PCR荧光检测试剂盒生产质控规程.doc
PCR荧光检测试剂盒生产质量控制规程
一 . 微量加样器的使用规定
1．微量加样器校正： : 使用微量加样器吸10μl10 次是否为 100μl。
2．加样前吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形
式吸附在吸头里面，所以，在加样时先吸打液体数次，充分润湿吸头管腔,以保证加样的一致性。
3．加样时吸头应靠试管壁：加样时吸头的液体顺着管壁流出，防止液滴的
形成由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。
4．吸头是否与加样器上吸头套筒密封：样器上吸头与套筒密封完好。
5．加样时注意第一停点和第二停点：吸液是应注意大拇指按下按钮至第一
停点，缓慢慢慢吸入液体。停留 1s，然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸嘴外面
可能黏附的液滴。放液时经过第一停点，停 1-2s 后，继续按压到第二停点，排出
残余液体。
6．PCR反应原液由于有甘油在冷的状态较黏稠,易于 1 次吸取数人份，慢一些。
7．边加边看 ,直观估计 ,防止跳管。
8．低温冷藏批量 DNA 提取液、 PCR反应液 A 和 B 取出时是否充分混匀后 , 分装使用， PCR反应液 A 和 B 是否避光低温冷藏和使用。
9．配 PCR反应液应先加缓冲液再加 PCR反应液充分混匀 ,必要时倒置混匀 , 再离心 ,或用灭菌吸头上下吸几次。
10．PCR反应液（包括样品）应充分混匀:保证 PCR反应曲线呈 S 形，全阴性样品呈近似水平曲线。
二． PCR试验操作规程
程序操作检查操作
1 混匀方法每一次提醒注意倒置混匀、移液器吹打、震荡， 50000rpm
离心 1 分钟。
2 取血清样本1）因水分蒸发变浓按（1 ）法混匀 ,再取 25μ l 加水 5μ l 混匀。
2）冻状、混浊温水浴37℃溶解按（1）法混匀,或
12000rpm 离心 5 分钟，取清液。
3取质控品冻状、混浊温水浴37℃溶解按（1）法混匀或
12000rpm 离心 5 分钟，取清液。
4 血清样本稀释混匀血清阴性血清 40μ l 加阳性血清10μ l，按（1）
法混匀。 5 倍稀释
5 质控品稀释混匀质控品血清稀释液 40μ l 加质控品10μ l，按（1）
法混匀 5 倍稀释。
6 血清样本 DNA 提DNA 提取液完好血清样本按（ 1）法混匀，取 30μ l 加 DNA
取提取液 60μ l，按（ 1）法混匀， 98℃ 8
分钟变性 , 0℃冷却 2-3 分钟， 12000rpm ，
离心 10 分钟 ,吸取上清液。
7 质控品 DNA 变性分装，有效，呈清液质控品按（ 1）法混匀，取30μ l5000rpm
状态，未反复加热、离心 1 分钟， 98℃ 5 分钟变性 ,5000rpm ，
冻融离心 1 分钟 ,吸取上清液。
8 PCR反应液混匀状态取 25μ l 反应液加 5μ l 提取 DNA，按（1）
法混匀，5000rpm 离心 1 分钟， 5000rpm ，
离心 1 分钟 ,吸取上清液。
9 PCR反应室温 10-30 ℃PCR反应槽四角不放管。
10 设阴性对照阴性混匀血清CT〉 38
11 阳性参考品各浓度呈梯度以 PCRA反应液制作标准曲线，呈直线。
12 阴性质控品 B 各浓度呈梯度以 PCRA和 B 反应液制作标准曲线，呈直
线。
**血清稀释液：全阴性血清再加 2 倍 HBV DNA提取液混匀 , 5000rpm，离心 1 分钟，混匀血清 98℃ 5 分钟变性 ,12000rpm，离心 10 分钟 ,吸取上清液。
三 .超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程
1.目的
建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标
准化。
2.职责
质量部 QC 负责本文件的起草，质量部及QC 检验人员负责本标准的实施。
3.范围
本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。
4.内容
超净工作台的主要组成部分：高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制及排气管道部分。
安放点的选择：
4.2.1 应安放于卫生条件较好的地方，便于清洁，门窗能够密封以避免
外界的污染空气对室内的影响。
4.2.2 安放位置应远离有震动及噪音大的地方。
4.2.3 严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方，以保证操作区空气的正
常流动。
使用前的检查：
4.3.1 接通超净工作台的电源。
4.3.2 旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出
风面是否有风送出。
4.3.3 检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程
部检修。
4.3.4 工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理，认真进行清洁工作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理。
4.3.5 净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流动不受干扰。
使用：
4.4.1 使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂
擦拭消毒。
4.4.2 接通电源，提前 50 分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30 分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
4.4.3 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气
流不受干扰。
4.4.4 操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开
关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
4.4.5 最后开启工作台紫外灯，照射消毒30 分钟后，关闭紫外灯，切断
电源。
4.4.6 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标
准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。
4.4.7 每月进行一次维护检查，并填写维护记录。
清洁
4.5.1 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。
4.5.2 取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘。
4.5.3 用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁
布擦干。
4.5.4 要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁 , 否则会影响杀菌能力 .
