Pull down与免疫共沉淀实验
pull down 实验方法
.；.Pull Down实验流程1. 混合两种预测相互作用的蛋白。
（Protein-A-GST & Protein-B-HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。
如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续Pull Down。
）2. 加入1 mL Binding Buffer。
Binding Buffer：50 mM Tris.HCl （pH7.50.）100 mM NaCl0.25% Triton-X 10035 mM β-Me（巯基乙醇）3. 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4 h。
4. 加入20-30 μL GST-Bind TM Resin结合2-4 h。
5. 4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。
第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。
6. 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5-10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清。
7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。
8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的Loading Buffer，95℃金属浴5-10 min，150-200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。
电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。
用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS ，GST+ Protein-B-HIS，Protein-A-GST+ Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST ，HIS+ Protein-A-GST，Protein-B-HIS+ Protein-B-GST9. 转PVDF膜，350 mA 恒流，2 h 左右。
Co-IP结果如何看？_Co-IP（免疫共沉淀）与GSTpull-down区别
Co-IP结果如何看？_Co-IP（免疫共沉淀）与GSTpull-down区别Co-IP是检测分⼦间相互作⽤的常⽤技术，德泰发现有很多实验⼈员反映在查看论⽂⽂献的过程中，遇到Co-IP实验结果图不知道如何进⾏分析。
本⽂从不同的⽂献中找了四个Co-IP的结果图，⽤案例的⽅式对如何分析Co-IP实验结果图进⾏介绍。
Co-IP结果如何看？⾸先需要说明的是，熟悉了解免疫共沉淀实验的原理及实验的操作流程是进⾏Co-IP结果图分析的前提。
在清楚知道Co-IP操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图中展⽰的结果进⾏分析，便可以看懂Co-IP的实验结果图。
Co-IP结果分析案例⼀该图为验证蛋⽩EDR1与蛋⽩EDR4之间是否存在相互作⽤的结果图。
由图中可以得到，蛋⽩EDR4带有GDP标签，蛋⽩EDR1带有FLAG标签，该实验为利⽤蛋⽩标签来沉淀和检测蛋⽩；该co-ip实验实验被分为两组，第⼀组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋⽩，第⼆组存在EDR4-GFP蛋⽩及EDR1-FLAG蛋⽩；图中共有三组胶图，分别是Inut组，IP组，以及CO-IP组。
基本情况得到之后，开始进⾏分析：观察图⽚的顺序为Co-IP实验操作顺序相同。
⾸先观察Input组，即阳性独照组。
第⼀块胶图为利⽤anti-FLAG沉淀FLAG标签，发现两个条带都在130kd处有蛋⽩，说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋⽩且其⼤⼩为130kd，第⼆块胶图为利⽤anti-GFP标签沉淀GFP标签，发现第⼀条带在25kd存在蛋⽩⽽第⼆条带在130kd存在蛋⽩，说明第⼀组实验存在GFP标签，且⼤⼩为25kd，第⼆组实验存在EDR4-GFP蛋⽩且⼤⼩为130kd。
随后观察IP组，该组图表⽰的是利⽤anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋⽩进⾏沉淀，图上显⽰两组实验在130kd都存在蛋⽩，说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。
最后观察CO-IP实验组，该组图表⽰在IP组的基础上进⼀步利⽤anti-GFP检测GFP标签，图上显⽰第⼀组实验没有条带，⽽第⼆组实验在130kd处有蛋⽩。
pull-down实验和免疫共沉淀足够证明分子互作吗
百泰派克生物科技
pull-down实验和免疫共沉淀足够证明分子互作
吗
Pull-down实验和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）都是研究蛋白质分子相互作用的常用方法。
根据二者的实验原理可知，理论上是可以证明蛋白质与蛋白质之间的相互作用的。
但是，根据两种技术的局限性也不难排除以下情况：Co-IP可能无法检测到蛋白质之间的低亲和力或短暂的相互作用；再者检测结果不能确定交互作用是直接的还是间接的，因为不能排除其他蛋白在中间起桥梁作用的可能性。
而Pull-down受外界条件影响较大，并不能真正反映蛋白质在真实生理状态条件下的相互作用，因为它们在体外相互结合并不意味着它们在体内有生理结合。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供基于Pull Down和Co-IP的蛋白质相互作用分析服务技术包裹，可以鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用、寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
coIP技术
coIP就是co-immunoprecipitation，假如有两种蛋白质A,B相互作用，那么用anti-A可以将A,B complex一起免疫沉淀下来，即pull down，然后用anti-B来检测pull down 得到的产物中B的存在。
这样就可以证明A,B之间有直接或间接的作用。
co-IP一般是用来做invivo相互作用的。
pull down 和coIP 不是完全一样的虽然coIP的实验也可以算是把一些蛋白pull down下来了但是我看很多生化文献上“pull down”是一种专门的实验一般就是拿个柱子，上面挂个GST-蛋白A之类的，然后拿细胞裂解液之类的过柱子能和A结合的B就会被pulldown，然后再把挂在柱子上的东西洗脱下来一般跑个电泳啦作个western之类的这个叫pull down，和co IP 也差不多I ntroduction to Pull-Down AssaysCritical Components of Pull-Down AssaysProFound Pull-Down Protein:Protein Interaction KitsIntroduction to Pull-Down AssaysElucidating gene function involves determining the function of each gene’s encoded protein product. In the cell, proteins participate in extensive networks of protein:protein interactions. These interactions take the form of dynamic “protein machines”, which assemble and disassemble in concert with an ever-changing influx of intra, inter and extracellular