酶催化拆分及合成重要手性中间体扁桃酸的研究进展

酶催化拆分及合成重要手性中间体扁桃酸的研究进展1
张国艳
吉林大学化学学院，长春（130026）
E-mail：gabrilla@
摘要：光学活性扁桃酸是市场潜力巨大的药物和精细化工中间体。

利用酶催化反应的底物、立体、位点和区域选择性，将化学合成的前体或外消旋衍生物转化为单一光学活性产物，反应条件温和、选择性强、副反应少、产率高、产品光学纯度高及无污染，较化工合成有明显的优势，因而开发酶催化反应已成为国际上研究的新热点。

本文结合国内外的研究，对用生物催化剂酶进行拆分及合成手性中间体扁桃酸的研究现状和发展趋势进行了论述。

关键词：生物催化剂；手性中间体；扁桃酸；酶；合成；拆分
中图分类号：O643.3，Q814.9 文献标识码：A
随着世界生物化工的快速发展，手性技术已成为当今有机化学的研究热点。

应用手性技术的最多的是制药领域，包括手性药物制剂，手性原料和手性中间体。

对手性药物而言，通常并非两种异构体均具有相同的药理特性，而药物的立体化学特性会影响其药效或产生毒性，因此直接合成光学纯的单一对映体或者对化学合成的消旋手性药物进行拆分，就显得十分重要。

扁桃酸，又称作苦杏仁酸或苯羟乙酸，主要用于医药工业，可以合成医药环扁桃酯、扁桃酸乌洛托品、扁桃酸苄酯等。

环扁桃酯是一种疗效显著的血管扩张剂；扁桃酸乌洛托品用于细菌性尿路感染杀菌剂消炎药物；扁桃酸苄酯是一种镇痉药物。

光学拆分所得到的右旋和左旋扁桃酸大部分用作光学拆分剂，在美国抗生素头孢孟多中大量使用。

随着应用研究不断深入，扁桃酸及其衍生物许多新的用途被开发出来，目前国际市场上扁桃酸需求约以年均10 ％左右速度增长，尤其是单一性化合物需求增长速度更快，成为热点的精细化工中间体。

生物催化的发展可以满足制药领域对于光学活性化合物的日益增长的需求，它可以降低化学原料的消耗、减少污染，是真正的绿色化学。

酶催化是生物催化中重要的工具之一，酶法转化、拆分、合成手性药物及精细化工品是现代酶工程的热点。

利用酶催化反应的底物、立体、位点和区域选择性，将化学合成的前体或外消旋衍生物转化为单一光学活性产物，反应条件温和、选择性强、副反应少、产率高、产品光学纯度高及无污染，较化工合成有明显的优势[1-3]。

作为一种特殊的催化剂，酶正越来越受到人们的重视。

下面以扁桃酸为例，重点介绍酶催化在手性中间体的拆分及合成方面的应用。

1. 外消旋扁桃酸的酶法拆分
化学方法合成得到的扁桃酸往往都是外消旋体，需要进一步进行拆分，才能得到光学纯的单一对映体。

化学拆分法主要是通过形成非对映体盐来进行，并且大多需要手性试剂，成本较高，不适合大规模的工业化生产。

外消旋扁桃酸的酶法拆分主要集中在用脂肪酶或腈酶来进行拆分，拆分的最高收率一般不超过50%。

为了将另一对映体转化为目的产物，需要进行消旋化和循环拆分，该方法相对复杂。

1.1 脂肪酶
脂肪酶来源丰富，价格较低，且稳定性好，因此在酶催化反应中用途很广，这一点也体
1本课题得到国家自然科学基金 (批准号: 20672045, 30570405) 和第三十八批国家博士后资助基金 (批准号: 801050321413)的资助。

现在外消旋扁桃酸的拆分上。

1.1.1 原位消旋化拆分法
CO2H
Four Sequences in One Pot
>98%e.e.
图 1 扁桃酸的原位消旋化连续拆分。

Fig. 1 Deracemization of mandelate via stepwise resolution-racemization 在这个反应中，扁桃酸的拆分由两步酶催化过程完成：(i) 乙烯乙酸酯作酰基供体，Pseudomonas species lipase (PSL) 催化酰基转移，进行动力学拆分；(ii) Pseudomonas putida ATCC 12633消旋酶催化消旋化，使未反应的R-扁桃酸在温和的条件下原位消旋化，省略了分离步骤，且对富集产物无影响，得到S-O-乙酰扁桃酸[4]。