4.5.5 效果评价 :设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。
四 .检验方法操作规范
1.混匀：反应液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后 5000 rpm 离心数秒 (按原说明进行 )。
2.准确：反应液及样本混匀后,每一步加样准确 (按原说明进行 )。
3.新鲜血清样本：血清样本混匀后离心（ 5000 rpm 离心数秒），取 30μl，加2 倍量 DNA 提取液 60μ l 混匀 100℃ 8--9 分钟变性，放置冰箱 0℃冷却 2-3 分钟 , 12000rpm 离心 5 分钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，再取 5μl 加样。
4.长期放置冰箱冷藏血清样本：取 25μl，加无菌水 5μl 加 2 倍量 DNA 提取液 60μl 混匀 98℃ 8--9 分钟变性，放置冰箱 0℃冷却 2-3 分钟 , 12000rpm 离心
5 分钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，再取 5μ l 加样 .
5.DNA提取液处理并冷藏保存血清样本：
DNA 提取液处理：血清样本混匀，取 200μl，加 DNA 提取液 400μl 混匀 98℃
5 分钟变性，放置冰箱 0℃冷却 2-3 分钟 , 12000rpm 离心 5 分钟，取出全部上清液置另 1 管混匀，冷藏保存，按 100μl / 管分装冷藏保存 .
保存血清样本使用：取 1 管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀， 5000 rpm 离心数秒，再取 30-40μl 98℃ 5-6 分钟变性，放置冰箱 0℃冷却 2-3 分钟 , 5000 rpm 离心数秒，再取 5μ l 加样 .
6.质粒 DNA 有关质控品（ P 和 N）：用全阴性血清与质粒 DNA 按 9:1 混匀 , 5000rpm，离心 1 分钟 ,再加 2 倍 HBV DNA提取液混匀 , 5000rpm，离心 1 分钟，
混匀血清 98℃ 5 分钟变性 ,12000rpm，离心 10 分钟 ,吸取上清液 , 取出全部上清液置另 1 管混匀，冷藏保存，按 100μl / 管分装冷藏保存 .
有关质控品使用：取 1 管分装冷藏保存质控品，融化后混匀， 5000 rpm 离心数秒，再取 30-40μ l 98℃ 5-6 分钟变性，放置冰箱 0℃冷却 2-3 分钟 , 5000 rpm
离心数秒，再取5μ l 加样 .
