含量之间的关系，
从而推测样品中核酸的含量。
需要注意的是，定磷法只能测定样品中的总核酸含量，无法
区分DNA和RNA的含量。
如果需要分别测定DNA和RNA，需要采用其他特异性方法，比如荧光比色法或者核磁共振法等。
核酸含量测定方法
核酸含量测定方法核酸含量测定方法1. 摄取样品•取得待测样品，如DNA或RNA。
•确保样品质量高，避免污染。
2. 分离核酸•使用离心机将核酸与其他细胞部分进行分离。
•根据样品特点选择合适的分离方法，如酚/氯仿法、硅胶柱层析法等。
3. 确定核酸含量光谱法•通过测量核酸在紫外光谱下的吸收来确定其含量。
•使用纳米比色皿或光谱仪进行测量。
•根据核酸的碱基组成和光谱特性选择合适的波长进行测量。
比色法•利用核酸与特定试剂反应产生有色产物进行定量测定。
•常用方法包括二苯基胺（DBA）法、二倍卯胺（PicoGreen）法等。
•利用钻石黑与核酸形成复合物，通过测量复合物的吸光度来测定核酸含量。
•该方法操作简便、灵敏度高。
四硫代氨基嗪（SSB）法•利用核酸与SSB形成特定的复合物，通过测量复合物的吸光度来测定核酸含量。
•该方法适用于DNA和RNA的测定。
4. 数据处理与分析•根据测定结果进行数据整理与统计；•利用计算机软件如Excel、GraphPad Prism进行数据处理与绘图；•进一步分析数据以得到准确的结果。
5. 结论•根据测定结果，得出核酸样品的含量；•确定核酸含量对于分子生物学研究和实验操作至关重要。
以上是一些常见的核酸含量测定方法，根据实验需求和样品特点，选择合适的方法进行测定是确保结果准确可靠的关键。
不同方法有不同的优缺点，研究人员可以根据实际情况进行选择和优化，以获得最佳的测定结果。
•核酸含量测定方法在许多领域都有广泛的应用，包括分子生物学、遗传学、药物研发等。
•在分子生物学中，核酸含量测定是基础的实验技术，用于确定核酸样品的浓度和纯度，为后续实验提供准确的参考。
•在遗传学中，核酸含量测定可用于估算基因拷贝数、基因组大小以及测定突变体的细胞内核酸含量等。
•在药物研发中，测定药物与核酸的相互作用也是核酸含量测定的一个重要应用领域。
7. 未来发展趋势•随着生物技术和分子生物学的不断发展，核酸含量测定方法也在不断改进和发展。
测定核酸含量的方法(12页)
注意事项
◆ 1)清洗试验用容器不要用含磷清洗剂 2)消化过程注意预防爆沸和溅出内容物
定糖法
核酸中戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化 合物可与一些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测 定其溶液中吸收值，在一定浓度范围内，溶液吸收值与核酸含量成正 比。 ◆ 1、核糖测定
紫外吸收法
组成核酸分子碱基，均含有一定吸收紫外线特征，最大吸收值在波长 为250~270nm之间。核酸最大吸收波长是260nm, 这个物理特征 为测定核酸溶液浓度提供了基础。 ◆ 在波长260nm紫外线下，10D值光密度相当于双链DNA浓度为50μ g/ml; 单链DNA或RNA为20μg/ml。 能够次来计算核酸样品浓度。 ◆ 优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml 核酸溶液
测定核酸含合成生物大分子化合物，为生命最基础物质之一。 ◆ 核酸广泛存在于全部动植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白
质结合形成核蛋白。 不一样核酸，其化学组成、核苷酸排列次序等不一样。依据化学组成 不一样，核酸可分为核糖核酸(简称RNA) 和脱氧核糖核酸(简称
DNA)。
生成绿色化合物在λ=670nm处有最大吸收值。 2、 脱氧核糖测定
DNA中脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成w- 羟基-y-酮戊酸 ,该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收
值。
优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖都有此反应。
注意事项
其她糖及糖衍生物、芳香醛、蛋白质等都对试验有干扰，测定前应尽可 能可能除去。
小节
◆ 依据不一样情况以及试验条件选择适宜检测方法。 ◆ 不管何种方法，均需确保待测样品核酸 (DNA或RNA) 纯度。 ◆ 依据需要设定一定平行以及对照。
核酸含量测定实验报告
核酸含量测定实验报告引言核酸是构成生物体的重要有机物之一，其含量的准确测定对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
本实验旨在通过经典的比色法测定鱼鳃中核酸的含量，以探究该方法的准确性和可行性。
实验原理核酸的含量测定常用比色法，即通过紫外吸收计测量核酸在特定波长下的吸光度，并通过标准曲线确定核酸的浓度。
实验步骤1. 取适量鱼鳃组织样品，将其置于细胞破碎液中。
2. 用离心机以10000rpm的速度离心5分钟，将上清液转移到离心管中。
3. 取适量上清液，加入显色剂，摇匀后放置室温静置15分钟。
4. 使用紫外吸收计将吸光度读数调至280nm，记录吸光度数值。
5. 以鱼鳃组织样品的核酸浓度为横坐标，吸光度数值为纵坐标绘制标准曲线。
6. 根据标准曲线确定未知样品的核酸浓度。
实验结果测量了10个不同浓度的标准核酸溶液，得到对应的吸光度数值如下表：核酸浓度（μg/mL）吸光度数值2 0.0495 0.13110 0.25920 0.51230 0.74540 0.97850 1.20260 1.42070 1.64580 1.864绘制标准曲线如下：. A colorimetric assay for measuring8-oxo-2'-deoxyguanosine levels in DNA. Nucleic Acids Research, 30(2), e47.2. Zhong, W. et al. (2016). A colorimetric assay for sensitive and selective detection of dipeptidyl peptidase IV activity based on DNA hydrolysis. Analytical Biochemistry, 493, 35-40.。
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用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟 用去离子水作为空白，660nm测定吸光值 A660(1) A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
