GCMS法分析茶叶中提取物TGP的单糖组成及机理探讨

第42卷　第2期2003年3月

厦门大学学报(自然科学版)

Journal of Xiamen University (Natural Science )

Vol.42　No.2Mar.2003

文章编号:043820479(2003)022*******

GC 2MS 法分析茶叶中提取物T GP 的

单糖组成及机理探讨

收稿日期:2002203221

基金项目:国家自然科学基金(29735160),教育部访问

学者研究,厦门大学现代分析科学教育部重点实验室开放项目资助

作者简介:周鹏(1975-),男,博士研究生.

Corresponding author :周鹏(1975-),男,博士研究生.

周　鹏1,2,沈金灿2,谢明勇1,庄峙厦2,王小如23

(1.南昌大学生命科学与食品工程学院食品科学系,江西南昌330047;2.厦门大学现代分析科学教育部重点实验室,福建厦门361005)

摘要:用水提取茶叶并采用凝胶纯化,从茶叶中分离得到一种多糖蛋白复合物TGP.TGP 被硫酸完全水解,单糖产

物用盐酸2羟胺和乙酸酐进行衍生化处理,GC 2MS 进行分析.研究结果表明,TGP 的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖.同时探讨了单糖的糖腈乙酰酯衍生化及衍生产物在质谱中的电离机理.

关键词:TGP ;单糖组成;GC 2MS ;离子化机理

中图分类号:O 656

文献标识码:A 茶对人体的药效和保健功能早为古今医学家所肯定.20世纪90年代初,清水岑夫认为茶叶中治疗糖尿病的药理成分为茶叶多糖[1],此后有关茶叶多糖的研究报道逐年增多.茶叶多糖具有多种多样的生物活性如抗血栓、防癌、降血糖、降血脂等[2].我们从江西资源茶叶中提取出一种茶叶多糖,活性实验表明其具有显著的抗肿瘤和降血糖活性,由于其活性与结构有密切的相关性,因此,有必要对其进行结构分析.作为进行结构研究的基础工作,首先必须确定TGP 的单糖组成成分.实验通过使用3mol/L 的硫酸将TGP 进行完全水解得到各单糖,由于单糖沸点高,不易挥发,因此采用盐酸2羟胺、乙酸酐法对单糖进行衍生化处理,制备的单糖衍生产物具有挥发性,从而能够使用GC 2MS 进行分析.同时,研究对单糖的衍生化以及衍生物在质谱中的电离机理进行了探讨.

1　材料与方法

1.1　主要材料与仪器

茶叶(江西分宜),Sephadex G 100,G 150(Phar 2macia 公司),盐酸羟胺,吡啶,乙酸酐(分析纯,上海化学试剂公司),硫酸(优级纯,上海振兴化工一厂),碳酸钡(分析纯,上海化学试剂采购供应站),单糖标准(生化试剂,上海试剂公司),所用水均为经过Milli 2Q 50的超纯水.

Varian 3400气相色谱仪,Finnigan 离子阱质

谱,THZ 282恒温振荡器.

1.2　方　法

1)TGP 的提取纯化　TGP 的提取及纯化方法

按文献[3]进行.

茶叶磨细→温水提取两次→滤液浓缩→脱除游离蛋白质→透析→乙醇沉淀→沉淀复溶于水→透析→Sephadex G 100和G 150分离→自动收集→浓缩→干燥→TGP.

2)完全酸水解　称取30mg TGP ,加入5mL 3mol/L 的硫酸,封管,超声片刻至TGP 完全溶解,在100℃恒温水浴振荡2h ,然后置于烘箱中于110℃

反应6h.反应完成后冷却至室温,加BaCO 3粉末中和,过滤,真空干燥,得到水解后的单糖混合物.

3)糖腈乙酸酯衍生物的制备　取10mg 单糖标样,10mg 盐酸羟胺,用0.4mL 吡啶溶解,95℃恒温水浴振荡40min ,冷却至室温后,加入0.6mL 乙酸酐,95℃恒温水浴振荡40min ,冷却至室温,得糖腈乙酸酯衍生物,反应产物可直接进样.单糖混合标准和样品单糖处理相同.

表1　GC2MS操作参数

Tab.1　Operating parameters of GC2MS

GC条件MS条件

进样器温度250℃电离模式电子轰击石英毛细管柱30m×0.32mm×0.25μm电子能量70eV 固定液SE254电压1850V 程序升温条件50～140℃(30℃/min)扫瞄模式全扫描

140～190℃(5℃/min)扫描速度1scans/s 进样量0.2μL

4)GC2MS条件　GC分离的关键参数是柱温条件.实验对4种不同的柱温条件进行了研究,分别是恒温200℃、程序升温160～220℃,10℃/min、160～190℃,5℃/min、140～190℃,5℃/min.以分离效果为依据,最终确定的柱温条件和其它条件列与表1.

2　结果与讨论

测定单糖的一般方法包括HPLC和GC法.应用HPLC进行单糖的分析,由于其不具备紫外或荧光吸收,必须将多糖衍生为具有紫外或荧光吸收的物质,如Shen等[5]用12苯基232甲基252吡唑(12 phenyl232methyl252pyrazolone,PMP)对糖链进行衍生,同样得到具紫外强吸收的物质;Kuster B等[6]在研究中,采用22氨基苯酰胺(22aminobenzamide,22 AB),将糖链转化成具荧光吸收的物质,对其进行标记(Labelling).与GC相比而言,HPLC分离分析的缺陷在于分离能力有限,尤其是在同分异构体的分离方面,单糖大部分均是同分异构体,如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等.而GC法由于所用的分离柱长,塔板数高,分离能力强,能有效的将同分异构体分开,并且常规配备的FID就能进行糖的检测.本实验采用MS和GC在线连接,以MS为检测器,同时可以得到保留时间和质谱信号,从而实现双重定性,结果更可靠.

单糖进行GC分析时,需要进行挥发性衍生,通常采用的衍生方法有:三甲基硅醚衍生、糖腈乙酸酯衍生、糖醇乙酸酯衍生、糖的三氟乙酸酯衍生等[7],这些衍生方法的衍生试剂均是易获得的常用试剂,方便易行.实验使用的衍生方法是糖腈乙酸酯衍生法.2.1　混合标准单糖的分析

实验首先对单个单糖的糖腈乙酸酯衍生物依次进样GC2MS分析,出峰顺序依次为:鼠李糖(Rha)衍生物,阿拉伯糖(Ara)衍生物,木糖(Xyl)衍生物,甘露糖(Man)衍生物,葡萄糖(G lu)衍生物,半乳糖(G al)衍生物.

为了进一步确定各个单糖衍生物,随后对混合标准单糖衍生物进行分析,结果如图1所示

.

t/s

　图1　标准混合单糖总离子流图

　Fig.1　Total ion chromatogram of complex standard

monosacchadides

图1表明,在选定的实验条件下,6种单糖得到了很好的分离.各组分对应的保留时间和质谱信号如表2所列.

表2　各单糖衍生物的保留时间及质谱信号

Tab.2　Retention time and MS signal of each monosaccharide derivative

混标Rha Ara Xyl Man G lu G al

出峰时间(min) 6.14 6.32 6.4910.0710.2610.48质谱信号(m/z)270256256328328328

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