代谢工程生产青蒿素

青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用 大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素 药物的生产主要依靠我国从野生和栽培青蒿 中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低 (0.1%-1% w/w),且受地域性种植影响较大。 目前使用青蒿素进行治疗每个疗程的费用是 ８美元到１５美元，对于受疟疾危害最深的 非洲和南美地区的贫困患者来说过于昂贵。
步骤如下： 步骤如下：
高度特异的简并 青蒿毛状体细胞的互 ＋ 引物 补DNA库 库
Fra Baidu bibliotek
PCR、凝 、 胶电泳回 收等 几个特定的 p450片段 片段
与之对应的mRNA 与之对应的
一个青蒿P450基因片段 转录 一个青蒿 基因片段
RT -PCR 完整P450cDNA（CYP71AV1） （ 完整 ）
BLAST分析法将这些片 分析法将这些片 段与向日葵和莴苣的 ESTｓ比对，发现有一 ｓ比对， 个青蒿P450基因片段与 个青蒿 基因片段与 来自检索所得ESTs序列 来自检索所得 序列 非常相似
首先，将一种截短的水溶性酶3 首先，将一种截短的水溶性酶3羟基- 甲基-戊二酰辅酶A 羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶 （简称HMGCoA还原酶，又简称 简称HMGCoA还原酶， HMGCoA还原酶 tHMGR，是固醇合成的限速酶） tHMGR，是固醇合成的限速酶）过 表达， 表达，可提高青蒿酸前体的合成 产量近五倍（ EPY208）； 产量近五倍（菌株 EPY208）；
青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿 细胞内合成的： 细胞内合成的：
焦磷酸法呢酯 （FPP） ）
amorphadiene
（合成青蒿酸及青
青蒿酸
蒿素的最直接的 前体原料 ）
青蒿素
青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
由于酵母也可以合成FPP， 由于酵母也可以合成FPP，所以我们所需要 FPP 做的只是将FPP到青蒿酸前体（ 做的只是将FPP到青蒿酸前体（ amorphadiene FPP到青蒿酸前体 ）、青蒿酸前体到青蒿酸这两个过程克隆进入 ）、青蒿酸前体到青蒿酸这两个过程克隆进入 青蒿酸前体到青蒿酸 酵母细胞内， 酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基 因进行调控， 因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸
代谢工程生产抗疟疾药物 前体--青蒿酸 前体--青蒿酸 -第一组 组长：曹慧珍、陈亚萍 主讲：周汉昌 组员：周汉昌、曹慧珍、陈茂盛、陈亚萍、 程业久、甘益军、高兆梁
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工作安排
姓名 周汉昌 曹慧珍 陈茂盛 陈亚萍 程业久 甘益军 高兆梁 具体工作 PPT演讲 PPT制作，文献收集 资料收集 PPT制作，文献收集 资料收集 资料收集 资料收集
青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
一种由我国学者在20世 纪70年代初从Artemisia annua L（菊科植物， 俗称青蒿）中提炼出来 的倍半萜内酯环内过氧 化物（C-15倍半萜），通过释放高剂量的 自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。 是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯 喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为治 疗疟疾的最大希望。
青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
酵母的生长代谢速率较青蒿要高出很多倍， 而且其培养条件容易控制，不受气候、政治 等因素的影响。因此，如果能用酵母生产青 蒿酸，那将是非常高产、高效的。
青蒿素、 青蒿素、青蒿酸