此过程的优点在于产率高，光学纯度好，对映体选择性E>200，而且酶和酶的相容性好。

然而，消旋酶在(i-Pr)2O中的活性较低。

1.1.2 金属催化和酶催化的联合拆分
金属催化剂Brij®35/phosphate buffer/Bu2O的使用在某种程度上解决了上述难题,即利用醋酸铑络合物在乙烯乙酸酯/环己烷 (2:1) 混合溶剂中进行拆分，得到S-O-乙酰扁桃酸的收率为60%，光学纯度为98 %；如果用[Rh(COD)Cl]2在乙烯乙酸酯/二氯甲烷(3：1)混合溶剂中进行拆分，得到的收率是76 %，光学纯度为80 %。

然而，由于化学催化剂和酶的相容性较差，导致整个体系的稳定性降低，影响了这个反应的实际运行。

1.1.3 固定化拆分法
Lee S Y等借助一种膜外蛋白FadL将具有热稳定性的Bacillus sp. strain TG43脂肪酶固定化在大肠杆菌的细胞表面上，从而拆分外消旋扁桃酸甲酯。

经过36小时，得到的S-扁桃酸对映体过量值(e.e.)为99 %，对映体选择性(E)为292。

这个结果比用粗酶或交联的脂肪酶都要好 [5]。

Lee等认为在细胞固定化脂肪酶催化反应中，底物结构和酶源同样决定一个反应的反应性和选择性。

在这个实验中，固定化的脂肪酶优先选择S-扁桃酸酯作为底物，进一步说明固定化酶可以提高底物的反应性和选择性[6]。

3
CH3OH
+
(R,S)-Methyl mandelate
(S)-Mandelic acid(R)-Methyl mandelate 图2 利用整合在重组大肠杆菌XL10-Gold细胞上的FadLt-脂肪酶进行外消旋扁桃酸甲酯的拆分。

Fig. 2 Enantioselective resolution of racemic methyl mandelate by using lyophilized cells of recombinant E. coli
XL10-Gold displaying the FadLt-lipase fusion protein.
Palomo J M等利用表面吸附、共价吸附和离子吸附等固定化方法将来源自Candida rugosa中的脂肪酶固定化在不同载体上，通过对扁桃酸甲酯消旋体催化酯解，得到ee>99 %的S-扁桃酸[7]。

图3 假丝酵母脂肪酶的不同的固定化衍生物。

Fig. 3 Different immobilized derivatives of lipase from Candida rugosa .
1.1.4 嗜热酯酶拆分法
最近我们实验室利用在大肠杆菌中克隆表达嗜热酯酶APE1547基因而获得的嗜热酯酶进行外消旋扁桃酸酯的拆分，得到了R-扁桃酸，e.e.为99.9 %。

此法的优点是反应可以在较高的温度下进行，反应时间较短。

1.2 腈酶
腈酶具有对映体选择性，在腈的合成和降解中起着重要的作用[8-13]。

在短短的二年之内，腈酶从14种扩展到200多种，稳定性在不断提高，底物范围也逐渐拓宽。

有关腈酶在扁桃酸拆分上的研究主要有以下方面：
1.2.1 腈酶拆分法
以醋酸铵或L-谷氨酸为碳的来源，n-丁腈作引发剂所培养的Alcaligenes faecalis ATCC 8750含有选择性催化扁桃腈的腈酶，可以从外消旋的扁桃腈中得到R-扁桃酸，收率为91 %，光学纯度为100 %。

未反应的S-扁桃腈经过快速消旋化，可以作为底物继续参加反应[14]。

美国的Diversa 公司和德国的BASF 公司开发了一系列R-羟腈酶，利用动态动力学拆分方法来制备 R-扁桃酸，收率>95 %，光学纯度>95 %。

此法的优点是羟腈酶可以在温和的条件下催化羟腈水解得到相应的羧酸，而传统的化学水解法需要强酸或强碱及高温。

2H
2H （S ）-Mandelic Acid
图4 利用腈酶拆分外消旋扁桃酸。

Fig. 4 Reaction scheme for resolution of racemic mandelic acid by nitrilase. 1.2.2 S-羟腈酶有待进一步的开发
Robertson D E 研究小组开发的48种对腈具有活性的腈酶中，44种具有R -选择性，另外4种具有S -选择性。

以扁桃腈作底物，水解得到的扁桃酸对映体过量值分别为99 %和30 %[15]。

从中我们可以看出，开发的S-羟腈酶不仅种类较R-羟腈酶少，其酶促反应合成S-扁桃酸的光学纯度也较低。

2. 光学纯扁桃酸的酶法合成 生物合成是利用微生物或酶，如氧化还原酶、合成酶、裂解酶等直接从前体化合物不对称合成各种结构复杂的手性醇、酮、醛、胺、酸、脂、酰胺等衍生物，理论上可将前体化合物100 %转化为目的产物，且方法相对简单，高效。