cues. A preliminary step in understanding protein structure and function is to determine which proteins interact with each other, thereby identifying the relevant biological pathways. The pull-down technique has become an invaluable tool for the life scientist interested in studying cellular pathways via protein:protein interactions.The pull-down assay is an in vitro method used to determine physical interaction between two or more proteins. Pull-down assays are useful for both confirming the existence of a protein:protein interaction predicted by other research techniques (e.g.,co-immunoprecipitation, yeast two-hybrid and density gradient centrifugation) and as an initial screening assay for identifying previously unknown protein:protein interactions. The minimal requirement for a pull-down assay is the availability of a purified and tagged protein (the bait) which will be used to captur e and ‘pull-down’ a protein-binding partner (the prey).Pull-down assays are a form of affinity purification and are very similar to immunoprecipitation (see previous topic in this section) except that a bait protein is used instead of an antibody. Affinity chromatography (i.e., affinity purification) methodologies greatly enhance the speed and efficiency of protein purification and simultaneously provide the technology platform for performing a pull-down, or co-purification, of potential binding partners. In a pull-down assay, atagged bait protein is captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag, thereby generating a ‘secondary affinity support’ for purifying other proteins that interact with the bait protein. The secondary affinity support of immobilized bait can be incubated with a variety of other protein sources that contain putative prey proteins. The source of prey protein at this step depends on whether the researcher is confirming previously suspected protein:protein interactions or identifying unknown protein:protein interactions.The Pull-Down Assay as a Confirmatory ToolConfirmation of previously suspected interactions typically utilizes a prey protein source that has been expressed in an artificial protein expression system. This allows the researcher to work with a larger quantity of the protein than is typically available under endogenous expression conditions and eliminates confusing results, which could arise from interaction of the bait with other interacting proteins present in the endogenous system that are not under study. Protein expression system lysates (i.e., E. coli or baculovirus-infected insect cells), in vitro transcription/translation reactions, and previously purified proteins are appropriate prey protein sources for confirmatory studies.The Pull-Down Assay as a Discovery ToolDiscovery of unknown interactions contrasts with confirmatory studies because the research interest lies in discovering new proteins in the endogenous environment that interact with a given bait protein. The endogenous environment can entail a plethora of possible protein sources but is generally characterized as a complex protein mixture considered to be the native environment of the bait protein. Any cellular lysate in which the bait is normally expressed, or complex biological fluid (i.e. blood, intestinal secretions, etc.) where the bait would be functional, are appropriate prey protein sources for discovery studies.