基于这些因素， 基于这些因素，科学家们开始尝试利用代谢工程手 段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“ 段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“ 青蒿素计划” 青蒿素计划”，由美国加利福尼亚大学伯克利分校的生 化工程师Jay 主持，并且起初就获得“比尔化工程师Jay Keasling 主持，并且起初就获得“比尔梅琳达盖茨基金会”4260万美元的资助 万美元的资助。 梅琳达盖茨基金会”4260万美元的资助。 等宣布， 2006 年，Keasling 等宣布，通过合成生物学技术 对一株酵母菌成功进行遗传工程改造， 对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以产 生高水平的青蒿酸 青蒿酸（ acid）——青蒿素的 生高水平的青蒿酸（artemisinic acid）——青蒿素的 一种直接的前体。 一种直接的前体。 该成果发表于2006 2006年 13日英国 自然》杂志上， 日英国《 该成果发表于2006年4月13日英国《自然》杂志上， 题为“ 题为“Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast”
现在我们已经得到了可以高效合成青蒿酸前体 的酵母菌株，但为能将青蒿酸前体转变成青蒿 酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化 青蒿酸前体转变成青蒿酸的酶的基因。 据报道，知道是一种特异的细胞色素P450酶对 青蒿酸前体进行专一性羟化，并通过数据库检 索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs） ，而且已拥有针对CYP71和CYP82家族（P450酶 在菊科植物中最多的两个家族，其序列已知） 高度特异的简并引物。 接下来就是通过对以上条件的运用得到青蒿中 这种特异的细胞色素P450基因。
而细胞中与青蒿酸前体的量最直接相 关的就是FPP的量，所以，为了提高啤酒酵 关的就是FPP的量，所以， FPP的量 母合成青蒿酸前体的能力，我们对FPP FPP合成 母合成青蒿酸前体的能力，我们对FPP合成 途径（甲羟戊酸合成途径）进行了总共5 途径（甲羟戊酸合成途径）进行了总共5次 的基因工程改造。 的基因工程改造。 几个与FPP合成相关的基因的表达被正 FPP合成相关的基因的表达被 几个与FPP合成相关的基因的表达被正 调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基 调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基 FPP 因被负调控 负调控。 因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗 传稳定性， 传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修 饰都是通过染色体融合 染色体融合进行的 饰都是通过染色体融合进行的 。具体过程 如下： ① ② ③ ④ ⑤ 如下：
提纯
通过用碱性缓冲液（pH为9的 Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山 梨醇）清洗胞体沉淀物，绝大部 分合成的青蒿酸（>96%）可以而 被分离出，而且冲洗之后细胞体 和培养基中的残留量仅为2%。青蒿酸不仅可以 被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过 质子化后会被束缚在细胞表面。利用这个特点 制定了一种便捷提纯方法：
再次， 再次，在酵母染色体更 远处在转进一个tHMGR 远处在转进一个tHMGR 拷贝可以将将其合成量 再增加50%达到149mg/L 50%达到 再增加50%达到149mg/L 219） （菌株 EPY 219）
；
最后，虽然编码FPP合酶的基因（ 最后，虽然编码FPP合酶的基因（ FPP合酶的基因 ERG20） ERG20）过表达对青蒿酸前体合成总量 EPY224）的提高效果非常小， （菌株 EPY224）的提高效果非常小， 但在细胞密度降低的情况下其合成量 但在细胞密度降低的情况下其合成量 细胞密度降低 10%。 却可增加10% 却可增加10%。将所有这些对基因的修 饰综合在菌株EPY224 EPY224上 饰综合在菌株EPY224上，青蒿酸前体 的合成量已经达到了153mg/L 的合成量已经达到了153mg/L , 是之 前所报道这种倍半萜( 前所报道这种倍半萜(烯)最大合成水 平的几乎500倍。 平的几乎500倍 500
代谢工程 青蒿酸、青蒿素
目录
合成流程 青蒿素提纯 总结与展望
代谢工程
Metabolic engineering 建立在重组 DNA 技术基础之上的代谢 工程技术，是一种在理解细胞代谢功能的 基础上，有目的地设计和改造生物体中已 有的代谢网络和表达调控网络，从而实现 更高效的生物化学转化、能量转移及大分 子装配过程的技术。代谢工程技术能够有 效地克服传统育种手段的突变非定向性和 设计非理性的缺点，自诞生以来，在改造 植物、动物、微生物的代谢功能方面得到 了广泛的应用。