五 .防止荧光定量 PCR产物污染的质控规程
1.目的
规范荧光定量PCR实验和生产的操作过程，确保操作过程中无PCR产物污染。
2.适用范围
本规范适用于荧光定量 PCR实验和生产的操作过程。该规程参照中华人民共
和国《艾滋病核酸检测技术规范》。
3.职责划分
操作人员按照此标准操作规范进行荧光定量PCR实验和生产，质检部经理负责监督。
4.质量保证体系
实验室和生产工作区质控体系
4.1.1 实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备
区 (GMP 车间超净工作室 )、样品处理区（质检室 1）、扩增区（质检室 2）和扩增
产物分析区（质检室 3）。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。各区的功能是：
(1)样品处理区：样品登记、分装。各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提
取、保存和加样。
（ 2)试剂准备区： PCR扩增试剂的配制、分装和保存。
(3)扩增区：普通 PCR扩增及荧光定量PCR扩增。
(4)扩增产物分析区： PCR扩增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、
报告。
4.1.2 用有效的方法对操作区域和共用器具在实验前后进行清洁及消毒
推荐的程序是：
a. 实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后
用纸巾擦除。
b.移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。
c.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；封好污染材料盛放
器皿并移出至污物袋；移出共用器具至专门区域保管；将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；打开紫外灯照射至少15 分钟。
4.1.3 实验工作区内必须穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根
据要求戴不同规格的手套。
4.1.4 PCR产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时，如特定的凝胶
成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件，每位实验人员都要准确的命名自己的设置程序及分析结果，使用完毕后需收拾好所用的仪器并保存
好自己的实验分析结果。
4.1.5 各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。
荧光定量 PCR扩增实验过程控制体系：
4.2.1 样品的采集和处理
4.2.1.1 用于普通 PCR或荧光定量 PCR检测的样品有细胞、全血、血浆、各
种组织和其他分泌物，有时还包括生物制品。
4.2.1.2 采集样品应避免微生物和核酸污染（所用器皿必须无菌或属于一次性
用品， RNA类样品所用器皿必须没有RNA酶污染）。
4.2.1.3 处理样品应在样品处理区由专人进行。处理和保存用于抽提DNA 或
RNA的样品应避免 DNA 或 RNA酶造成的降解，通常要求在采样后 1 小时内处理
并低温保存。
4.2.1.4 处理后的样品应分装、标记（需用防水的笔填写），并做好实验记
录，冻存于 -20℃以下， DNA 或 RNA类样品应冻存于 -60℃或保存在液氮中。
4.2.2 核酸（ RNA/DNA）提取
4.2.2.1 应在规定的区域内由专人按相应程序进行。
4.2.2.2 应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次
性使用。
4.2.2.3 提取 RNA时应避免 RNA 酶污染，抽提 RNA 样品实验使用的移液器
及离心管等用品必须用DEPC处理，去除 RNA酶。
4.2.2.4配制RNA逆转录或DNA反应试剂，所有操作超过10 分钟时应将
反应管置于冰盒内，防止各种酶及样品DNA 或 RNA 降解。
4.2.3.3 进行逆转录反应时应避免RNA 酶污染，实验使用的移液器及离心管
等用品必须用 DEPC处理，去除 RNA酶。
4.2.3.4 扩增仪应预热，时间不少于20 分钟。
4.2.3.5 进行内参基因的扩增（β－ actin 或 GAPDH），并设置递增 PCR循环数，电泳确定逆转录的效率及CDNA样品的起始浓度，为荧光定量PCR实验做准备，成功的逆转录样品在 PCR扩增时 25 个循环即可见清晰的内参条带。
4.2.4 荧光定量 PCR实验：