(back to top)Critical Components of Pull-Down AssaysBait Protein CriteriaBait proteins for pull-down assays can be generated either by linking an affinity tag to proteins purified by traditional purification methods or by expressing recombinant fusion-tagged proteins. Researchers who have access to commercially available purified proteins or frozen aliquots of purified protein from an earlier study can design a pull-down assay without the need for cloning the gene encoding the protein of interest. The purified protein can be tagged with a protein-reactive tag (e.g., Sulfo-NHS-LC-Biotin, Product # 21335) commonly used for such labeling applications. Alternatively, if a cloned gene is available, molecular biology methods can be employed to subclone the gene to an appropriate vector with a fusion tag (e.g., 6xHis or glutathione S-transferase, GST). Recombinant clones can be overexpressed and easily purified, resulting in an abundance of bait protein for use in pull-down assays.Binding Parameters: Stable vs. Transient InteractionsDiscovery and confirmation of protein:protein interactions using the pull-down technique depend heavily on the nature of the interaction under study. Interactions can be stable ortransient and this characteristic determines the conditions for optimizing binding between bait and prey proteins. Stable interactions make up most cellular structural features but can also occur in enzymatic complexes that form identifiable structures. Transient interactions are usually associated with transport or enzymatic mechanisms. The ribosome illustrates both examples because the structure consists of many stable protein:protein interactions, but the enzymatic mechanism that translates mRNA to nascent protein requires transient interactions.Stable protein:protein interactions are easiest to isolate by physical methods like pull-down assays because the protein complex does not disassemble over time. Since these interactions often contribute to cellular structure, the dissociation constant between proteins is usually low, correlating to a strong interaction. Strong, stable protein complexes can be washed extensively with high ionic strength buffers to eliminate any false positive results due to nonspecific interactions. If the complex interaction has a higher dissociation constant and is a weaker interaction, the interaction strength and thus protein complex recovery can be improved by optimizing the assay conditions related to pH, salt species and salt concentration. Problems of nonspecific interactions can be minimized with careful design of appropriate control experiments (see below).Transient interactions are defined by their temporal interaction with other proteins and are the most challenging protein:protein interactions to isolate. These interactions are more difficult to identify using physical methods like pull-down assays because the complex may dissociate during the assay. Since transient interactions occur during transport or as part of enzymatic processes, they often require cofactors and energy via nucleotide triphosphates hydrolysis. Incorporating cofactors and nonhydrolyzable NTP analogs during assay optimization can serve to ‘trap’ interacting proteins in different stages of a functional complex that is dependent on the cofactor or NTP.Elution of the Bait-Prey ComplexIdentification of bait-prey interactions requires that the complex is removed from the affinity support and analyzed by standard protein detection methods. The entire complex can be eluted from the affinity support by utilizing SDS-PAGE loading buffer or a competitive analyte specific for the tag on the bait protein. SDS-PAGE loading buffer is a harsh treatment that will denature all protein in the sample, and it restricts analysis to SDS-PAGE. This method may also strip excess protein off the affinity support that is nonspecifically bound to the matrix, and this material will interfere with analysis. Competitive analyte elution is much more