白细胞介素_24对破骨细胞功能及分化的影响_王鑫

像分析系统（ Image-Pro Plus） 。 试剂： alpha 基础培养基（ α-MEM） 粉剂（ 美国） ； 胎
牛血清（ Gibco 公司，美国） ； 青霉素-链霉素（ PAA，德 国） ； TＲAP 染色试剂盒（ Sigma-aldrich 公司，美国） ； 腺 病毒 载 体 AdCMV-EGFP 及 AdCMV-IL-24 （ 由 美 国 NIH 郑长玉研究员合作构建［3］） ； ＲNA 提取试剂盒（ 北 京宝生生物技术公司） ； Ｒeal-time PCＲ 试剂盒（ 北京 天根 生 物 公 司） ； 小 鼠 单 核 / 巨 噬 细 胞 系 ＲAW264． 7 （ ATCC 号： TIB-71，Ameriean Type Culture Collection） ； IL-1β 蛋白、TNF-α 蛋白（ Ｒ＆D，美国） 。
【Abstract】Objective： To study the effect of IL-24 on the differentiation and function of osteoclasts． Methods： Mature osteoclasts were isolated from long bones of neonate rats． Optimal multiplicity of infection（ MOI） of AdCMV-EGFP was determined． Then osteoclasts and ＲAW264． 7 cells were transfected with AdCMV-EGFP and AdCMV-IL-24 respectively． The function of osteoblasts was studied by the observation of bone resorption lacunae，the differentiation of ＲAW264． 7 cells was evaluated by the expression of osteoclast related genes examined with real-time PCＲ． Ｒesults： Osteoclasts were TＲAP positive with more than 2 neclei． MOI = 400 was suitable for AdCMV-EGFP transfection． The resorption lacunae area in AdCMV-IL24 transfected cells was larger than that in AdCMVEGFP transfected cells（ P ＜ 0． 05） ． Ｒeal-time PCＲ showed that under induced conditions，osteoclastic related genes NFATc1，CTSK and TＲAP were changed in ＲAW264． 7 cells transfected with AdCMV-IL-24． Conclusion： IL-24 may promote the differentiation and function of osteoclasts．
【关键词】 破骨细胞； ＲAW264． 7 细胞系； 骨吸收； 白细胞介素 24
The effects of IL-24 on the differentiation and function of osteoclasts WANG Xin1 ，SHI Ce2 ，ZHENG Ｒong1 ，LIU Xuan1 ，SUN Hongchen2 ，WU Lipeng1 ． 1． 154000，College of Stomato-logy，Jiamusi源自文库University，China； 2． College of Stomatology，Jilin University，Changchun
基金项目： 国家自然科学基金面上项目（ 编号： 81271111） 作者单位： 154000，佳木斯大学口腔医学院（ 王鑫 郑嵘
鹏） ； 吉林大学口腔医学院（ 史册 孙宏晨） 通讯作者： 吴立鹏 E-mail： WLPKQ@ sina． com
刘璇
吴立
和深入。IL-24 做为一个重要的免疫因子，在癌症、银 屑病和伤口愈合等方面都有所研究，但是其对骨系统 的影响和机制还没有明确的报道。有研究发现在伴有 骨吸收的牙周病中 IL-24 的表达升高［2］，但是其对破 骨细胞的影响以及相应的机制尚未发现报道。为了研 究 IL-24 对破骨细胞的影响以期进一步探讨免疫系统 与骨系统之间的相互关系，本实验创新的在破骨细胞 中转入免疫因子 IL-24，检测其对破骨细胞的影响，以 期进一步揭开免疫系统对骨系统的影响。
在倒置显微镜下，可见破骨细胞体积较大，容易与 其他细胞区分，有的呈摊蛋状，有的呈香肠状，有的形 态不规则，有伪足（ 图 1） 。
图 1 分离培养的破骨细胞 （ 倒置显微镜，× 100） Fig 1 Osteoclasts in culture （ Inverted microscope，× 100）
培养在骨片上的细胞，于实验第 7 天使用三蒸水 冲洗，超声震荡 2 min × 2 次，使用摄像显微镜拍摄骨 吸收陷窝照片（ 图 4） ，然后使用 Image-Pro Plus 软件测 量骨吸收陷窝的面积（ 表 1） 。
所得实验数据经 SPSS 17． 0 软件分析，发现空白 组与阴性对照组没有差异（ P ＞ 0． 05） ，阴性对照组与
1 材料与方法
1． 1 材料和仪器 仪器： 硬组织锯片机（ 上海华岩仪器设备有限公
司） ； 数控超声波清洗器（ 昆山市超声仪器有限公司） ； 荧光倒置相差显微镜（ Olympus 公司 IX51，日本） ； 图
实用口腔医学杂志（ J Pract Stomatol） 2014 Jul，30（ 4）
