分析化学第20章毛细管电泳法

第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
如果缓冲体系经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果， 可以加入添加剂以改善分离。添加剂种类较多：
1.无机电解质（NaCl、KCl）
2.有机溶剂（如甲醇、乙腈） 3.非电解质高分子（纤维素、多糖、聚乙烯醇、Triton X-100) 4. 功能性添加剂（手性冠醚、环糊精等）
√ 分离电压
√背景电解质种类、浓度和pH
√添加剂种类和浓度
第二十章 1. 分离电压

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分离效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作
电压。

在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低， 极大电压可能会超出仪器范围，此时没有最佳电压，可选择 仪器允许的最大输出电压。
讨论：分离度是下列因素的函数：①外加电压V；②有效柱长与总 长度之比（Ld/L）；③电泳有效淌度差；④电渗淌度
第二十章
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第三节

毛细管电泳的主要分离模式
毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE） 胶束电动色谱（micellar electrokinetic chromatography, MEKC) 毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE) 毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis, CITP) 毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focus, CIF) 毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC)
第二十章 五、分离度

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分离度是指将淌度相近的组分分离的能力
R 2(tm 2 tm1 ) tm 2 tm1 W1 W2 4
分离度也可表示为柱效的函数：
n u R 4 u
VLd 1/ 2 R eff ［ ］ DL（eff os） 4 2 1



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表面活性剂选择时应考虑以下因素：

（1）经济易得


（2）水溶性好
（3）紫外吸收背景越低越好 （4）不与样品发生破坏性作用 （5）所形成的胶束足够稳定
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碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象。SDS易得、紫外
吸收低，最为常用。如经浓度、缓冲溶液及pH优化，分离仍不佳，
James W. Jorgenson North Illinois University 化学系教授
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第二节 基本理论
一. 电渗

电渗（electroosmosis)是毛细管电泳分离理论中最基本的概 念之一。
电渗是指在电场作用下，毛细管中或固相多孔物质内，
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二、胶束电动色谱（MEKC）
在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如SDS），当表面活性剂浓度超过 其临界胶束浓度时，则形成亲水胶束，胶束具有疏水内核, 外层带负电荷。 溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相（假固定相）之间有一定的 分配。中性分子因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异。在电渗流作 用下，胶束携带溶质一起前行，疏水性强的溶质和胶束结合得较牢，流出慢。 不同分子在两相中的分配差异是MECC分离的基础。
为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和
分离度。硼酸盐缓冲体系也适用于其它含邻羟基或多羟基 的化合物分离。
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为了选择合适的pH值，需要pH调节剂调整介质的酸碱性。 由于多数缓冲试剂属酸性物质，如磷酸，所以pH调节剂主要是 碱类，常用的pH调节剂有NaOH、KOH、Tris等。有时也可考虑 用胺或醇胺等有机碱，如乙醇胺、乙二胺。如果缓冲试剂为碱类， 则可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸，如 H3PO4。 缓冲剂及调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附、控制焦耳热 等均有影响，一般缓冲试剂的浓度控制在 10 ～ 200mmol/L ，有 时为了抑制蛋白质等的吸附作用，可用高达 500mmol/L 的浓度 （此时应减少分离电压）。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸 盐等，一般控制在 20mmol/L，电导小的缓冲试剂如硼酸其浓度 可在100mmol/L以上。

当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压可能很小，若
此时分离度很高，也可选择大于极大值的电压进行分离。
第二十章 2.分离温度

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毛细管的温度不仅影响分离的重视性，而且影响分离效率。 温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介 质对温度的限制等因素。 温度的确定也应通过实验，多数情况下，在20～30℃之间 进行电泳，能获得良好的分离效果。可根据初步分离结果 调整温度。 不少糖类样品需要高于室温的分离环境，一些样品如蛋白 等则可能需要低于室温的分离条件。
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3.吸附
产生原因：
（1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用
（2）疏水作用。
对于生物大分子，如碱性蛋白和多肽等，吸附严重时可能导致测不
到信号。因此，生物大分子分析时常需用涂层处理的毛细管柱。
4.进样 5.电泳
（过载）
样品区带与周围电解质溶液间的电导率差，从而导致峰形展宽。
再换具有不同碳链长度或结构的其它阴离子表面活性剂。若结果 仍不好，应考虑使用阳离子或中性、两性表面活性剂，如CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）、Triton

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一、毛细管区带电泳（CZE）
毛细管电泳最基本的分离模式。背景电解质是缓冲液，分离是基于样品 中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用 以提高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。 在CZE中，影响分离的操作条件为：
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高效毛细管电泳
经典电泳法散热差，分离电压受到限制。 1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代 意义的工作，他们采用75μm内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上
检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万
个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了源自文库础。

