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第二十二章 免疫学检测技术
p193
1
第一节 体外抗原抗体结合反 应的特点及影响因素
2
一. 体外抗原抗体反应的特征
高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合 点结构互补。
表面化学基团之间的可逆性结合 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体反应的两个阶段
3
高度专一性的结合
4
可逆性结合
Equivalence – Lattice formation
免疫酶技术
免疫荧光技术
放射免疫测定法
发光免疫分析
免疫胶体金技术
17
1)免疫酶测定法 （Enzyme Immunoassay, EIA）
利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原 或抗体的方法
特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性， 以及酶催化底物反应的生物放大作用, 最后用酶标仪测定光密度值（OD），评 定抗原-抗体的含量。
45
（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析
➢ 免疫吸附分离法 ➢ 免疫磁珠法 ➢ 荧光激活细胞分离仪分离法
（ (Fluorescence Activated Cell Sorting)， FACS ） ➢ 抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL
46
2. 免 疫 磁 珠 细 胞 分 离
47
48
免疫磁珠法细胞分选过程
25
26
27
28
3 )放射免疫测定法（RIA）
用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体 的方法
敏感度可达pg水平， 其标记物为125I、131I等。 常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。
29
4 )发光免疫分析
immunoassay LIA)
(luminescence
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
22
间接法ELISA
乙肝标志物中 抗HBs的检测 常采用本法
23
2 )免疫荧光技术
(Immunofluorescence Technique) 用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原 或抗体的方法
24
常用荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC）， 显黄绿色。 藻红蛋白（PE），显红色。
用途：细胞表面CD分子 抗核抗体
36
原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质
载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质 的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与 其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质 及其表达数量。
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
➢ 外周血单个核细胞分离 ➢ 淋巴细胞的分离 ➢ T细胞和B细胞的分离 ➢ T细胞亚群的分离
又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。
11
琼脂凝胶
12
1．单向免疫扩散 用于定量测抗原。
如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。
13
2．双向免疫扩散
主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析
14
3．免疫电泳
其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可 用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断
32
6 )免疫印迹法（Western blotting）
该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测 技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体， 再用酶免疫、放射免疫技术测定。
常用于检测多种蛋白质
33
免 疫 印 迹 法 示 意 图
34
35
4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列
是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱 分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白 质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶ห้องสมุดไป่ตู้ 等。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
31
5 )免疫胶体金技术
用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗 体的方法
40
(一)外周血单个核细胞分离
➢ 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
单核细胞（monocyte）。 ➢ Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
15
（三）免疫标记技术
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
16
常用的标记物
酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质 及胶体金
优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以 对微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术主要类型：
18
常用酶及其底物
➢ 辣根过氧化物酶（HRP） ➢ 碱性磷酸酶（AP）
➢
19
分类
20
双抗体夹心法
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等
21
特点：
❖ 非竞争结合反应 ❖ 常用于抗原的检测 ❖ 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇
的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测 ❖ 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
5
抗原抗体比例对反应现象 的影响
6
抗原抗体反应的影响因素
电解质：可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。
温度：最适温度为37℃。 酸碱度：最适pH =6-8。
7
第二节 检测抗原或抗体的 体外试验
8
（一）凝集反应 颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体
结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
43
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
44
密度梯度离心(Ficoll)离心
1．直接凝集试验 玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，
细菌的鉴定、分型等。 试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。
2．间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。
9
10
（二）沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与
相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故
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第一节 体外抗原抗体结合反 应的特点及影响因素
2
一. 体外抗原抗体反应的特征
高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合 点结构互补。
表面化学基团之间的可逆性结合 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体反应的两个阶段
3
高度专一性的结合
4
可逆性结合
Equivalence – Lattice formation
免疫酶技术
免疫荧光技术
放射免疫测定法
发光免疫分析
免疫胶体金技术
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1)免疫酶测定法 （Enzyme Immunoassay, EIA）
利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原 或抗体的方法
特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性， 以及酶催化底物反应的生物放大作用, 最后用酶标仪测定光密度值（OD），评 定抗原-抗体的含量。
45
（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析
➢ 免疫吸附分离法 ➢ 免疫磁珠法 ➢ 荧光激活细胞分离仪分离法
（ (Fluorescence Activated Cell Sorting)， FACS ） ➢ 抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL
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2. 免 疫 磁 珠 细 胞 分 离
47
48
免疫磁珠法细胞分选过程
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27
28
3 )放射免疫测定法（RIA）
用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体 的方法
敏感度可达pg水平， 其标记物为125I、131I等。 常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。
29
4 )发光免疫分析
immunoassay LIA)
(luminescence
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
22
间接法ELISA
乙肝标志物中 抗HBs的检测 常采用本法
23
2 )免疫荧光技术
(Immunofluorescence Technique) 用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原 或抗体的方法
24
常用荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC）， 显黄绿色。 藻红蛋白（PE），显红色。
用途：细胞表面CD分子 抗核抗体
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原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质
载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质 的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与 其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质 及其表达数量。
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
➢ 外周血单个核细胞分离 ➢ 淋巴细胞的分离 ➢ T细胞和B细胞的分离 ➢ T细胞亚群的分离
又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。
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琼脂凝胶
12
1．单向免疫扩散 用于定量测抗原。
如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。
13
2．双向免疫扩散
主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析
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3．免疫电泳
其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可 用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断
32
6 )免疫印迹法（Western blotting）
该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测 技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体， 再用酶免疫、放射免疫技术测定。
常用于检测多种蛋白质
33
免 疫 印 迹 法 示 意 图
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35
4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列
是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱 分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白 质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶ห้องสมุดไป่ตู้ 等。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
31
5 )免疫胶体金技术
用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗 体的方法
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(一)外周血单个核细胞分离
➢ 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
单核细胞（monocyte）。 ➢ Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
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细胞分离基本原理
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（三）免疫标记技术
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
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常用的标记物
酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质 及胶体金
优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以 对微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术主要类型：
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常用酶及其底物
➢ 辣根过氧化物酶（HRP） ➢ 碱性磷酸酶（AP）
➢
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分类
20
双抗体夹心法
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等
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特点：
❖ 非竞争结合反应 ❖ 常用于抗原的检测 ❖ 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇
的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测 ❖ 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
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抗原抗体比例对反应现象 的影响
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抗原抗体反应的影响因素
电解质：可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。
温度：最适温度为37℃。 酸碱度：最适pH =6-8。
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第二节 检测抗原或抗体的 体外试验
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（一）凝集反应 颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体
结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。
➢不同细胞密度不同 ➢不同细胞表面生物学特性不同 ➢不同细胞表面分化抗原不同
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不同细胞密度不同
➢人的红细胞密度为1.093 ➢粒细胞密度为1.092 ➢单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
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用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
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密度梯度离心(Ficoll)离心
1．直接凝集试验 玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，
细菌的鉴定、分型等。 试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。
2．间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。
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（二）沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与
相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故