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2． 2 特异性 TＲAP 染色鉴定破骨细胞 破骨细胞分离培养 1 d 后，进行 TＲAP 染色，光镜
下可见破骨细胞及其前体细胞胞质紫红色（ 图 2） 。 2． 3 MOI 值测定
当 MOI ＞ 400 时，细胞大量死亡。结合转染效率 和细胞死亡率，选取 400 为最适宜 MOI 值（ 图 3） 。 2． 4 IL-24 对破骨细胞功能的影响
动物： 出生 24 h 的 Wistar 大鼠，雌雄不限（ 购自 吉林大学实验动物中心） 。
材料： 骨片 1 cm × 1 cm； 盖玻片。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 骨片和玻片的制备 成年牛股骨（ 市售） ，取 骨皮质，切成 1 cm × 1 cm 大小，硬组织锯片机切成薄 片，砂纸打磨至厚度约 50 μm，超声中清洗 20 min × 3 次，75% 酒精浸泡，自然晾干，超净台中紫外灯双面照 射，无菌保存，备用［4］。盖玻片（ 24 mm × 24 mm） ，泡 酸过夜，清洗，干燥，高压灭菌。 1． 2． 2 破骨细胞的分离［5］ 取出生 24 h 的 Wistar 大鼠长骨，在 4 ℃ α-MEM 中纵剖，从骨髓腔内壁开始 层层刮取，将长骨刮至粉末状。用吹管吹打，将破骨细 胞从骨渣中震荡出来，接入预先置入盖玻片的 6 孔板 中。37 ℃ 孵育 1 h 后，使用无血清培养基清洗 3 次，每 孔加入有血清培养基 1 ml。 1． 2． 3 抗酒石酸酸性磷酸酶（ TＲAP） 染色 在细胞 转染 5 d 后，固定液固定 30 s，去离子水冲洗 3 次，按 照试剂盒的步骤进行 TＲAP 染色，37 ℃ 避光孵育 1 h， 去离子水洗，并苏木精复染，碱性自来水冲洗返蓝，晾 干，封片。 1． 2． 4 感染复数（ MOI 值） 测定 使用无血清培养基 冲洗 3 次，每孔加入无血清培养基 400 μl，计算细胞 数，然后按照 MOI = 200、400、600、800、1 000，分别 转入 AdCMV-EGFP。转染 4 h 后换有血清培养基。在 转染后的 48 h 使用倒置荧光显微镜观察 EGFP 在细 胞中的表达。转染效率 = 表达荧光细胞数 /光镜下细 胞总数 × 100% 。 1． 2． 5 骨吸收陷窝检测 放置骨片组，在细胞转染 7 d 后，将骨片取出并使用 PBS 浸泡，超声震荡 2 次，每 次 2 min。显微镜下观察骨吸收陷窝，拍照。然后使用 image-Pro-Plus 软件测量骨吸收陷窝面积。 1． 2． 6 Ｒeal-time PCＲ 分析 ＲAW264． 7 细胞以 1． 2 × 106 接种到 6 孔板，按照 1． 2． 4 所得 MOI 值分别转
染 AdCMV-EGFP （ EGFP 组 ） 、AdCMV-IL-24 （ IL-24 组） 。分 别 于 2、4 和 6 d 提 取 细 胞 总 ＲNA，逆 转 录 （ ＲT） 合成 cDNA 后进行荧光定量 real-time PCＲ 反应。 real-time PCＲ 所用引物： β-actin，CTSK，NFATc1。 1． 2． 7 统计学分析 实验所得数据采用 SPSS 17． 0 统计软件分析，两组间比较用配对 t 检验，以 P ＜ 0． 05 为有统计学差异，以 P ＜ 0． 01 为有显著统计学差异。 2结果 2． 1 破骨细胞形态学观察
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实验组相比具有统计学差异（ P ＜ 0． 05） 。
实用口腔医学杂志（ J Pract Stomatol） 2014 Jul，30（ 4）
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白细胞介素-24 对破骨细胞功能及分化的影响
王鑫 史册 郑嵘 刘璇 孙宏晨 吴立鹏
【摘要】 目的： 研究白细胞介素-24（ interleukin-24，IL-24） 对破骨细胞分化及功能的影响。方法： 从新生 24 h 内大鼠四肢长 骨分离鉴定破骨细胞； 确定 AdCMV-EGFP 的最佳感染复数（ MOI） ，分别转染 AdCMV-EGFP 和 AdCMV-IL-24，培养在骨片上， 测定骨吸收陷窝的面积； real-time PCＲ 方法检测在诱导条件下 ＲAW264． 7 细胞转染 AdCMV-IL-24 后，破骨细胞相关因子的 表达。结果： 破骨细胞胞内可见 2 个以上的细胞核，TＲAP 染色呈紫红色； MOI = 400 为最佳转染效率； 转染 AdCMV-IL24 的 破骨细胞骨吸收陷窝面积比转染 AdCMV-EGFP 的细胞大（ P ＜ 0． 05） ； 在诱导条件下 ＲAW264． 7 细胞转染 IL-24 后，破骨细 胞的相关基因 NFATc1、CTSK 和 TＲAP 表达发生变化。结论： IL-24 能促进破骨细胞的分化，提高破骨细胞的骨吸收功能。
【Key words】 Osteoclasts； ＲAW264． 7 cell line； Bone resorption； Interleukin-24 中图分类号： Ｒ392 文献标志码： A doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 3733． 2014． 04． 02
骨稳态主要由成骨细胞（ osteoblast，OB） 的骨形 成和破骨细胞（ osteoclast，OC） 的骨吸收之间的平衡调 节。当机体发生炎症时，会有大量炎症因子表达，例如 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等，其中一些因子会直接或 间接影响成骨细胞和 / 或破骨细胞，导致骨重塑平衡被 打破。例如，在类风湿性关节炎、骨质疏松、牙周炎等 疾病中，都存在过度的骨吸收。基于这种骨系统和免 疫系统之间的相互作用，Arron 等［1］在 2000 年提出骨 免疫学的概念，免疫失调会导致骨代谢异常。关于免 疫系统和骨系统的关联是当今研究的热点，但是对其 间的相互作用机制以及相关联因子的了解还不够全面