specific for the bait-prey interaction because it does not strip proteins that are nonspecifically bound to the affinity support. This method is non-denaturing; thus, it can elute a biologically-functional protein complex, which could be useful for subsequent studies.An alternative elution protocol allows selective elution of prey proteins while the bait remains immobilized. This is accomplished using a step-wise gradient of increasing salt concentration or a step-wise gradient of decreasing pH. A gradient elution is not necessary once the critical salt concentration or pH has been optimized for efficient elution. These elution methods are also non-denaturing and can be informative in determining relative interaction strength.Gel Detection of Bait-Prey ComplexProtein complexes contained in eluted samples can be visualized by SDS-PAGE and associated detection methods including gel staining with Pierce GelCode Stains (e.g., Product # 24590, 24592), Western blotting detection with SuperSignal Chemiluminescent Substrates (e.g., Product # 34080) and 35S radioisotopic detection. Final determination of interacting proteins often entails protein band isolation from a polyacrylamide gel, tryptic digestion of the isolated protein and mass spectrometric identification of digested peptides.Importance of Control Experiments for the Pull-Down AssayIn all pull-down assays, carefully designed control experiments are absolutely necessary for generating biologically significant results. A negative control consisting of a non-treated affinity support (minus bait protein sample, plus prey protein sample) helps to identify and eliminate false positives caused by nonspecific binding of proteins to the affinity support. The immobilized bait control (plus bait protein sample, minus prey protein sample) helps identify and eliminate false positives caused by nonspecific binding of proteins to the tag of the bait protein. The immobilized bait control also serves as a positive control to verify that the affinity support is functional for capturing the tagged bait protein.(back to top)ProFound Pull-Down Protein:Protein Interaction Kits‘Homemade’ pull-down methodologies for confirming or identifying protein:protein interactions are ubiquitous in contemporary scientific literature. The homemade pull-down assay represents a collection of reagents from multiple commercial vendors that cannot be validated together as a functional assembly except by extensive assay development by the researcher. Troubleshooting this mix of reagents can be tedious and time-consuming. ProFoundPull-Down Protein:Protein Interaction Kits (Product # 21115, 21277, 21516) contain complete, validated sets of reagents specifically developed for performing pull-down assays. The buffers provided in each kit allow complete flexibility to determine optimal conditions for isolating interacting proteins. The working solutions for washing and binding are physiologic in pH and ionic strength, providing a starting point from which specific buffer conditions for each unique interacting pair can be optim ized. These kits incorporate the Handee™ Mini-Spin Column format for efficient handling of small volumes of affinity support. The format allows complete retention of the affinity support during the pull-down assay, eliminating one important source of variability common in traditional pull-down assay formats.(back to top)Recommended Reading•Einarson, M.B. and Orlinick, J.R. (2002). Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione S-Transferase Fusion Proteins. In Protein-Protein Interactions: AMolecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 37-57.•Einarson, M.B. (2001). Detection of Protein-Protein Interactions Using the GST Fusion Protein Pulldown Technique. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.18.55-18.59.•Vikis, H.G. and Guan, K.-L. (2004). Glutathione-S-Transferase-Fusion Based Assays for Studying Protein-Protein Interactions. In Protein-Protein Interactions, Methods andApplications, Methods in Molecular Biology, 261, Fu, H. Ed. Humana Press, Totowa, N.J., pp. 175-186.。