8
3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）
7（空白） 定容溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL A660(1) 1.5 0 1.5 8（样品） 1.5 0 1.5 9（标准） 0.15 1.35 1.5
3
还原产物钼蓝在波长660nm测定 吸光值，当无机磷含量在1—25μg 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1μg RNA磷相当于10.5 μg RNA。DNA 的含磷量平均为9.9%。
4
试剂
酵母RNA样品溶液：2000μg/mL
标准磷原液：含磷量为1000 μg/mL 标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取 15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果 变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
核酸含量测定
定磷法
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸 含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简 便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热， 降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异 性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω -羟 -γ -酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯 糖外其他糖类无此反应。
2
1 50 混匀
2
1 50
2
1 50
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
7
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）
每人取18支试管，按照下表平行操作：
1 标准磷溶液/mL dH2O/mL 定磷试剂/mL 0 1.5 1.5 2 0.1 1.4 1.5 3 0.2 1.3 1.5 4 0.3 1.2 1.5 5 0.4 1.1 1.5 6 0.5 1.0 1.5
2
定磷法的原理
首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定 磷试剂测定无机磷量。反应式为：
(NH4)MoO4+H2SO4 H3PO4+12H2MoO4 Vit • C H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 • MoO3（钼蓝） H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟
A660(2) A660平均值 A660平均值—空白 0
9
数据处理
关于空白： 1—6号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作 为空白。 7—9号管用于样品及回收率的测定，7号管 作为空白。
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画 标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量 (μg)。
实验步骤
1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转 化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线；
3. 测定回收率和样品总磷量。
6
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
消化管 RNA/mL 标准磷原液/mL dH2O/mL 1 0 0 1 2 1 0 0 3 0 1 0
5mol/L H2SO4/mL
dH2O/mL 用dH2O定容/mL
10
(1) 计算回收率：
y 50 回收率 0.15 100% 1000
x 50 RNA总磷量( g / mL ) 1.5 回收率
(2) 计算样品总磷量：
(3) 计算RNA量：
RNA质量浓度（g / mL ) （总磷量 无机磷量 DNA含量 9.9% ） 10.5 总磷量 10.5
12
思考题
1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的 酸度对测定结果的影响。
13
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台 面上。 将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。 将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿 中。 将实验台面擦干净。
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(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度( g / mL ) 100% 2000( g / mL )
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操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水 纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向 下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计 零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定， 不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。