4.2.4.1 应在样品处理区内加样。快速准确的将样品DNA 或 RNA 小心加入装
有反应液体的反应管内，盖紧盖子并做好标记。
4.2.4.2 操作超过 10 分钟时应将反应管置于冰盒内，防止酶降解及副反应发
生。
4.2.4.3 严格按照荧光定量PCR仪的操作手册启动机器，设置实验扩增程序，
保存文件，最好以日期及样品名称命。PCR扩增仪应预热，时间不少于20 分钟。
4.2.4.5 将反应管置于扩增仪上，开始扩增。
4.2.4.6 反应结束时停止实验程序，取出反应产物，－20℃保存。
4.2.4.7 扩增结果分析和定量按照操作手册进行，对三孔平行的实验结果必须
首先判断其是否准确（孔间差异>时应考虑舍弃该孔数据，并重新进行该样品的
荧光定量 PCR实验），然后根据标准曲线计算出各样品的浓度。
4.2.7.8 结果报告中应注明使用的实验方法、实验试剂、实验仪器及样品种类和样品量。
客户沟通质量体系：
4.3.1收到样品后，由专业的负责人进行样品的清点和整理工作，以确保
样品数目的准确性和样品的有效性。如有问题，应及时的与客户进行沟通。
4.3.2 在确保样品无误和有效的情况下，由专业的技术人员进行样品的处理
工作―――核酸的抽提工作（按照标准操作）；并进行抽提的DNA 或 RNA 的浓度测定。在此步骤实验结束后，将结果整理，并及时的发送给客户。如有问题出
现，则和客户及时沟通，保证实验的下一步工作。
4.3.3 在确保核酸的抽提正确和有效的前提下，进行逆转录的实验过程（按照
标准操作进行）。实验结束后，将结果整理，并及时的发送给客户。如有问题出
现，则和客户及时沟通，保证实验的下一步工作。
4.3.4 在确保逆转录正确和有效的前提下，进行样品的预实验过程。摸索检
测基因的反应条件，并将结果及时通知客户。
4.3.5 在预实验成功的前提下，进行正式的荧光定量PCR实验。实验开始后，每周和客户进行一次沟通（可以通过电话或e-mail 及网络方式），汇报实验的进展情况，并认真记录客户提出的建议和意见，对出现的问题随时协商解决。
六．试剂盒的生产和制备
1 试剂盒的生产和制备地点在GMP净化车间进行，净化车间内工作的
人员应穿着符合要求的工作服和帽子。选材、式样及穿戴方式应与生产操作和空
气洁净度级别要求相适应，并不得混用。
2 工艺用水制水设备应满足水质要求并通过验证，经灭菌处理。
3 微量加样器使用前后用灭菌消毒的纸包好，置传递窗，紫外线消除
DNA30 分钟。
4 生产区域定期清洁、清洗和消毒生产区域定期清洁、清洗和消毒，高
风险的生物活性物料其操作应使用单独的空气净化系统，与相邻区域保持负压，
排出的空气不能循环使用。
5 质粒 DNA 制备和提纯在质粒DNA制备和提纯过程中,所有器具都应灭菌
消毒，紫外线照射，确保无质粒 DNA 和 PCR产物污染。质粒 DNA 制备和提纯后，立即分装，置放于用高压处理的容器中，－60℃保存，防止质粒DNA 扩散和被PCR产物汽溶胶污染。
6 病毒 (HBV)核酸定量标准品、阴性参考品、阳性参考品，质粒DNA 和 PCR 产物污染防止将标准品和参考品包装表面清除质粒DNA 和 PCR产物污染后，在超净工作条件下，分装，置放于用高压灭菌处理的容器中，－60℃保存，防止质粒 DNA 扩散和被 PCR产物汽溶胶污染。
7PCR反应管的中 PCR反应产物污染消除应用尿嘧啶 -N-糖基化酶（ UNG 酶）对 DNA 中 dUTP的酶解作用酶 PCR反应产物 DNA.将 UNG 酶 100 u 单位浓度稀液稀释到μ,l 每支 PCR反应管中加入μl,进行 UNG 酶解 ,消除污染。
含 dUTP的 10mM dNTP 配制 :
原材料 : dATP 100mM 250/ μl; dGTP 100mM 250/ μl; dCTP 100mM 250/
μ l; dTATP 100mM /250μ l;dUTP 100mM /250 μl。
配制 10mM dNTP:dATP 100mM 20/ μl; dGTP 100mM 20/ μ l;dCTP 100mM 20/ μl; dTTP 100mM /10 μ l;dUTP 100mM /10 μ l; 合计 25 mM /80 μ l ,稀释倍 ---10 mM
/200 μ l。
PCR循环条件按以下设置： 37℃ 5 分钟 UNG 酶解反应，93℃ 3 分钟预变性，然后 93℃ 30 秒 ---55℃ 30 秒循环 10 次， 93℃ 30 秒---55℃ 60 秒循环 30 次。37℃ 5 分钟 UNG酶解反应 ,使 PCR反应产物污染完全消除。
七 .质量监控点：
工序质量控制点
原辅料
内包装材料生产前外包装材料
纯化水
校准原辅料配制物料质量控制项目频次
由指定供应商提供
批批检验每一进厂批次符合质量标准
符合质量标准 1 次/周
符合配制要求
品种、数量 1 次/批