GST pull down过程
GST pull-downGST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST pull-down技术GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行，这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。
但也基于此点，免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。
而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
GST亲和层析和GST Pull-down方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH （Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
拉下实验（Pull-down assay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（binding assay in vitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。
免疫共沉淀实验方法
免疫共沉淀实验方法免疫共沉淀实验方法是一种常用的蛋白质相互作用研究方法，通过利用抗体与目标蛋白之间的特异性结合来寻找与目标蛋白相互作用的蛋白质。
下面将详细介绍免疫共沉淀实验方法的步骤和注意事项。
步骤一：制备样品首先需要制备含有目标蛋白的样品，可以是细胞提取物、组织提取物或纯化的蛋白。
样品需要在低温下保存，并在实验前加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以保持蛋白的完整性。
步骤二：制备抗体制备抗体需要选择与目标蛋白特异性结合的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
抗体需要在低温下保存，并在实验前进行免疫球蛋白纯化和浓度调整。
步骤三：免疫共沉淀实验1. 将制备好的样品加入到含有抗体的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
2. 将混合物加入到预先平衡好的蛋白A/G琼脂糖中，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置2小时或过夜。
3. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
4. 重复步骤3，洗涤3次。
5. 加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
6. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
7. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
8. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
9. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
10. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
11. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
12. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
13. 将琼脂糖用离心管离心，去除上清液，加入洗涤缓冲液，轻轻摇晃混合，放置在4℃下静置10分钟。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。
蛋白互作常用的研究方法
蛋白互作常用的研究方法蛋白互作技术蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。
所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。
经典的蛋白互作研究方法主要包括三个：酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down。
蛋白质互作（图片来源：百泰派克生物【biotech-pack】）1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B 也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上三种方法是比较经典的研究筛选和验证蛋白互作关系的方法。
但是也存在一定局限性。
酵母双杂交可以大规模的筛选未知的互作蛋白，但是假阳性高，免疫共沉淀及pull down只是对已知的蛋白互作关系进行验证，不能发现新的未知蛋白。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
免疫沉淀与Pull-down实验
百泰派克生物科技免疫沉淀与Pull-down实验免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一种基于抗体和抗原特异性结合的原理开发的用来检测、分离、纯化蛋白质以及研究蛋白互作的方法。
免疫沉淀技术提供结合抗体蛋白的磁珠，将细胞裂解液或组织提取液等蛋白混合体系与磁珠进行孵化，此时，混合体系中的目标蛋白与磁珠上的抗体蛋白实现特异性结合，再通过离心或洗脱去掉没有与抗体蛋白结合的杂蛋白，将目标蛋白分离出来，通过与其他技术（如质谱）结合可以鉴定目标蛋白的种类、分析蛋白相互作用。
Pull down实验又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术，蛋白Pull down技术可以提供一种诱饵蛋白来特异性识别配体蛋白质，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白质的目的，是体外研究蛋白与蛋白相互作用的有力工具。
诱饵蛋白的实质是被亲和试剂标签（如谷胱甘肽-S-转移酶、组氨酸六肽、生物素）标记的已知蛋白。
现又衍生了一种DNA pull down技术，用来研究DNA与蛋白质的互作。
蛋白Pull-down可用于证实已知的蛋白或肽的相互作用，也可以用来发掘未知的蛋白或肽的相互作用。
综上，免疫沉淀和Pull down实验都可以用于分离、富集、纯化蛋白质以及研究蛋白质相互作用，只是二者的原理存在差异。
百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC纳升色谱，为广大科研工作者提供基于Pull down和免疫沉淀的蛋白质相互作用分析一站式技术服务，以及后续基于液质联用技术（LC-MS/MS）对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定分析服务。
欢迎免费咨询：152****7680（微信同号）。
相关服务：CO-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析。
GST pull-down蛋白相互作用分析。
SILAC与免疫共沉淀结合质谱联用的蛋白互作分析。