提纯
混合培养物 细胞体沉淀物 碱性清洗 缓冲液 HCL调 调 pH
醚 抽 凝胶柱层析 物 提
纯度大于 95%的青蒿 的青蒿 酸
提纯
经检测， 经检测，可以确定所得到的这株 转基因酵母在发酵罐中能够直接合 成结构功能上完全正确的青蒿酸且 转基因酵母菌株的单位生产效率比 青蒿高了近两个数量级。 青蒿高了近两个数量级。
然后，尽管upc2然后，尽管upc2-1, 一个 upc2 可以加强UPC UPC２ 可以加强UPC２（啤酒酵母 中调节固醇合成的一个的通 用转录因子）活性的半显性 用转录因子） 突变体等位基因， 突变体等位基因，在已有菌 EPY208背景下过表达（ 背景下过表达 株 EPY208背景下过表达（ 菌株EPY210 EPY210） 菌株EPY210）对青蒿酸前体 合成的提高起的作用并不显 著，但结合对ERG9基因的负 但结合对ERG9基因的负 ERG9 调控， 调控，其过表达可将青蒿酸 前体的合成量提高到105 前体的合成量提高到105 mg/L（菌株EPY213 EPY213）； mg/L（菌株EPY213）；
其次， 其次，利用一个 methioninerepressible启动 methioninerepressible启动 PMET3) 子 (PMET3) ，通过对编码鲨 稀合酶（ 稀合酶（固醇生物合成途径 FPP合成后第一步 合成后第一步） 中FPP合成后第一步）的ERG9 基因进行负调控，可将amor 进行负调控 基因进行负调控，可将amor phadiene的合成量再增加两 phadiene的合成量再增加两 倍（菌株EPY225）； 菌株EPY225）； EPY225
经过以上步骤，相应的完整P450cDNA 经过以上步骤，相应的完整P450cDNA 完整 （CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的 CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的 ），一个编码495 开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。 开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。
为了保证异源表达 的CYP71AV1可以发挥正 CYP71AV1可以发挥正 常功能， 常功能，协同它进行氧 化还原反应的天然配体 NADPH： ，NADPH：细胞色素 P450氧化还原酶 氧化还原酶（ P450氧化还原酶（CPR ），同样从青蒿中成功 ），同样从青蒿中成功 分离， 分离，并且其生化活性 已经在体外被证实。 已经在体外被证实。
经证明， 经证明，体外实验中重组的 CYP71AV1能将amorpha- 11能将amorpha CYP71AV1能将amorpha-4, 11diene高效转化为青蒿酸 高效转化为青蒿酸， diene高效转化为青蒿酸，完全显 示出膜结合、多功能的CYP71AV1 示出膜结合、多功能的CYP71AV1 是青蒿素的生物合成中的关键促 是青蒿素的生物合成中的关键促 成因素。 成因素。
总的来说，采用改造 总的来说，采用改造FPP生物合成 生物合成 途径的方法获得了能高水平生产青蒿 途径的方法获得了能高水平生产青蒿 酸的啤酒酵母菌株。 酸的啤酒酵母菌株。该方法通过表达 青蒿酸前体合成酶,一种新型的细胞色 青蒿酸前体合成酶 一种新型的细胞色 一种 和与之相关的来自青蒿的氧化 素P450和与之相关的来自青蒿的氧化 和与之相关的来自青蒿的 还原酶来提高 的产量。 还原酶来提高FPP的产量。据了解， 来提高 的产量 据了解， 相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生 物的化学方法可能还有许多待改进之 处，但微生物法生产青蒿酸是获得此 类高效抗疟疾药物切实可行的方法。 类高效抗疟疾药物切实可行的方法。
具 体 流 程
为了将流程图转为现 实，对酵母细胞进行 了总共8 了总共8次的基因工 程改造。 程改造。
可分为两步：
一、FPP到青蒿酸前体 二、青蒿酸前体到青蒿酸
第一步， 第一步，为了能让酵母 青蒿酸前体， 细胞合成青蒿酸前体 细胞合成青蒿酸前体，我们 将ADS基因插入由GAL1 启动 ADS基因插入由GAL1 基因插入由 子控制转录的pRS425 pRS425质粒中 子控制转录的pRS425质粒中 然后在酵母细胞中表达， ，然后在酵母细胞中表达， 结果显示单独转入ADS ADS基因 结果显示单独转入ADS基因 的酵母只合成少量的青蒿酸 前体。如图中菌株EPY201， 前体。如图中菌株EPY201， EPY201 4.4mg/L 。