在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、 异丙醇等，或水溶性高分子物质，对
EOF也有较显著的抑制作用。
第二十章 二 . 电泳

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电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场 中定向移动的现象。
电泳迁移速度 uep 为：

uep ep E ep
V L
式中
－电泳迁移率（电泳淌度） ep
（electrophoresis mobility)（m2/V.s） V－毛细管柱两端施加的电压, L－毛细管柱长
△在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为：
i ep 4
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三、表观淌度
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uap ueff uos （eff os ) E
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常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、 N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠（LMT）、牛磺脱氧胆酸 钠（STDC）等。 阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三 甲基溴化铵（DTAB）、十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB）等。 非离子型表面活性剂有3-[3-(氯化酰胺基丙基)二甲基 胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。 另外，还有手性表面活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、 十二烷基-N-L-缬氨酸钠等。
扩散层。
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在电场作用下，固液两相间的相对运动发生在紧密层与扩散层之间的 滑动面上。 由于离子的溶剂化作用，当形成扩散层的离子在电场中移动时，携带 着液体一同移动，因此产生电渗流（electroosmotic flow,EOF）
HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的流速轮廓 是一个平面，在毛细管中如同瓶塞一样流动，不存在径向的流速梯 度。这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一。

毛细管电泳分离柱效方程
从分离柱效方程可知：
（1）分离电压V↑, n↑ （2）V一定时，Ld/L ↑, n↑
（3）扩散系数D↓, n↑；大分子的D小，故CE对大分子分离柱效高。
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（二）引起区带展宽的因素
1.分子扩散 2.焦耳热
电流通过毛细管中的电解质溶液时会 产生焦耳热，使毛细管内及周围温度分布。 由于毛细管柱中沿径向存在一个抛物 线型的温度梯度，由此引起介质的粘 度在径向上的梯度分布，进而引起径 向上的电泳速度梯度。
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pH的选择也和毛细管种类有关，很多涂层毛细管只能在一
定pH范围内使用，如聚丙烯酰胺涂层毛细管，只能在
pH4~9范围内使用，否则涂层易水解失效。

在相同的pH下，不同缓冲体系的分离效果可能相差很大， 一般来说，能与样品发生相互作用的试剂可能是最好的。 如分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因


2
Ld H n
物质在毛细管中的保留时间为：
tm
Ld LLd uap apV
Ld为毛细管柱进样端至检测窗口的距离（有效长度）
L2 n d σ2
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L n σ
2 d 2
σ 2 2 Dtm
n
μ apVLd 2 DL
Ld LLd tm uap apV
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第一节 概述
电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自 身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归 功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋 白、α、β、和γ球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因 此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。
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在CZE中，常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、 柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。
缓冲体系的pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的
分离选择在碱性条件下进行，而碱性组分则选择酸性介质分离， 蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性(pH2)也可选碱性 (pH>9)分离介质。糖类样品通常在pH9~11之间能获得最佳分离， 羧酸或其它样品多在pH5~9之间选择分离条件。
表观淌度 正离子 中性分子 μeff+μos μos 表观迁移速度 ueff+ uos uos
负离子
μeff-μos
ueff - uos
由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还 是中性分子，均随电渗流移动。
第二十章 四、分离效率和谱带展宽
（一）理论板数和板高
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tm n 5.54 W 1/ 2
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缓冲液pH对电渗流的影响
阳离子型的表面活性剂使电渗流 发生反转
a.无表面活性剂存在；b．阳离子表 面活性剂在毛细管壁表面的吸附， 抵消了原来的负电荷，使电渗迁 移率0；c.继续增大阳离子表面活 性剂的浓度，阳离子表面活性剂 分子通过非极性链疏水相互作用， 在毛细管柱表面形成双分子层， 使电渗流反转. 随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基 解离度增加，界面有效电荷密度增大， EOF随之增大。
液体沿固体表面移动的现象。电渗与固液两相界面的双电 层有着密切关系。 电渗速度uos以下式表示：
os uos os E E 4
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石英毛细管壁上的硅羟基在水 溶液中发生电离，所产生的
SiO-负离子使毛细管壁带负电
荷。溶液中的抗衡离子靠静电 吸附和分子扩散在固液界面上 形成双电层（electric double layer)，双电层包括紧密层和


第二十章 3. 背景电解质 对背景电解质的要求：
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①在所选择的pH范围内有足够大的缓冲容量。 ②在检测波长处的吸收低。 ③自身的淌度低，即分子大而荷电小，以减少电流的产生。 ④应使被测组分带合适的电荷量，以实现有效进样和有合适的电泳 淌度。 ⑤尽可能采用酸性缓冲溶液，在低pH下，吸附和电渗流值都很小。 ⑥与毛细管种类匹配，涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。