蛋白质相互作用质谱分析。
Pull-down实验和免疫共沉淀
Pull-down实验和免疫共沉淀Pull-down实验及原理Pull down是一种研究蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的体外方法，这里主要讲研究蛋白与蛋白互作的pull-down实验。
在Pull-down实验中，首先要利用基因重组技术构建含有亲和标签与诱饵蛋白基因的载体，然后通过表达纯化得到带亲和标签的诱饵蛋白，该诱饵蛋白可固定在某种基质上以吸附细胞裂解液中的能与诱饵蛋白互作的蛋白，之后再通过洗脱即可得到目的蛋白，对目的蛋白进行检测可实现诱饵蛋白与目的蛋白相互作用的分析。
Pull-down实验的基本原理是将一种含亲和标签的蛋白质作为“诱饵蛋白”固定于某种基质上，当细胞或组织裂解液经过该基质时，可与“诱饵蛋白”相互作用的蛋白就会被吸附，而没有被吸附的其他蛋白质则被洗脱液洗脱，被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而被回收，从而获得能与已知蛋白（即带亲和标签的诱饵蛋白）相互作用的蛋白。
诱饵蛋白上的亲和标签是pull down实验的基础。
常见的诱饵蛋白的亲和标签包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签和多组氨酸（6×His）标签。
Pull-down实验后可以对获得的互作蛋白进行电泳分析或质谱鉴定等，以确定已知蛋白或发现未知蛋白。
Pull down串联质谱Pull down实验也叫做蛋白质体外结合实验，是一种在体外研究蛋白质与蛋白质相互作用的简单而灵敏的技术。
Pull-down实验，通过带亲和标签的诱饵蛋白可以把细胞或组织裂解液中与诱饵蛋白相互作用的蛋白质拉下来。
串联质谱用于被拉下来的蛋白质的分析鉴定，然后就可以确认与诱饵蛋白互作的蛋白是不是研究者预想的蛋白质，以及得到互作蛋白是什么蛋白等信息。
免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-IP）是一种研究天然状态下蛋白质与蛋白质相互作用的技术。
在Co-IP实验中，首先要使用非离子型表面活性剂来裂解细胞或组织样品以更好的保留完整的蛋白质与蛋白质相互作用，然后加入某一蛋白（诱饵蛋白）的专一性抗体，该抗体与诱饵蛋白结合使诱饵蛋白沉淀，同时也可以沉淀与诱饵蛋白相互作用结合在一起的其它蛋白，也就是实现共沉淀，之后通过洗脱即可得蛋白复合物（诱饵蛋白与其互作蛋白的复合物），对产物进行检测可实现互作蛋白的分析。
pull-down assay results
Pull-down assay是一种用于研究蛋白质相互作用的常见实验方法。
它通过利用亲和层析原理，实现对蛋白质间相互作用的检测与分析。
本文将结合最新的研究成果，共享关于pull-down assay结果的相关内容，希望对读者有所帮助。
一、实验设计我们在进行pull-down assay实验时，首先需要选择目标蛋白和其潜在的相互作用蛋白。
在实验设计阶段，我们需要明确每个蛋白的结构特点和功能，以便正确选择亲和层析柱和免疫印迹检测等实验条件。
二、试剂和仪器准备在pull-down assay实验中，常用的试剂包括亲和层析柱、抗体、洗涤缓冲液、蛋白抽提缓冲液等。
我们还需要准备免疫印迹检测所需的试剂和仪器设备，如SDS-PAGE凝胶、蛋白转印膜、蛋白标记物、辅助试剂等。
三、实验操作步骤1. 蛋白抽提和结合我们需要从细胞或组织中提取目标蛋白，并将其与亲和层析柱结合。
在结合过程中，需注意控制蛋白的浓度和结合时间，确保结合效果达到最佳状态。
2. 洗涤和洗脱将样品通过亲和层析柱后，需要进行洗涤步骤以去除非特异性结合的蛋白。
之后，再用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来，为后续的免疫印迹检测做准备。
3. 免疫印迹检测将洗脱后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转印到膜上。
进行抗体的孵育和显色显影步骤。
最终获得目标蛋白在膜上的免疫荧光信号，用于分析蛋白相互作用的结果。
四、实验结果分析分析pull-down assay的结果时，我们需要关注蛋白的结合度和特异性。
通过浓度比较、Western blot和共沉淀等方法，可以定量和定性地评估蛋白相互作用的强弱和可靠性。
还需对实验条件和操作过程进行控制实验，以排除假阳性或假阴性的可能影响。
五、应用和展望根据pull-down assay的实验结果，我们可以进一步探究蛋白相互作用在细胞信号传导、疾病发生等生物学过程中的作用机制。
结合生物信息学和基因工程技术，可以设计新型蛋白互作实验方法或改良现有的实验流程，为生命科学领域的研究和应用提供更多的可能性。
免疫共沉淀和GST pull down
免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行，这样蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。
但也基于此点，免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的，因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物，而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。
而GST-Pull down实验可以通过体外实验条件，去除其它蛋白的影响，从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。
GST亲和层析和GST Pull-down方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。
因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
检测两种蛋白质之间相互作用
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较1. 生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western又叫做亲和印记。
将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。
而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。
该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。
分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。
缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。
融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。
不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。
它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。
Pulldown实验与免疫共沉淀
Pulldown实验与免疫共沉淀Pull down技术的基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），但细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。
被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。
通过pull down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外转录或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
为了更有效地利用pull down技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。
1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。