计量设备经过校验 ,在有效期内
投料
双人复核称量
克隆菌
种保存纯化菌种菌种复壮、纯化、防污染1次/2月与纯化
阳性标
质粒制备纯度、浓度
准品制阳性标准品
1 次/批
配制、分装、低温保存
备
制备
阴性质
控品制血清蛋白制备无 HBV、配制、分装、低温保存 1 次/批备
PCR 反
防污染、移液
应液制精确加量、配制、分装、低温保存随时 /班器
备
包材数量、无破损、色泽统一
包装批号正确、清晰随时 /班成品数量准确、包装码放符合要求
试剂盒低温
防止反复冻融，出现菌斑随时 /班
保存
洁净
八 .生物安全准则
本标准旨在规范临床实验室的安全管理，内容着重在实验室和工作人员安全
的一般要求，防火、用电、化学危险物品、微生物的安全要求，以保证实验室的安
全运作，将事故控制在最低限度。为各级临床实验室的安全管理提供依据。
1.工作人员和实验室安全的一般要求
实验室工作区内绝对禁止吸烟。
实验工作区内不得有食物、饮料及存在“手－口”接触可能的其它物质。实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。
实验工作区内禁止使用化妆品进行化妆。
处理腐蚀性或毒性物质时，须使用安全镜、面罩或其它保护眼睛和面部的防护用品。工作人员在实验室的危险区内不要佩戴隐形眼镜，除非同时使用护目镜或面罩。使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂，或有可能发生试剂溅溢的
情况时，必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。
实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触患者前后、以及在进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、体液或其它污染物时，应立即洗手。
外衣（实验服、工作服、和围裙）应悬挂在远离散热器、蒸汽管道、供暖装置、以及有明火的地方，不要挂在压缩气瓶或灭火器上，也不要挂在门的玻璃隔板上，妨碍视线。“清洁”的和“非清洁”的个人防护服要分开存放。
实验室的出口和通道必须保持畅通无阻，不准堆放物品、垃圾、装置、或设备。安全门必须保持畅通，不得堵塞。防火门前不能堆物，以确保失火时能够自
动关闭。
2.实验室用电安全准则
作为仪器维护措施的一部分，应进行年度的安全用电检查并建立档案记录。实验室应装有足够的插座，分布要合理，以减少在插座上接上其它多用插座和避免拖拉过多的电线。
所有电器设备的维修与维护只能由取得正式资格的维修人员进行。
3.实验室微生物安全准则
在临床实验室，工作人员在接触标本和操作过程中，可能被感染。临床实验室可能接触的微生物可分为三类：病毒、细菌、其他具有高毒力的病原体，如出
血热病毒和立克次体。因为从病史和体检不能可靠地鉴定所有病人的病原体，所以当接触和处理所有的体液时，均应执行“常规预防措施”。
所有的单位都应执行“常规预防措施”。另外，每个实验室都应确定每个职员工作岗位的潜接触的程度。一旦确定有接触潜在感染原的可能，应采取硬件控制和操作过程控制，以减少或消除接触这些潜在感染原的可能。各单位应提供相应的个人防护装备，如手套、工作服、实验服、面罩、面具、护目镜、安全镜和鞋套等。并讲解何时使用和如何使用。
来自所有病人的血液和体液都被认为是具有传染性的。所有血液和体液的标
本都应放置于具有安全盖的结构优良的容器里，以防在运输过程中发生泄漏。采集标本时应防止污染容器的外表或随标本的检验单。如果存在潜在的或实际的污
染，则应再加一层包装（例如：包装袋）。所有的标本应加上生物危害标签。所
有处理血液和体液（例如：取下真空试管的塞子）的工作人员都应戴上手套。
如果有可能发生血液或体液的喷溅，则应使用面部防护装备。
血液或其他体液发生泄漏或工作结束后及，均应使用合适的化学杀菌剂对
实验室工作区进行表面消毒。可使用新鲜配制的漂白粉溶液（次氯酸钠1:10 稀释液）和％甲酚溶液或其它有效的溶液对所有的工作台进行消毒。漂白剂溶液应至少作用 15 分钟，使用其它的消毒剂可参考其产品说明书。
手或其他部位皮肤接触血液或其他体液后必须立即彻底清洗。在实验工作
结束后或取下手套后应立即洗手。在离开实验室之前应脱下所有的个人防护装
备。
必须采用通用的警告标志系统明确标识装有危险生物制品的容器或被其污
染的物品，在危险废弃物的容器、存放血液和其它有潜在传染性物品的冰箱、以及处理尖锐物品的容器上，所贴的标签应标明通用的生物危害标志。
生物安全橱是微生物实验室里控制生物危害的最好的方式之一。实验室应制定安全橱的维护规程，以确保安全橱内合适的气流流速，并适时更换滤器。安全橱的放置应远离气流不稳定的地方，通风口的设置应根据产品说明书。在维护、
移动和使用或处理安全橱之前必须对生物安全橱进行消毒。