因此研究开发新的酶和新的合成反应是发展手性生物合成的重点。

酶法合成光学纯扁桃酸的研究主要体现在以下几个方面：
2.1 羟腈酶不对称合成光学纯扁桃酸
O
HCN R H CO 2H +
（R ）-HNL （R ）-1（R ）-2
图 5 利用羟腈酶和醛合成(R)-α-羟基羧酸。

Fig. 5 Enantioselective synthesis of (R)-α-hydroxycarboxylic acid (R)-2 from aldehydes by the hydroxynitrile
lyase (HNL)
分布在蔷薇属植物的种子或杏仁和桃仁中的杏苷里含有羟腈酶(HNL)，羟腈酶对氰化物和醛或酮的反应具有立体选择性，所得到的手性氰纯在酸性条件下水解可以得到光学纯扁桃酸[16,17]。

这种方法在德国、美国和日本已完成工业化生产，所得到的手性扁桃酸作为手性药物中间体和光学拆分剂已进行销售。

厦门大学刘森林等在水/有机溶剂两相或微水相中研究了来源于不同杏仁的R-醇腈酶催化苯甲醛与HCN 不对称合成R-苯乙氰醇的反应。

结果表明，来源于苦杏仁的R-醇腈酶优于来源于甜杏仁的R-醇腈酶。

杏仁醇腈酶对芳香族、脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用，其中苯甲醛为杏仁醇腈酶的最适作用底物，在低温(0～5°C)下，转化率和产物对映体过量值均在99 %以上[18]。

2.2 C16耐热S-羟腈酶用于S-扁桃腈的不对称合成
中国科学院微生物研究所从植物中分离C16耐热S-羟腈酶基因，并将其转入大肠杆菌，构建高效表达基因工程菌。

在优化的培养条件下，表达蛋白为细胞总蛋白的48%，其中可溶性酶占7%，细胞破碎后酶活力为2.27 U/ml ，经简单分离得粗酶液，比活达到22.0 U/ml 蛋白质。

C16耐热S-羟腈酶用于两相系统的S-扁桃腈的不对称合成，转化率为98 %，产物ee 值达97 %以上。

S-扁桃腈水解就可得到单一对映体S-扁桃酸。

国内关于羟腈酶的研究还只是刚起步，主要表现在对羟腈酶的克隆、表达及其初步应用上[19,20]。

从以上扁桃酸单一对映体的酶法合成方法研究中，我们可以看到国内外R-扁桃酸的研究较多，并且已经商业化，而S-扁桃酸的研究较少，相应药品的药理和毒理作用研究得更少，有待重点研究和开发。

3. 扁桃酸衍生物邻氯扁桃酸的酶法研究
光学活性的R-邻氯扁桃酸是抗忧郁症和血小板凝结抑制剂的新药Clopidogrel 制备过程中的重要手性中间体，因此, 制备具有光学活性的R-邻氯扁桃酸很有意义。

HNL 催化的R-邻氯扁桃酸的合成路线如下[21]:
HCl
图 6 羟腈酶催化合成(R)-邻氯扁桃酸。

Fig. 6 HNL-catalyzed synthesis of (R)-o-chloromandelic acid
此方法将来源于樱桃仁 (PaHNL)的R-羟腈同工酶有效地超表达并使之含有一个分泌信号。

在明确了三维结构后，通过合理的突变，得到的变体活性提高了六倍。

和野生的酶相比，用这种酶合成的R-邻氯扁桃酸反应性能得到了改善，产物对映体过量值明显提高（>83 %）。

这种方法和形成非对映异构体进行外消旋体拆分法及酶的酰基化、去酰基化和转酯化法相比，它的最大优点是理论产率可达100 %。

4. 总结与展望
纵观近年来扁桃酸的酶法拆分到酶法合成的研究，我们可以看到酶在手性中间体的拆分和合成上具有巨大的潜力和应用价值；而S–扁桃酸的合成，已成为国际上研究的新热点。