从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。
GST融合蛋白在经过固定有谷胱甘肽（GSH）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。
当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。
一般来说，GST融合蛋白pull down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。
为排除假阳性所设的一组对照实验是在没有诱饵蛋白存在的条件下，将样品结合到GST上。
该对照可以是表达有GST（非诱饵融合蛋白）的分别转化细胞裂解物，也可以是将GST 加到非转化细胞的裂解物中。
设计合适的对照实验非常重要。
该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。
除了GST以外，类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。
Pull down实验一般用于体外转录或翻译体系，如酵母双杂交系统中检测蛋白质之间的相互作用。
免疫共沉淀-研究生实验课演示教学
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复 合物。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
缺点
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白 质相互作用
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用western blot检验，必须在实验前预测目的 蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测 不正确，实验就得不到结果（但如果结合质谱 检测就可以分析所有的结合蛋白的种类）。
加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM βGlycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解细胞；
Thank U
采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相 互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种 细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变 性剂（0.2％SDS)。 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶 抑制剂，低温下进行实验。
Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此 在做磷酸化的信号转导时需添加。
免疫共沉淀
（co-immunoprecipitation）
背景
• 据估计，人体中大约总共可产生500,000种蛋白，而单个细 胞可以产生 10,000 种。
• 在这些蛋白中，80%不是以独立的方式存在的，而是存在 于一个蛋白复合体中。
• 蛋白-蛋白的相互作用包含在一个细胞网络中，我们形象地 称之为通过节点（nodes）连接的枢纽（hubs）。
体外下拉实验和免疫共沉淀结合
百泰派克生物科技体外下拉实验和免疫共沉淀结合体外下拉实验和免疫共沉淀结合使用可作为验证体内外蛋白质间接或直接相互作用的强有力方法，两者都是利用亲和配体来捕获互作蛋白，也可分开单独作为研究蛋白质相互作用的方法。
免疫共沉淀实验，即Co-IP实验，是以抗体与抗原之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法, 也是确定2种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
这种方法常用于测定2种目的蛋白是否在体内结合；也可用于确定1种特定蛋白的新互作蛋白。
蛋白质之间的天然相互作用得以最大程度的保留，因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用，可分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合物。
其存在的缺陷是可能检测不到低亲和力蛋白与蛋白之间的瞬时相互作用，也不能说明两种蛋白可能不是直接结合。
此时，为了弥补这个缺陷，可通过体外Pull-down实验利用一个纯化且含有标签的蛋白作为诱饵来结合互作蛋白进行检测，可用于Co-IP实验之前预测目的蛋白或Co-IP之后在体外环境下验证两种蛋白之间的直接作用关系。
体外下拉实验，即Pull-down实验，是一种行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
通过Pull-down实验可以用于鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质，以及2个已知蛋白质之间是否存在相互作用，但Pull-down的结果并不能真实地反应蛋白质之间的相互作用。
即不意味着在生理条件下一定能结合，因为在活体内它们在亚细胞空间上不一定能相遇。
需要结合Co-IP实验采用固定的抗体捕获互作蛋白，在体内生理条件下证明相互作用蛋白在亚细胞空间上的结合。
百泰派克生物科技针对样品蛋白的提取、表达和纯化的优化方案可确保获得高质量的诱饵和猎物蛋白，为客户提供优质的GST pull-down蛋白相互作用分析服务。
您只需要将您的需求和样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、蛋白互作实验、质谱分析、质谱原始数据分析。
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重要。
该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。
除了GST以外，类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+ 的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲蝶呤的色谱柱进行纯化等等。
Pull down实验一般用于体外转录或翻译体系，如酵母双杂交系统中检测蛋白质之间的相互作用。
但并不能真实的反应蛋白质之间的相互作用，因为在体内它们不一定空间上有碰到，所以并不意味着在生理条件下一定结合。
免疫共沉淀技术的基本原理是：在非变性条件下裂解细胞，蛋白质之间的相互作用还可以保持。
在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose微珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA），若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样的一种复合物：目的蛋白-兴趣蛋白-抗兴趣蛋白抗体-SPA/Agarose，因为SPA/Agarose比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。
经蛋白上样缓冲液变性煮沸，复合物四组分又被分开。
然后经WB试验，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。
这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。
免疫共沉淀既可以用于检测已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特
异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G-琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用WB鉴定。
免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。
但这种方法也有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。