另一方面，我们也应看到我国在在光学纯的扁桃酸单一对映体合成方面和国际上还存在差距，目前还未能实现规模化生产。

利用微生物酶源、以基因工程和蛋白质工程改造和构建新酶，已成为国内从事酶学与酶工程领域科研工作者的首要任务。

参考文献
[1] Illias R M, Sinclair R, Robertson D, et al. L-Mandelate dehydrogenase from Rhodotorula graminis [J]. Biochem J, 1998, 333: 107-115.
[2] Adama W, Lazarus M, Schmerder A, et al. Synthesis of optically active a-hydroxy acids by kinetic resolution through lipase-catalyzed enantioselective acetylation [J]. Eur J Org Chem,1998, 2013-2018.
[3]张国艳, 曹淑桂. 酶法手性拆分技术研究与应用的最新进展[J]. 吉林大学学报: 理学版, 2008, 46 (5): 997-1000.
[4] Huerta F F, Minidis A B E and Bäckvall J-E. Dynamic kinetic resolution and related processes in enzyme and metal catalysis [J]. Chem Soc Rev, 2001, 30: 321–331.
[5]Lalonde J J, Navia M A, and Margolin A L. Cross-linked enzyme crystals of lipases as catalysts for kinetic resolution of acids and alcohols [J]. Meth Enzymol, 1997, 286:443-464.
[6] Lee S H, Choi J-I, Park S J, et al. Display of Bacterial Lipase on the Escherichia coli Cell Surface by Using FadL as an Anchoring Motif and Use of the Enzyme in Enantioselective Biocatalysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70 (9): 5074–5080.
[7]Palomo J.M., Fernandez-Lorente G., Mateo C.,et al. Modulation of the enantioselectivity of lipases via controlled immobilization and medium engineering: hydrolytic resolution of mandelic acid esters [J]. Enzyme Microb Technol, 2002, 31(6): 775-783.
[8]Vasik-Racki D, Jonas M, Wandrey C, et al. Continuous (R)-mandelic acid production in an enzyme membrane reactor [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 1989, 31: 215-222.
[9]Kakeya H, Sakai N, Sugai T, et al. Microbial hydrolysis as a potent method for the preparation of optically active nitriles, amides and carboxylic acids [J]. Tetrahed Lett, 1991, 32:1343–1346.
[10]Klempier N, De Raadt A, Faber K, et al. Selective transformation of nitriles into amides and carboxylic acids by an immobilized nitrilase [J]. Tetrahed Lett, 1991, 32: 341–344.
[11]Effenberger F. Synthesis and reaction of optically active cyanohydrins [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 1994, 33 (15): 1555-1565.
[12]Brenner C. Catalysis in the nitrilase superfamily [J]. Curr Opin Struct Biol, 2002, 12:775–782.
[13]DeSantis G, Zhu Z, Greenberg W A, et al. An enzyme library approach to biocatalysis: development of nitrilases for enantioselective production of carboxylic acid derivatives [J]. J Am Chem Soc, 2002, 124: 9024-9025.
[14]Yamamoto K, Oishi K, Fujimatsu I, et al. Production of R-(-)-mandelic acid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750 [J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(10): 3028–3032.
[15]Robertson D E, Chaplin J A, DeSantis G, et al.Exploring Nitrilase Sequence Space for Enantioselective Catalysis [J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70 (4): 2429–2436.
[16]Glieder A., Weis R., Skranc W., et prehensive step-by-step engineering of an (R)-hydroxynitrile lyase
for large-scale asymmetric synthesis [J]. Angew. Chem Int Ed, 2003, 42 (39): 4815 -4818.
[17]Effenberger F., Förster S., Wajant H., Hydroxynitrile lyases in stereoselective catalysis [J]. Curr Opin Biotechnol, 2000, 11(6): 532–539.
[18]刘森林, 宗敏华, 邢苗, 等. 有机溶剂中( R)-醇腈酶催化不对称合成( R)-苯乙醇腈[J].催化学报, 2003, 24: 7-10.
[19]程树华, 严共鸿, 吴襟, 等. 木薯α-羟腈酶的克隆、表达及其初步应用[J]. 生物工程学报, 2001, 17 (1): 78.
[20]王丹, 李维, 万洁, 等. 木薯HNL cdna在甲醇酵母中的高效表达[J]. 应用与环境生物学报, 2004,10 (4): 428-431.
[21] Glieder A, Weis R, Skranc W, et al. Comprehensive step by step engineering of a (R)-hydroxynitrile lyase for large scale asymmetric synthesis [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2003, 42: 4815-4818.
Progress in the Resolution and Synthesis of Chiral
Intermediate Mandelic Acid by Enzyme
Zhang Guoyan
College of Chemistry, Jilin University, Changchun (130026)
Abstract
Optically pure active mandelic acid is an important chiral building block for the production of pharmaceuticals. Recent research has focused on exploring enzyme-catalyzed reaction to produce optically pure active mandelic acids. Compared with chemical catalysts, enzymes are remarkable catalysts with wide substrate specificities, high stereoselectivity, high regioselectivity, mild reaction conditions and low pollution. The study on the recent advances and future development of resolution and synthesis of chiral intermediate mandelic acid by enzyme has been discussed here.
Keywords: Biocatalyst; Chiral Intermediate; Mandelic Acid; Enzyme; Synthesis; Resolution。